Anayasa Mahkemesi İptal Kararı Yargılamanın Yenilenmesi Sebebi Olarak

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Anexo 2

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Anexo 3

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Anexo 4

Expressão de proteínas recombinantes

Bactérias Escherichia coli cepa DH5α (Promega) competentes foram utilizadas para realizar a propagação dos vetores recombinantes. Para a expressão utilizou-se E. coli competentes cepa BL21 (Promega). Bactéria BL21 com vetor recombinante foram isoladas por meio de LB ágar (para 1 L: 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 % de ágar bacteriológico) em placas de cultivo, contendo 100 µg/mL de amplicilina. As colônias foram selecionadas na placa e foram mantidas sob crescimento utilizando-se o meio de cultivo LB líquido (para 1 L: 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura. 10 g de NaCl) contendo 100µg/mL de ampicilina. Para crescimento das bactérias em meio de cultivo, as mesmas foram mantidas sob constante agitação a 200 rpm a 37ºC durante 16 horas. Após este período, 1 mL do meio de cultivos contendo bactérias BL21 recombinantes foram inseridos em um novo meio LB sob as mesmas condições de agitação e temperatura e monitoradas através de espectrofotometria (leitura da A600) e a

DO na faixa de 0,5 a 1,0 foi considerada ótima para indução por meio de IPTG. As seguintes condições foram padronizadas para indução de expressão das proteínas recombinantes: temperatura 30ºC; concentração de indutor de expressão (IPTG) 1mM (rK39 e FRA) e CRA 0,5 mM; tempo de incubação das bactérias 16 horas. Após o término do período 1 mL de cada cultura foi centrifugado (16.000 g, 2 minutos) e o

pellet ressuspendido em 100 µL de Tampão de amostra SDS 1x (12 mM Tris-HCl pH

6,8; 5% Glicerol; 0,4% Sódio Dodecil-Sulfato; 2,88 mM de 2-Mercaptoetanol e 0,02% Azul de Bromofenol), aquecido a 100°C por 5 minutos, e em seguida mantido em gelo. As bactérias induzidas foram avaliadas através da SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate

Poliacrylamide Gel Electrophoresis) com gel de separação de 12,5% e coloração com

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Anexo 5

Preparo das bactérias expressas para lise

Após a indução de expressão (Anexo 4), as culturas foram submetidas à lise para determinar se as proteínas de interesse encontravam-se na fração solúvel ou insolúvel. As células bacterianas foram centrifugadas a 5000 x g durante 15 minutos a 4ºC, lavadas três vezes em solução de PBS e ressuspendidas em tampão de lise (20mmol/L de fosfato de sódio pH 7,4; 0,5 mol/L de NaCl e 0,5 mg/mL de lizosima) a 1:10 do volume da cultura. Posteriormente, a bactéria foi submetida a um novo processo de lise por ultrassom de acordo com o seguinte ciclo: 40% de amplificação a 4ºC por 30 segundos (6 vezes) . Em seguida, centrifugada a 10.000 x g por 30 segundos a 4ºC. A fração solúvel (sobrenadante) foi separada e a fração insolúvel (pellet) foi ressuspendida em 20 mmol/L de fosfato de sódio pH 7,4, 0,5 mol/L de NaCl e 8 mol/L de uréia) e sendo adicionado um pool de inibidores de proteases (Sigma FAST™ Protease Inhibidotor Cocktail – Sigma Aldrich®) na etapas de lavagem, lise e armazenamento das amostras lisadas. A análise das frações foi realizada pela SDS-PAGE verificando-se na fração solúvel bandas do mesmo peso molecular esperado ao das proteínas rK39, CRA e FRA. Posteriormente, foi realizado preparo das amostras para purificação, conforme descrito no Anexo 6.

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Anexo 6

Purificação por cromatografia

Utilizou-se o sistema de cromatografia em coluna HisTrap™ HP (GE Healthcare Life Science), as quais separam as proteínas de interesse por cromatografia de afinidade por quelante de metal imobilizado (níquel), que tem afinidade pela “cauda” de histidina presente na proteína de fusão. A purificação foi realizada utilizando como solução de ligação e lavagem o tampão fosfato (20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl e 20 mM de imidazol; pH 7,4) com auxílio de bomba peristáltica. As frações coletadas foram filtradas com filtro de 0,22 µm e lavadas em tampão fosfato. Para a eluição das proteínas de interesse, foi realizado um aumento gradual das concentrações de imidazol, partindo-se de uma concentração inicial de 20 mM utilizando-se o tampão fostato nas concentraç~eos de 20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl; pH 7,4 e aumentando-se a proporção do imidazol em 10% a cada 3 mL, até uma concentração final de 500 mM, conforme recomendação do fabricante. Os testes iniciais demonstraram maior eficiência na concentração de 500 mM. As frações eluidas foram coletadas em alíquotas de aproximadamente 1 ml e analisadas por espectrofotometria (NanoDrop 1000- Thermo Scientific). A todas as frações eluídas coletadas foram adicionados inibidores de proteases (Sigma FAST™ Protease Inhibidotor Cocktail – Sigma Aldrich®) e posteriormente as alíquotas foram submetidas a técnica de SDS-PAGE. E as frações em que haviam as proteínas purificadas de interesse foram misturadas em um único tubo (para cada proteína expressa separadamente) e dosadas através do método BCA.

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Anexo 7

Testes de antigenicidade: ELISA indireto com emprego de proteínas recombinantes

Os ensaios foram realizados separadamente para cada proteína recombinante. Os procedimentos para estes testes seguiram o seguinte protocolo: antígeno rK39 de L.

infantum ou CRA e FRA para T. cruzi 100 ng/poço, diluídos em Tampão Carbonato-

Bicarbonato (TCB ; pH 9,6 - 100 µL/poço) e incubados “overnigth” em placa Maxisorp (Nunc®). Posteriormente, foram lavados cinco vezes com 0,05% de Tween 20 solução tampão de PBS (PBS-T ; pH 7,4). Os poços serão bloqueados com leite em pó desnatado (LPD) a 10% diluído em TCB. Na fase seguinte foi testado soros controles de cães positivos e negativos para LVC para rK39 e, para doença de Chagas, foram utilizadas amostras de pacientes humanos reagentes e não reagentes na diluição de 1:100 para todas amostras. Os conjugados foram testados nas diluições 1/600 de anti IgG de cão ligado à peroxidase (Sigma Aldrich®) e anti IgG de humano (1:64000 - Sigma Aldrich®). O substrato utilizado foi o Tampão Citrato-Acetato pH 9,6; H2O2 a

30% e o cromógeno TMB (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzedine, Sigma Aldrich®) diluído na concentração de 10 mg/mL em DMSO (Dimetil Sufóxido, Sigma Aldrich®). Para cada etapa deste ensaio o período de incubação foi de uma hora a 37ºC e, em todas essas passagens os poços, lavados cinco vezes em lavadora automática de ELISA Elx50, Bio- Tek (Intruments, Inc, Winooski, Vermont). A densidade óptica (OD) foi medida em 450 nm, utilizando-se o leitor, modelo automático Multiscan Ex Labsystems (Flow laboratories International AS).

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Anexo 8