A ionização por MALDI foi descrita por Tanaka em 1987 e desde então aplicada para macromoléculas, sendo principalmente utilizada por Karas e Hillenkamp (1988). O MALDI possui características muito importantes que o fazem uma fonte de ionização importante na caracterização de proteínas como a alta sensibilidade (amostras em baixíssima concentração e quantidade podem ser analisadas por esta técnica) e tolerância a contaminação das amostras com sais, tampões, detergentes etc (STUMP, 2002 e CHEN, 1998).
É de fundamental importância para a ionização por MALDI a escolha da matriz e a preparação da amostra. A matriz é caracterizada por ser uma pequena molécula orgânica que possui uma grande absorção de energia no comprimento de onda do laser utilizado (Tabela 02). O primeiro passo é a preparação de uma mistura de matriz e amostra em placas especiais (Figura 07) que, após completamente secas, serão inseridas no equipamento e mantidas sob vácuo.
Tabela 02 – Algumas matrizes comuns na utilização de MALDI e suas abreviações.
Molécula Matriz Abreviação
Proteínas e Peptídeos
Ácido α-Ciano-4-hidroxicinamico CHCA
Ácido 2,5-Dihidroxibenzoico DHB
Ácido 3,5-Dimetoxi-4-hidroxicinamico
(sinapinico) SA
Oligonucleotideos Trihidroxiacetofenona Ácido 3-Hidroxipicolinico THAP HPA
Carboidratos
Ácido 2,5-Dihidroxibenzoico DHB
Ácido α-Ciano-4-hidroxicinamico CHCA
Moléculas Orgânicas Moléculas Inorgânicas
Lipidios
Figura 07 –Placa utilizada na
A matriz quase se diminuindo a possibilida sensibilidade da técnica. será irradiada por um la mecanismo pelo qual o elucidado, porém post aquecimento do cristal quantidade de energia n aquecimento causa a su superfície cristalina e ex intacto na pluma em exp
Ácido sintético Trans-3-indoleacrilico Polymeros de Ditranol Ácido 2,5-Dihidroxibenzoico Ácido 2,5-Dihidroxibenzoico Trans-2-(3-(4-tert-Butilfenil)-2metil-2- propeniliedeno)malononitrila Ditranol
a ionização das amostra através de MALDI
sempre é colocada em proporções maiore dade de formação de clusters da amostr
a. Dentro da fonte e sob vácuo, a mistura laser pulsado durante um determinado p l os íons são formados no MALDI não
stula-se que a irradiação pelo laser al formado pela matriz pela acumulaçã na fase condensada pela excitação da sublimação dos cristais da matriz, ablação
expansão da matriz para a fase gasosa pansão (DREISEWERD, 2003). IAA DIT DHB DHB DCTB DIT
res do que a amostra, stra e aumentando a a de matriz e amostra período de tempo. O ão é completamente r induz um rápido ção de uma grande a matriz. Este rápido ão de uma porção da sa, levando o analito
Figura 08 – Ilustração esquem A ionização pod também não é totalment formação dos íons env dessorção ou a transfer moléculas da matriz foto acelerados por um KNOCHENMUSS,1998 e
A utilização de um laser justifica o motivo branda. A partir do mom matriz, a amostra pode estrutura covalente. E co tamanho do analito, am espectro gerado pelo M (espectro monocarregad (HOFFMAN, 2007).
emática da ionização por MALDI. Adaptado de Rof de ocorrer durante qualquer momento, p nte conhecido. A teoria mais aceita é de q nvolve a transferência de prótons na fa erência na fase gasosa na pluma em ex otoionizada. Os íons formados e na fase
campo eletrostático para o analis e KNOCHENMUSS & ZENOBI, 2003). (F uma matriz que absorve energia no comp o desta técnica ser chamada de uma té
mento que a maior parte da energia do las erá passar para a fase gasosa sem so como o processo do MALDI independe da mostras de alta massa molecular podem
MALDI geralmente mostra o analito com ado) devido às propriedades de ioni
offman, 2007.
porém este processo que o mecanismo de fase sólida antes da expansão a partir de se gasosa são então lisador (ZENOBI &
Figura 08)
primento de onda do técnica de ionização laser é absorvida pela sofrer danos em sua a absorptividade e do m ser analisadas. O om uma única carga nização do método.
1.4.2 – Ionização po
Ionizar amostras se apresentou inicialmen massa trabalha em alto v bombeamento diferenc intermediário são utiliza conhecidos como cones devem ser grandes o su a fim de aumentar a sens o vácuo intermediário e diferentes pressões até c
A ionização por el teorizada desde 1968 po para análise de proteín análise de moléculas com
Figura 09 – Ilustração esquem demonstra a diferença de pre 2007.
Na ionização por volátil e bombeada atrav a 1mL/min. Uma alta vo
por electrospray
s em pressão atmosférica para um espec ente como um dilema, tendo em vista que o vácuo. Este problema foi solucionado ad
ncial. Normalmente dois compartime zados. Os compartimentos estão conect es, que possuem orifícios muito peque uficiente para permitir a entrada de quant nsibilidade, porém deve ser pequeno o su e o vácuo do analisador. A amostra
chegar ao detector (Figura 09) (HOFFMA electrospray (ESI), desenvolvida por Fenn por Denn é um método de ionização bra ínas e diversas moléculas polares e pos om menos de 100 Da até maiores de 1.00
emática da ionização por Eletrospray em uma fonte ressão nas diferentes partes do equipamento. Ada
or eletrospray, a amostra é dissolvida em avés de um capilar de aço inoxidável em u voltagem é aplicada a ponta do capilarar
ectrômetro de massa e o espectrômetro de adotando sistemas de entos com vácuo ctados por aparatos, enos. Estes orifícios ntos íons for possível suficiente para manter a então passará por
AN, 2007).
nn em 1988, porém já rando, muito utilizado ossui capacidade de 00.000 Da. te clássica. A Figura aptado de HOFFMAN, m um solvente polar e um fluxo de 1µL/min ar (3 a 4 kV) e como
consequência desse alto em forma de aerossol co por um fluxo de gás nebu auxilia o direcionamento do solvente (HOFFMAN, À medida que tamanho, a repulsão ele altíssima. Nesse mecan modo que gotas conte diminuição da gota tam cargas (limite de Raylei (Figura 10) (CANTU et.al
Figura 10 – Processo de ioniz
Moléculas grand de íons multicarregados cavalo, uma proteína de multicarregados é uma v do detector e possibilita analisadores com um lim
lto campo elétrico, a amostra sai da ponta com gotas altamente carregadas. Esse p bulizador (geralmente nitrogênio) por fora to do spray para o espectrômetro de mas
, 2007).
o solvente é evaporado e as gotas eletrostática entre as moléculas carregad
nismo vão ocorrendo sucessivas explosõ tendo apenas um íon são formadas. mbém faz com que a tensão superficial leigh) e induz a transferência dos íons p .al, 2008).
ização por eletrospray. Adaptado de CANTU et.al,
des com vários sítios de ionização irão p os, como pode ser observado no espectr e 16952 Da (Figura 11). A obtenção de u vantagem tendo em vista que há um gan ta a análise de moléculas com alta mass
limite baixo de massa nominal, tendo em
ta do capilar dispersa processo é auxiliado a do capilar. Este gás assa e a evaporação
s vão diminuindo de adas vai se tornando sões coulômbicas de . Paralelo a isso a al não suporte tantas para a fase gasosa
al, 2008
produzir um espectro tro da mioglobina de um espectro de íons anho na sensibilidade ssa molecular usando em vista que o valor
mensurado por um espe (HOFFMAN, 2007).
Figura 11 – Espectro multicar massa molecular calculada pa
1.5 – Analisadores
Após a produção de acordo com suas ma antes, o que é mensura (m/z) para cada íon e e tipos de fontes de ioniza (HOFFMAN, 2007).
Cada analisado divididos em duas grand tipo varredura que trans escala de tempo. O ana composto pelos analisad o analisador por tempo d
pectrômetro de massa não é a massa e
arregado da Mioglobina de cavalo demonstrando a para essa proteína é de 16.952 Da.
ão de um íon na fase gasosa, estes prec assas, que deverá ser determinada. Na r rado na espectrometria de massa é a re esta é a função dos analisadores. Assim
ação, há também diversos tipos de analis
or possui suas vantagens e limitações ndes classes baseados em suas propried nsmitem os íons de diferente m/z suces
nalisador do tipo quadrupolo é um exem adores que transmitem simultaneamente
de vôo (Time of Flight – ToF) (HOFFMAN
e sim a relação m/z
o a distribuição de íons. A
ecisam ser separados realidade, como dito relação massa carga im como há diversos lisadores (Tabela 03).
es. Eles podem ser edades. Analisadores essivamente em uma mplo. Outro grupo é e todos os íons como
Tabela 03 – Principais tipos de analisadores de massa disponíveis nos espectrômetros de massa comerciais.
Tipo de Analisador Símbolo Princípio da Separação
Setor Elétrico E ou ESA Energia cinética
Setor magnético B Momentum
Quadrupolo Q m/z (Estabilidade da trajetória)
Ion Trap IT m/z (freqüência de ressonância)
Tempo de Vôo ToF Velocidade
Transformada de Fourier /
ressonância de íons cyclotron FTICR m/z (freqüência de ressonância) Transformada de Fourier
Orbitrap FT-OT m/z (freqüência de ressonância)
1.5.1 – Analisador Quadrupolo
Um analisador quadrupolo é composto por quatro barras circulares ou preferencialmente, hiperbólicas colocadas perfeitamente paralelas (FERGUSON, 1965; KIENITZ, 1968). Um íon positivo que adentra no espaço entre as barras irá se dirigir em direção a uma barra carregada negativamente. Se o potencial da barra for alterado antes que o íon colida com a mesma, este terá sua direção alterada. Este é o princípio básico de funcionamento de um quadrupolo e foi descrito por Paul e Steinwegen em 1953.
1.5.2 – Analisador ToF
Apesar do conceito do analisador por tempo de vôo ter sido descrito por Stephens em 1946, este só foi desenvolvido em 1955 por Wiley e McLaren, responsáveis pelo primeiro espectrômetro de massa comercial com ToF. Basicamente, o analisador ToF consiste na separação de íons já acelerados a partir das suas velocidades em um tubo sob alto vácuo chamado tudo de vôo.
Os analisadores ToF podem existir de forma linear, onde os íons acelerados são detectados logo após percorrer o tubo de vôo. Essa técnica apresenta uma baixa resolução a partir do momento que íons da mesma espécie molecular com a mesma m/z podem adquirir energia cinética diferente ao serem acelerados e então serão detectados como íons diferentes. Para resolver este problema foi criado o Refletor, que consiste em “lentes magnéticas” que corrigem a trajetória dos íons (Figura 08). No refletor, os íons com mesma m/z e com energia cinética maior
percorrem um caminho um caminho menor, corri
Devido a essa ca deve ser enviado de mo que o analisador ToF tiv MALDI. Porém para exp fontes de ionização que desenvolvido o mecani posicionado transversal pulsada com uma freq utilização de fontes de io
Figura 12 – Funcionamento energia cinética durante a ion levarão para percorrer será re de maior m/z.
1.6 – Detectores
O detector é o com que foi analisado em um partir dos íons inciden abundância. O primeiro identificada pela localiza relativa detectada pela obsoleto. O detector ma multiplicador de elétrons
o maior enquanto os com menor energia rrigindo assim essa falha.
característica de análise por tempo de vô odo pulsado para o analisador. Esta ca tivesse sua ascensão juntamente com a xplorar o potencial deste analisador junt e têm a formação contínua de íons com nismo de Aceleração Ortogonal, onde al ao feixe de íons e estes então são a qüência fixa para o tubo de vôo, pos ionização continuas com esse analisador.
o de um analisador Tempo de Vôo linear. As mo ionização irão migrar numa região livre de campo
relativo à sua m/z. Os íons em verde são de me
omponente do espectrômetro de massa q um sinal detectável. Os detectores são c entes uma corrente elétrica que é p iro detector utilizado foi uma placa foto lização dos pontos formados na fotogra a intensidade dos pontos. Hoje este mét
ais utilizado nos espectrômetros de ma (HOFFMAN, 2007).
ia cinética percorrem
vôo, o pacote de íons aracterística fez com a fonte de ionização ntamente com outras mo o Electrospray foi e o tubo de vôo é acelerados de forma ossibilitando assim a
oléculas que receberam po elétrico e o tempo que enor m/z e os em laranja
que transforma o íon capazes de gerar a proporcional a sua tográfica. A m/z era rafia e a abundância étodo de detecção é assa comerciais é o