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Os marcadores genéticos são características de herança simples que permitem a determinação do genótipo do indivíduo, fornecendo informações importantes para a análise genética de uma espécie. Para a comparação entre populações, os marcadores devem ser neutros para a adaptação e sobrevivência do animal, preferencialmente codominantes e estáveis ao longo do desenvolvimento.

Os primeiros marcadores disponíveis foram as mutações que produziam alterações morfológicas como, por exemplo, o nanismo, a ausência de asas em Drosophila e a ausência de pelos em camundongos. Entretanto, tais mutações são pouco freqüentes nas populações

naturais, nas quais a maior parte da variação genética é de caráter contínuo, e freqüentemente comprometem a adaptação do indivíduo (Tanksley, 1993).

A partir da década de 30, o polimorfismo de antígenos eritrocitários passou a ser investigado, fornecendo uma nova classe de marcadores para o estudo de populações em animais. A análise de marcadores foi ampliada com o desenvolvimento de técnicas de eletroforese de proteínas associadas a métodos de coloração histoquímica (Hunter & Market, 1957) que permitiram que a variação genética das isoenzimas passasse a ser estudada. Esses marcadores têm sido intensamente utilizados para investigar a estrutura das populações, elucidando questões como fluxo gênico em populações naturais, dispersão e filogenia. Apesar disso, apenas uma parte da variação genética pode ser observada, aquela originada em mutações que resultam em alteração detectável do produto gênico. Além disso, as isoenzimas podem sofrer influência do ambiente, e podem sofrer variações de acordo com a idade e o tecido utilizado.

Essa limitação foi superada com o desenvolvimento das técnicas de análise de DNA, como o uso de marcadores RFLP, RAPD e microssatélites, esse último discutido a seguir.

2.7.1. Marcadores Microssatélites

Os organismos eucariotos e parte dos procariotos e eubacterias apresentam seqüências simples de DNA repetitivo distribuídas ao longo do genoma. Essas seqüências, denominadas microssatélites ou seqüências simples repetidas (SSR – Simple Sequence Repeats) são caracterizadas por repetições em tandem de um mono, di ou trinucleotideo, inseridas em regiões de seqüência única. Cada segmento de repetições é geralmente menor que 100 pares de bases de nucleotídeo (Tautz, 1989).

O polimorfismo dos marcadores microssatélites baseia-se na variação do número de repetições, resultante provavelmente de erros da DNA polimerase durante a replicação do DNA.

Os microssatélites foram os principais marcadores a serem beneficiados pela utilização da técnica da PCR (Polimerase Chain Reaction, ou reação em cadeia da polimerase)(Schlotterer, 2004) .A PCR para a análise desses marcadores representa uma importante redução no tempo despendido para a identificação dos genótipos, além de permitir a identificação do genótipo de embriões. Esse fato, aliado ao intenso polimorfismo, pequena quantidade de DNA necessária para as reações, facilidade no isolamento, baixo custo de genotipagem dos indivíduos e alta abundância no genoma eucarioto fizeram dos microssatélites um dos mais vantajosos marcadores disponíveis atualmente (Schlotterer, 2004) e bastante adequados para a construção de mapas genéticos e identificação de locos que controlam caracteres quantitativos (QTL), principalmente em espécies onde o número de progênies é limitado (Massey & Georges, 1992). Até o momento, já foram identificados e isolados aproximadamente 5.600 locos marcadores no genoma bovino (Itoh et al., 2005), permitindo o mapeamento fino desse material genético em busca de genes que potencialmente contribuem para a variação genética de uma característica.

2.8. Detecção de QTL

QTL (do inglês Quantitative Trait Loci, loco de característica quantitativa) é uma região do genoma que influencia uma característica fenotípica mensurável ou quantitativa (Jansen, 2003). Características quantitativas são multifatoriais e influenciadas por vários genes polimórficos e pelas condições ambientais.

Em alguns trabalhos sobre QTL em animais de criações próprias para fins comerciais, é comum encontrarmos o termo ETL (Economic Trait Loci, loco de característica econômica),

pois nesses animais geralmente são estudadas características de importância econômica (Lahav et al., 2006).

A determinação de ligação genética entre o loco marcador o QTL depende da existência de desequilíbrio entre os alelos no loco marcador e alelos do QTL. Esse desequilíbrio gera efeitos quantitativos associados ao marcador que podem ser detectados e estimados através de análise estatística. O sucesso desses experimentos pode também ser atribuído ao desenvolvimento de métodos estatísticos e delineamentos genéticos adequados (Weller et al., 1990). Em bovinos de leite, a disponibilidade de grandes famílias de touros também tem contribuído para maior avanço no mapeamento de QTL para características de produção. Como a avaliação genética de um touro é feita pela produção das suas filhas, há disponibilidade de grandes famílias com informação fenotípica, o que permite a utilização de delineamentos de filhas ou de netas do touro.

No delineamento de filhas (daugther design), a progênie do touro de elevado mérito genético, heterozigoto no loco marcador, é genotipada e separada em grupos de acordo com o alelo alternativo herdado do pai. O mérito genético das filhas e filhos é estimado. Uma diferença significativa nas medidas fenotípicas entre cada grupo de alelo alternativo significa a detecção de um potencial QTL. No delineamento de netas (grandaugther design), os filhos de um touro heterozigoto para o marcador são genotipados. As medidas fenotípicas são realizadas nos produtos desses touros (netos). O mérito genético dos filhos é estimado através de medidas dos netos e netas, e depois utilizados em testes de associação com o marcador (Machado, 2002).

A capacidade de detectar um QTL é uma função da magnitude do seu efeito sobre a característica, do tamanho da população segregante avaliada, da freqüência de recombinação entre o marcador e o QTL, bem como da herdabilidade da característica. Quanto maior o

efeito, o tamanho da população e a herdabilidade, e mais próximo o marcador do QTL, mais fácil será a detecção (Ferreita & Grattapaglia, 1998).

Sax (1923)1(citado por Darvasi et al., 1993) foi o primeiro a mostrar que um loco de característica quantitativa poderia ser associado com locos marcadores em linhagens endogâmicas. Desde então, diversas metodologias foram desenvolvidas para a detecção dos mais diversos QTL (Knott e Haley, 2000), principalmente em plantéis comerciais de animais (Davis e DeNise, 1998).

O desenvolvimento de mapas genéticos para os bovinos (Bishop et al., 1994; Barendse

et al., 1994; Barendse et al., 1997; Ihara et al., 2004; Itoh et al., 2005) tem contribuído muito

para a identificação de locos que controlam características quantitativas de importância econômica (do inglês QTL – Quantitative Trait Loci). Segundo MacNeil e Grosz (2002), a descoberta desses QTL tem o potencial de aumentar significativamente o ganho genético desses animais através da implementação de programas de seleção assistida por marcadores (do inglês, MAS – Marker Assisted Selection). Quando tratamos com características difíceis ou economicamente custosas de serem avaliadas, que possuem baixa herdabilidade, expressão tardia ou que apenas possam ser mensuradas após o abate do animal, a seleção assistida por marcadores pode aumentar substancialmente a taxa de resposta da seleção, quando comparada à seleção praticada apenas através do melhoramento animal tradicional (Davis e DeNise, 1998). O uso de MAS pode também contribuir para a quebra de correlações genéticas indesejáveis entre características sob seleção artificial (Grosz e MacNeil, 2001). Por exemplo, estimativas de correlação genética entre peso ao nascimento do animal, e peso adulto do mesmo, giram em torno de 0,5 (Kootz et al., 1994), e o resultado de selecionarmos animais mais precoces é a tendência de aumentar a média do peso ao nascimento dos animais da população sob seleção com um todo, aumentando a incidência e severidade das complicações

1 _{SAX, K. Association of size differences with seed-coat pattern and pigmentation in Phaseolus vulgaris.}

de parto. O oposto também é válido, ou seja, selecionar animais mais leves ao nascer leva à formação de uma população de adultos menos pesados, o que não é financeiramente desejável pelos produtores. Portanto, a identificação de regiões cromossômicas que controlem peso ao nascimento sem afetar o peso adulto do indivíduo seria de grande importância para a manipulação/predição das taxas de ganho de peso desses animais.

Atualmente, existem diversos trabalhos que descrevem a presença de QTL para peso ao nascimento e características de crescimento no cromossomo cinco dos bovinos (Stone et al 1999, Casas et al. 2000, Casas et al. 2001, Casas et al. 2003, Casas et al. 2004, Li et al. 2004, Stone et al. 2005). Além disso, nesse cromossomo localiza-se o gene que codifica INF- e também contém, nos bovinos, uma região homóloga ao cromossomo três de ovinos, no qual foram encontrados QTLs associados à resistência a Trichostrongylus columbriformis (Beh et

al., 2002). Já no cromossomo sete dos bovinos estão presentes os genes que codificam as

interleucinas 3, 4, 5 e 12.

Apesar de não haver trabalhos na literatura descrevendo QTL para resistência à ectoparasitas em bovinos, Martinez et al. (2006) verificaram associação significativa (P < 0,05) entre alelos de marcadores microssatélites BoLA-DRB3.2 e contagem de carrapatos

R.microplus em estudos com esta mesma população experimental. Miyata (2006), ao estudar

essa mesma população F2, detectou a presença de um QTL significativo (P < 0,01) no

cromossomo 14 para resistência ao carrapato R.microplus. Maillard et al. (2003), utilizando haplótipos de marcadores classe II BoLA-DBR3-DQB, reduziram a prevalência de dermatofilose (doença causada pela bactéria Dermatophilus congolensis, a qual está associada ao carrapato Amblyomma variegatum) de 0,76 para 0,02, em 5 anos de seleção assistida por marcadores, em uma população de gado Brahman na Martinica.

QTL para resistência à endoparasitas são mais encontrados em estudos com ovinos (Beh

microssatélite do cromossomo seis dos bovinos está associado com diferenças quanto à susceptibilidade dos bovinos aos nematóides gastrintestinais ao realizar estudos de associação em uma população de bovinos mestiços B. p. taurus x B. p. indicus. Essa região do QTL havia sido previamente identificada por Gasbarre et al. (2002), em uma população de bovinos da raça Aberden Angus.

3. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi mapear QTLs para características de crescimento e de resistência a ectoparasitas e endoparasitas por meio da varredura dos cromossomos cinco e sete dos bovinos, utilizando marcadores microssatélites em uma população F2 Holandês x Gir.

4. Metodologia

4.1. Delineamento experimental

Os animais experimentais da geração F2 foram produzidos dos cruzamentos entre

animais F1 mestiços Holandês x Gir, na Fazenda Santa Mônica (Vassouras, RJ), pertencente à

Embrapa. Para isto foram utilizadas 28 fêmeas Gir (em trabalho de superovulação e transferência de embriões) que foram inseminadas com sêmen de quatro touros da raça Holandesa. Estes acasalamentos foram repetidos com a finalidade de se obter cerca de 150 F1

(Figura 7). Destes 150 indivíduos F1 (machos e fêmeas), apenas cinco machos foram

escolhidos com base no vigor para serem pais da nova geração. As fêmeas F1 foram

acasaladas com cada um dos cinco touros, para constituírem cinco famílias, evitando-se o parentesco entre o reprodutor e as fêmeas a ele designadas. Ao final do projeto, cada uma das famílias deve produzir, por meio da superovulação e transferência de embriões, cerca de 100 animais F2. No total serão obtidos cerca de 400 indivíduos F2 (Figura 8), ou seja, cerca de 100

Figura 7 – O cruzamento dos parentais da raça holandesa (acima à esquerda) acasalados com fêmeas Gir (acima à direita) deu origem à geração F1, os quais apresentam grande homogeneidade

fenotípica (imagens cedidas pelo Prof Dr. Marcos Vinícius G.B. Silva)

Figura 8 – Animais F1 (mais acima) cruzados para dar origem à geração F2, a qual demonstra alta