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Progressos consideráveis foram feitos no entendimento dos mecanismos moleculares de tumores esporádicos baseado em estudos de síndromes genéticas raras associadas com carcinoma adrenocortical e estudos de perfil genético desses tumores. Alterações genéticas, tais como ganhos ou perdas cromossômicas completas ou parciais, foram identificadas utilizando hibridização genômica comparativa ou marcadores de microssatélite. Perdas cromossômicas nas regiões 1p, 17p, 22p, 22q, 2q e 11q foram determinadas por hibridização genômica comparativa em até 62% dos pacientes com carcinoma adrenocortical esporádico32, enquanto que marcadores de microssatélite revelaram uma alta prevalência de perda de heterozigosidade ou desbalanço nos cromossomos 11q13 (≥ 90%), 17p13 (≥ 85%) e 2p16 (92%) em pacientes com essa doença22,34. Esses dados demonstram que há uma ampla e quase constante perturbação genética nesses tumores. Muitos desses genes correspondem a oncogenes ou genes supressores tumorais. Além disso, algumas das alterações genéticas são relevantes não somente do ponto de vista da patogênese, mas também possuem potencial valor diagnóstico, terapêutico e prognóstico, como, por exemplo, no caso do IGF-2 e do SF-1.

A sinalização da via IGF é envolvida tanto no desenvolvimento como na manutenção de funções adrenocorticais diferenciadas. Um papel fisiopatológico desta via de sinalização já foi bem documentada em TACs34. O gene IGF-2, localizado no cromossomo 11p15, codifica um fator de crescimento fetal que é expresso exclusivamente do alelo paterno herdado, em virtude de imprinting materno35. Defeitos genéticos ou epigenéticos na região de imprinting do 11p15 podem aumentar a expressão do IGF-2, como ocorre em pacientes portadores da síndrome de Beckwith- Wiedemann, que apresentam macrossomia, organomegalia e predisposição ao desenvolvimento de múltiplos tumores, incluindo carcinoma adrenocortical36. A hiperexpressão do RNAm do IGF-2 é observada na maioria dos carcinomas adrenocorticais37-39. Ela ocorre principalmente por perda do alelo materno e duplicação do alelo paterno, conhecida como isodissomia paterna, ou, menos frequentemente, por perda do imprinting materno38. O efeito de crescimento parácrino e autócrino do IGF-2 é mediado pelo IGF-1R40. A ativação do IGF-1R via IGF-2 tem um papel fundamental na tumorigênese de forma geral, proliferação e disseminação de vários cânceres41. A análise de loco 11p15 nos TACs é útil, visto que a perda de heterozigosidade do 11p15 é significativamente mais frequente em carcinomas do que em adenomas adrenocorticais (78,5% versus 9,5%) e está associada como maior risco de recorrência tumoral34. Em contraste com os TACs em adultos, os transcritos do IGF-2 são hiperexpressos em ambos os adenomas e carcinomas adrenocorticais pediátricos39. Além disso, a hiperexpressão do IGF-1R foi demonstrada em TACs pediátricos clinicamente malignos39. Interessantemente, demonstrou-se que um inibidor seletivo de IGF-1R quinase possui atividade antitumoral in vitro39. A inibição do IGF-1R levou a bloqueio da proliferação celular de uma forma dose e tempo-dependente, por meio de

aumento significativo de apoptose tanto em células NCIH295 como em uma linhagem celular de TAC pediátrico. Um outro estudo em camundongos demonstrou que a inibição do IGF-1R também levava a redução tumoral in vivo, sendo a magnitude de supressão amplificada pelo uso combinado de mitotane42.

Alterações genéticas da via de sinalização Wnt, que inicialmente foram identificadas em pacientes com polipose adenomatose familiar, já foram demonstradas em uma série de outros cânceres humanos43. A via de sinalização Wnt encontra-se ativa durante o desenvolvimento embrionário normal, sendo a β- catenina um componente chave dessa via. A ativação constitutiva da β-catenina é a alteração mais frequente em TACs benignos e malignos44,45. Em um subgrupo desses tumores, mutações somáticas do gene da β-catenina (CTNNB1) inativam o sítio de fosforilação da glicogênio sintase quinase 3β44

. A sinalização da via Wnt se correlaciona com a concentração intracelular de β-catenina. Em um modelo de camundongo transgênico, a ativação constitutiva da β-catenina induziu hiperplasia adrenal e promoveu desenvolvimento de câncer adrenocortical46. Um estudo franco-alemão envolvendo 79 adultos com carcinoma adrenocortical revelou que pacientes que tinham mutação do gene CTNNB1 (prevalência de 18%) e/ou expressão anômala de β-catenina (expressão nuclear) apresentavam estadiamento tumoral mais avançado (ENSAT III ou IV), escore de Weiss mais elevado, maior frequência de necrose e mitoses, além de estarem significativamente associados com diminuição de sobrevida global e livre de doença47. Outro estudo, envolvendo um centro de referência nos Estados Unidos e outro no Brasil, mostrou prevalência semelhante de mutação do CTNNB1 em adultos com carcinoma adrenocortical (23%), e a expressão anômala de β-catenina, definida por imunorreatividade

citoplasmática ou nuclear, também foi significativamente associada com desfecho desfavorável48. Nesse estudo, não houve diferença significativa entre adenomas e carcinomas quanto à frequência de expressão anômala de β-catenina (24% versus 30%) ou mutação do CTNNB1 (22% versus 23%), sugerindo que a via Wnt exerce papel-chave, mas que provavelmente múltiplas outras alterações são necessárias nos mecanismos de tumorigênese adrenocortical e agressividade tumoral. Pesquisadores de outro centro especializado brasileiro demonstraram que a prevalência de mutação do CTNNB1 foi significativamente menor nos TACs pediátricos quando comparados aos adultos (6% versus 32%), mas também se correlacionou com prognóstico desfavorável na população pediátrica49.

O SF-1 é um membro órfão da família de receptores nucleares de fatores de transcrição e desempenha um importante papel em funções endócrinas, incluindo regulação de hidroxilases esteroidais, desenvolvimento e função do córtex adrenal e diferenciação sexual masculina50-52. Estudos prévios demonstraram hiperexpressão do SF-1 na maioria dos casos pediátricos53,54, mas também em muitos dos TACs em adultos54,55. Além disso, a maior expressão de SF-1 leva ao aumento da proliferação de células adrenocorticais humanas in vitro e induzem tumorigênese em camundongos56,57. Em conformidade com esses dados, a proliferação de células adrenocorticais estimuladas por SF-1 foi inibida in vitro por agonistas inversos de SF-158. Digno de nota, aumento da expressão proteica do SF-1 foi significativamente associado com desfecho desfavorável em uma coorte bastante expressiva de adultos55. Em contraste com as crianças54, os adultos com carcinoma adrenocortical e imunorreatividade forte para o SF-1 apresentaram diminuição significativa de sobrevida global e livre de doença55.

Mutações germinativas no gene TP53, localizado no cromossomo 17p13, estão presentes em 70% das famílias com a síndrome de Li-Fraumeni. Esta síndrome confere susceptibilidade ao carcinoma de mama, sarcoma de tecidos moles, tumores cerebrais, osteosarcoma, leucemia e carcinoma adrenocortical59. Esses tumores tem uma apresentação precoce e afetam principalmente crianças e adultos jovens. Mutações germinativas no TP53 foram observadas em 50-86% das crianças com carcinoma adrenocortical aparentemente esporádico6,49,60 e, apenas em cerca de 4% a 7,5% em adultos61,62, embora, em nosso meio, essa prevalência definitivamente é maior que a média mundial, variando entre 13% a 28%, considerando apenas mutações do códon R337H6,48. Em adultos, mutações somáticas do TP53 são vistas em 20% a 35% dos casos de carcinoma adrenocortical esporádico63-65 e podem estar associadas com tumores mais avançados e agressivos65. A perda de heterozigosidade no loco 17p13 foi reportada mais frequentemente em pacientes com carcinomas do que em adenomas adrenocorticais (85% versus 30%) e é um preditor independente de recorrência após remoção cirúrgica completa de tumores localizados34.

Por meio de estudos de expressão gênica de larga escala, conhecidos como análise de transcriptoma, foi demonstrado que o perfil de expressão gênica de TACs benignos diferem significativamente dos carcinomas adrenocorticais66,67, o que sugere que esse tipo de análise pode oferecer novas ferramentas diagnósticas. A análise do transcriptoma de TACs confirmou que o IGF-2 é o gene mais hiperexpresso nos carcinomas adrenocorticais quando comparados a adenomas ou a glândula adrenal normal66. Além disso, esses achados foram confirmados por outra análise de microarray, que também revelou ativação frequente de genes-alvo da via de sinalização do Wnt em carcinomas adrenocorticais67. Um outro estudo

envolvendo 34 carcinomas adrenocorticais mostrou que a diferença na expressão dos genes BUB1B e PINK1 foi o preditor mais significativo de redução de sobrevida global68. Ademais, análises independentes levaram a classificação de dois grupos distintos de carcinomas adrenocorticais, com prognóstico bom ou ruim, indicando que a análise do transcriptoma poderá também revelar novos fatores prognósticos68,69. Uma metanálise de estudos de expressão gênica por microarray e hibridização genômica comparativa revelou três principais vias patogênicas na tumorigênese adrenocortical: primeiro, danos do ciclo celular; segundo, alteração na sinalização do ácido retinoico; e terceiro, alteração na apresentação antigênica e do sistema complemento70.

Na última década, novos protagonistas conhecidos como microRNAs (miRNAs), que possuem papel fundamental na regulação da expressão gênica global, tem sido amplamente estudados visando melhor entendimento da patogênese de uma série de doenças. Os miRNAs constituem uma classe de pequenos RNAs não- codificáveis capazes de reprimir a expressão de determinados genes alvo, ao ligarem- se à sequências complementares existentes na região 3’ não-traduzível do RNA mensageiro (RNAm)71. Eles formam uma importante classe de reguladores que participam de inúmeras funções biológicas, incluindo desenvolvimento, proliferação celular, diferenciação e apoptose (Figura 1).

Onde: Pri-miRNA - transcrito primário de miRNA; Pre-miRNA - molécula precursora de miRNA; dsRNA - RNA de dupla hélice; siRNA - pequeno RNA de interferência. RISC - complexo silenciador induzido por ribossomo; ORF - fase de leitura aberta.

Figura 1 - miRNAs são pequenos RNAs não-codificáveis com cerca de 20-25 nucleotídeos que desempenham um importante papel na regulação da expressão gênica. Eles são expressos no núcleo como qualquer outro gene. O transcrito primário (Pri-miRNA) é clivado no núcleo pela enzima Drosha, dando origem à molécula precursora de miRNA (Pré-miRNA). O Pré-miRNA é exportado ao citoplasma pela proteína Exportina 5, onde sofre processamento pela enzima Dicer para formar o miRNA maduro, que então interage com o RISC e se liga à sequência complementar de RNAm alvos, finalmente levando a bloqueio da expressão proteica, por meio de repressão translacional ou clivagem do RNAm [Adaptado de He e Hannon72]

O estudo dos miRNAs em diversas neoplasias humanas trouxe à tona novos entendimentos sobre o papel dessas moléculas na iniciação e na progressão tumoral. O perfil de expressão de miRNAs em diversos tumores humanos tem permitido a identificação de assinaturas associadas a diagnóstico, estadiamento, progressão, prognóstico e resposta ao tratamento. Recentemente, vários estudos de perfil de expressão de miRNAs demonstraram o potencial de diferenciação entre adenomas e carcinomas adrenocorticais, estratificação de risco e prognóstico73-76. Seis estudos até o momento focaram em perfil de expressão de miRNA em TACs em adultos (Quadro 1)74,75,77-80.

Quadro 1 - Resumo dos principais estudos que avaliaram perfil de expressão de microRNAs em TACs de adultos

Estudo Tumores miRNAs desregulados Achados principais

Patterson et al.74 26 adenomas / 10 carcinomas / 21 córtex normais

mir-483-5p, mir-195,

mir-125b, mir-100

Hiperexpressão do mir-483-5p foi capaz de diagnosticar carcinomas. O mir-483-5p e IGF-2 foram coexpressos Soon et al.75 27 adenomas / 22

carcinomas / 6 córtex normais

mir-195, mir-335, mir-7 Níveis elevados do mir-483-5p

e níveis reduzidos do mir-195 foram preditores de pior sobrevida global Tömböl et al.77 8 adenomas / 4

carcinomas / 4 córtex normais

mir-184, mir-210, mir-503,

mir-214, mir-511

Diferença entre ΔCt mir-511 e ΔCt mir-503 foi capaz de diferenciar carcinomas de adenomas

Schmitz et al.78 9 adenomas / 4 carcinomas / 4 córtex normais

mir-675, mir-335 Hipoexpressão do mir-675 e/ou

do mir-335 é associada a malignidade

Özata et al.79 26 adenomas / 22 carcinomas / 10 córtex normais

mir-483-3p, mir-483-5p, mir-210, mir-21, mir-1974,

mir-195, mir-497

Hipoexpressão do mir-483-3p e hiperexpressão do mir-195 e mir-497 induziram apoptose in vitro

Chabre et al.80 16 adenomas / 30 carcinomas

mir-483-5p, mir-195,

mir-335

Níveis circulantes elevados do mir-483-5p ou níveis reduzidos do mir-195 foram preditores de diminuição de sobrevida global e livre de doença

*miRNAs em negrito são hiperexpressos e os regulares hipoexpressos em carcinomas comparados a adenomas

Esses estudos revelaram que diversos miRNAs são diferencialmente expressos em carcinomas adrenocorticais quando comparados a adenomas, sendo a hiperexpressão do mir-483-5p o achado mais consistente74,75,79,80. Curiosamente, o gene codificador deste miRNA localiza-se dentro do loco do IGF-2, um gene que é hiperexpresso em carcinomas adrenocorticais de forma consistente67. Além disso, os níveis de expressão do mir-483-5p correlacionam-se positivamente com a expressão do IGF-2. MiRNAs com expressão diminuída em carcinomas adrenocorticais também já foram identificados como, por exemplo, o mir-195 e o mir-33574,75,78-80. Embora a relevância desses miRNAs, especialmente do mir-483-5p, para o diagnóstico dos TACs, comparados com a patologia convencional ou outros marcadores moleculares, ainda precisa ser

determinada, eles podem, no mínimo, ter um valor diagnóstico potencial. O resultado de dois estudos sugerem que níveis de expressão de miRNAs selecionados podem identificar subtipos de câncer associados com diferentes sobrevidas em pacientes com carcinoma adrenocortical75,79. Análises de agrupamento utilizando perfil de expressão de miRNA obtido por microarray foi capaz de distinguir três subgrupos de tumores, cada um associado a taxas de sobrevida diferentes79. Além disso, a análise de expressão por RT-PCR no tecido tumoral mostrou que níveis aumentados do mir-483-5p e níveis reduzidos do mir-195 foram associados com aumento da mortalidade75. Em uma recente publicação, Chabre et al. avaliaram se o perfil de miRNAs séricos circulantes poderia fornecer algum valor prognóstico80. Seus resultados mostraram uma associação importante dos níveis de expressão do mir-483-5p e do mir-195 em amostras de soro de pacientes com fenótipo agressivo de carcinoma adrenocortical e que apresentaram alta taxa de mortalidade. O mir-195 mostrou-se o melhor biomarcador na distinção entre TACs benignos e malignos, enquanto que o mir-483-5p foi capaz de diferenciar tumores recorrentes de tumores não recorrentes. Esses achados são de extremo interesse no que diz respeito à utilidade do rastreio de pacientes utilizando a dosagem sérica desses miRNAs. Dois outros estudos que avaliaram níveis de miRNAs séricos em pacientes portadores de TACs mostraram, de forma consistente, que o mir-483-5p encontra-se hiperexpresso nos carcinomas quando comparados a adenomas81,82. Até o momento, apenas um único trabalho avaliou o perfil de expressão de miRNAs na população pediátrica. Doghman et al.76 analisaram 25 TACs pediátricos e cinco amostras de tecido adrenocortical normal pareados pela idade. O mir-483-3p mostrou-se elevado tanto em TACs benignos como em malignos, o que é consistente com o achado de que o IGF-2 encontra-se hiperexpresso em TACs pediátricos independente do comportamento clínico

e agressividade39. O mir-99a e do mir-100 estavam entre os miRNAs menos expressos nos TACs pediátricos em comparação ao tecido adrenocortical normal76. Esses autores verificaram ainda que a hipoexpressão do mir-100, em uma linhagem celular de carcinoma adrenocortical, promoveu um aumento significativo da expressão do IGF-1R, sugerindo ser este um dos mecanismos que explicam a hiperexpressão do IGF-1R nos TACs pediátricos.

Um importante estudo recente envolvendo uma força-tarefa de múltiplos centros europeus realizou uma análise genômica integrada de 45 pacientes com carcinoma adrenocortical, por meio de técnicas de larga escala, incluindo sequenciamento exômico paralelo, SNP array, análise de metilação de DNA, arrays de expressão de RNAm e sequenciamento de miRNA83. Alterações recorrentes foram encontradas em vários genes já sabidamente envolvidos na tumorigênese adrenocortical (CTNNB1, TP53, CDKN2A, RB1 e MEN1), mas também em outros não previamente reportados (ZNRF3, DAXX, TERT e MED12). Os novos genes identificados foram validados em uma coorte independente de 77 carcinomas adrenocorticais. O ZNRF3, que codifica uma ligase ubiquitina E3 de superfície celular, foi o gene mais frequentemente alterado (21%), constituindo um potencial novo gene supressor tumoral relacionado à via da β-catenina. A análise genômica integrada permitiu, ainda, a identificação de dois subgrupos moleculares distintos com evoluções opostas. O grupo C1A, de pior prognóstico, apresentou inúmeras mutações e alterações de metilação de DNA, enquanto que o grupo C1B, de boa evolução clínica, apresentou desregulação específica de dois clusters de miRNA. Esses autores concluem, portanto, que carcinomas adrenocorticais agressivos e indolentes correspondem a duas entidades moleculares distintas dirigidas por diferentes alterações oncogênicas.