Döner Sermayeli İşletmelerin Karları

Charles R. Long

Texas A&M University, College of Veterinary Medicine, College Station, Texas, USA 77843-4466

Introdução

A produção de embriões de bovinos in vitro, através da maturação, fecundação e cultivo se tornou uma valiosa tecnologia de reprodução assistida em sistemas de criação de gado. É freqüentemente utilizada para manejar gado com baixa fertilidade, mas está se tornando um método de escolha para ampliar o uso de sêmen raro e/ou caro ou para o uso mais eficiente de pequenas quantidades de sêmen tais como com espermatozóides sexados por gênero. Mesmo com as notáveis inovações nos sistemas de produção in vitro, duas das maiores frustrações com embriões produzidos in vitro (PIV) são os baixos índices de prenhez pós-transferência e a maior sensibilidade à criopreservação. A Associação Americana de Transferência de Embriões comunicou em 2005 que o índice médio de prenhez para embriões transferidos, coletados in vivo, foi de 62%, enquanto que o índice de gestação após transferência para os embriões produzidos e fertilizados in vitro foi de 43% (AETA, 2005).

À medida que o embrião cresce e se desenvolve, o blastocisto precisa eclodir ou escapar da zona pelúcida (ZP) que envolve a massa celular, permitindo que o embrião se implante na parede uterina para o desenvolvimento subseqüente. Dois mecanismos trabalham para liberar o embrião da proteção da ZP. Lise da ZP iniciada por digestão com enzimas proteolíticas e aumento da pressão hidrostática dentro do embrião exercida na ZP causada pela expansão da cavidade da blastocele (Flechon, 1978). A falha do embrião em eclodir após fecundação in vitro e subsequente transferência pode ser uma das razões para o menor índice de prenhez observado nesses embriões (Drobnis, 1988; Gonzales, 1995; Vajta, 1997).

A falha na eclosão pode ser decorrente de uma variedade de fatores, sendo um deles o endurecimento da ZP. O endurecimento da zona em embriões humanos tem sido relacionado com múltiplos fatores, mas primariamente é associado com níveis elevados de FSH e idade materna avançada (Cohen, 1992; Loret de Mola, 1997; Meldrum, 1998). Em embriões de camundongos, uma condição de cultivo subótima é atribuída a esse efeito endurecedor (Dokras, 1991). A eclosão assistida é baseada na criação de aberturas artificiais na zona pelúcida para promover a eclosão in vitro. A eclosão assistida pode ser obtida quimicamente com uma solução tyrode ácida ou digestão enzimática com pronase ou mecanicamente pela dissecção parcial da ZP com uma pipeta de vidro, perfuração da ZP com piezo- micromanipulador e perfuração da ZP com um laser de diodo (Balaban, 2002; Cohen, 1992).

Cada um dos métodos tem limitações e vantagens. A dissolução química da ZP pode diminuir o número de blastômeros intactos após a eclosão e ter efeito negativo no índice de prenhez quando comparado com assistência mecânica (Joris, 2003; Lanzendorf, 2007). A dissecção mecânica, juntamente com a perfuração da ZP com o piezo, requer habilidades técnicas para micromanipulação e consome bastante tempo, levando a um período de tempo danoso fora da incubadora ou ambiente uterino. Um método eficiente e confiável para repetidamente cortar a ZP é através do uso de um microscópio montado com laser de diodo.

A eclosão assistida a laser (EAL) tem várias vantagens sobre as outras técnicas pois o feixe de laser está focado através da objetiva de um microscópio padrão para permitir uma microperfuração fácil, rápida, com alta reprodutibilidade (Makrakis, 2006). O laser infravermelho viaja na direção oposta da luz visível e atinge um alvo de uma maneira similar à iluminação fluorescente. O diâmetro do feixe é de geralmente 4,5-5, sendo menor que a espessura média da ZP de 14-16 µm (Tadir et al., 2007). O tamanho da abertura criada na ZP pode ser regulada variando-se o poder do laser e a duração do pulso aplicado (Blake et al., 2001; Mantoudis et al., 2001). A área da ZP em torno do feixe focal do laser é afetada pela condução de calor e interação térmica. Então, é extremamente importante monitorar a intensidade e o comprimento do pulso em cada configuração de laser e cada ambiente laboratorial para evitar danos na massa celular saudável (Douglas-Hamilton and Conia, 2001). O procedimento todo de EAL pode ser feito em placas plásticas convencionais ou mesmo canudos plásticos com meio convencional e não requer equipamento de micromanipulação adicional.

A eclosão assistida a laser (EAL), uma técnica que usa um micro-feixe a laser para quebrar a zona pelúcia (ZP) de embriões produzidos in vivo ou in vitro, tem várias aplicações e tem sido efetivamente aplicada para: melhora dos índices de eclosão na FIV em camundongos (Neev et al., 1995; Tinney et al., 2005), bovinos (Schmoll et al., 2003) e humanos (Balaban et al., 2006); melhora dos índices de implantação e prenhez em bovinos (Menges

Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s311-s318, 2008.

ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online)

et al., 2008). A eclosão assistida a laser provou ser benéfica para a produção de embriões humanos in vitro e para aumentar os índices de gestação clínica e índices de implantação (Edi-Osagie et al., 2003; Meldrum, 1998; Seif, 2006 ). Todavia, a EAL pode não ser benéfica em todos os casos de falhas de implantação repetidas (Tucker et al., 1996) e baixos índices de gestação devido à qualidade sub ótima do embrião não podem ser melhoradas (Grace, 2007). Se há um potencial benefício para a eclosão assistida em modelos in vitro em camundongos e humanos, questiona-se então se procedimentos de fecundação in vitro em bovinos também poderiam se beneficiar desta prática. Este experimento foi delineado para testar a hipótese de que a eclosão assistida a laser pode melhorar o índice de prenhez após a produção in vitro de embriões bovinos. O primeiro experimento determinou as configurações corretas para o laser e o tempo apropriado do método para produzir ótimo desenvolvimento embrionário in vitro. O segundo experimento analisou os índices de prenhez após a eclosão assistida a laser num programa comercial de produção de embriões in vitro. Juntos esses dados sugerem que a eclosão assistida poderia aumentar a porcentagem de embriões produzidos in vitro capazes de iniciar uma prenhez viável em bovinos.

Experimento 1

Este experimento avaliou o efeito do tratamento a laser em embriões PIV e subseqüente sobrevivência dos blastômeros. Em seis replicatas, embriões bovinos foram produzidos in vitro a partir de oócitos obtidos de matadouros através de procedimentos laboratoriais padrão (TransOva Genetics, Sioux Center, IA). Nos dias 5, 6, e 7 do cultivo in vitro, embriões foram divididos ao acaso em 3 grupos; sem tratamento (Controle), Pseudo ou Corte. Os embriões Controle retornaram imediatamente para a incubadora. Os embriões do grupo Pseudo foram expostos a todas as condições dos embriões do grupo Corte, exceto a eclosão assistida a laser. O sistema XYClone® _{(Hamilton Thorne}

BioSciences) foi utilizado para tratar o grupo Corte. O sistema XYClone® _{é um laser classe 1 de 300 milliwatt, que}

emite um feixe de 3,5 µm num comprimento de onda de 1480 nm. As configurações de força foram ajustadas para 90% e comprimento de pulso de 600 µs. Os embriões foram retornados para as culturas até o dia 8 quando o desenvolvimento embrionário e a porcentagem de células vivas foram determinadas e analisadas pelo teste do Qui- Quadrado.

Os índices de desenvolvimento embrionário foram superiores a 90% e similares em todos os grupos de tratamento (dados não mostrados). A porcentagem de células vivas por embrião entre os tratamentos EAL não foi diferente, independentemente do dia em que o tratamento foi aplicado (Tabela 1).

Experimento 2

O efeito da EAL na viabilidade pós-transferência de embriões PIV foi avaliada através da divisão ao acaso de embriões produzidos comercialmente (TransOva Genetics) em dois grupos no dia da transferência, Controle ou Corte. A ZP de embriões tratados foi tratada com o laser XYClone® _{usando um pulso de 80% de força e comprimento}

de pulso de 500 µsec no dia 7, imediatamente antes da transferência para receptoras sincronizadas em estro. Ultrasonografia foi usada para determinar os índices de prenhez nos dias 30 e 60 de gestação. A EAL proporcionou aumento de 4,9% nas prenhezes no dia 30 de gestação, mas essa diferença não foi estatisticamente significativa (Tabela 2). Devido às condições comerciais, nem todas as receptoras foram monitoradas no dia 60. Houve um total de 280 receptoras que foram checadas para prenhez por ultrasom no dia 60 de gestação. Neste sub grupo de receptoras, os embriões que foram tratados com EAL exibiram um melhora de 11,8% no índice de prenhez (P < 0,05; Tabela 3).

Sumário

Esses dados são preliminares e requerem testes adicionais de campo da tecnologia de EAL. Entretanto, esses resultados demonstram que o sistema XYClone®_{, quando utilizado numa operação comercial, é um tratamento}

seguro, efetivo, que pode melhorar os índices de prenhez para embriões PIV. Estudos adicionais são necessários para se avaliar a efetividade da EAL para embriões produzidos in vivo, assim como para determinar o efeito em diferentes Long C.R. 2008. Eclosão assistida a laser em embriões bovinos produzidos in... Laser assisted hatching in bovine in vitro

graus e estágios embrionários. Como em humanos, o grau de melhoria causado pela EAL na viabilidade embrionária após transferência pode ser dependente de um grande número de variáveis, que ainda devem ser identificadas no sistema bovino.

Referências

AETA American Embryo Transfer Association. 2005. Homepage. http://www.aeta.org/. Accessed 2007 Aug 14. Balaban, B., et al., 2006. Laser-assisted hatching increases pregnancy and implantation rates in cryopreserved

embryos that were allowed to cleave in vitro after thawing: a prospective randomized study. Hum Reprod. 21, 2136-40.

Balaban, B., Urman, B, Alatas, C, Mercan, R, Mumcu, A, Isiklar, A, 2002. A comparison of four different techniques of assisted hatching. Human Reproduction 17, 1239-1243.

Blake, D. A., et al., Laser zona pellucida thinning—an alternative approach to assisted hatching. Vol. 16, 2001, pp. 1959-1964.

Cohen, J., Alikani, M, Trowbridge, J, Rosenwaks, Z, 1992. Implantation enhancement by selective assisted hatching using zona drilling of human embryos with poor prognosis. Human Reproduction. 7, 685-91.

Dokras, A., Sargent, IL, Ross, C, Gardner, RL, Barlow, DH, 1991. The human blastocyst: morphology and human chorionic gonadotropin secretion in vitro. Human Reproduction 11, 43-51.

Douglas-Hamilton, D. H., Conia, J., 2001. Thermal effects in laser-assisted pre-embryo zona drilling. Journal of Biomedical Optics. 6, 205-213.

Drobnis, E., Andrew, JB, Katz, DF, 1988. Biophysical properties of the zona pellucida measured by capillary suction: is zona hardening a mechanical phenomenon? Journal of Experimental Zoology. 245, 206-219.

Edi-Osagie, E., et al., The impact of assisted hatching on live birth rates and outcomes of assisted conception: a systematic review. Vol. 18, 2003, pp. 1828-1835.

Flechon, J., Renard, JP, 1978. A scanning electron microscope study of the hatching of bovine blastocysts in vitro. . Journal of Reproduction and Fertility. 53, 9-12.

Gonzales, D., Bavister, BD, 1995. Zona pellucida escape by hamster blastocysts in vitro is delayed and morphologically different compared with zona escape in vivo. Biol Reprod. 52, 470-480.

Grace, J., Bolton, V, Braude, P, Khalaf, Y, 2007. Assisted hatching is more effective when embryo quality was optimal in previous failed IVF/ICSI cycles. Journal of Obstetrics and Gynecology. 27, 56-60.

Joris, H., De Vos, A, Janssens, R, Devroey, P, Liebaers, I, Van Steirteghem, A, 2003. Comparison of the results of human embryo biopsy and outcome of PGD after zona drilling using acid Tyrode medium or a laser. Human Reproduction. 18, 1896-1902.

Lanzendorf, S., Ratts, V, Moley, K, Goldstein, J, Dahan, M, Odem, R, 2007. A randomized, prospective study comparing laser-assisted hatching and assisted hatching using acidified medium. . Fertility and Sterility. 87, 1450-1457.

Loret de Mola, J., Garside, WT, Bucci, J, 1997. Analysis of human zona pellucid during culture: correlation with diagnosis and the preovulatory hormonal environment. . J Assisted Reprod Genet. 14, 332-336.

Makrakis, E., Angeli, I, Agapitou, B, Pappas, K, Dafereras, A, Pantos, K, 2006. Laser versus mechanical assisted hatching: a prospective study of clinical outcomes. Fertility and Sterility 86, 1596-1600.

Mantoudis, E., et al., A comparison between quarter, partial and total laser assisted hatching in selected infertility patients. Vol. 16, 2001, pp. 2182-2186.

Long C.R. 2008. Eclosão assistida a laser em embriões bovinos produzidos in... Laser assisted hatching in bovine in vitro

Meldrum, D., Wisot, A, Yee, B, Garzo, G, Yeo, L, Hamilton, F, 1998. Assisted hatching reduces the age-related decline in IVF outcome in women younger than age 43 without increasing miscarriage or monozygotic twinning. . Journal of Assisted Reproduction and Genetics 15, 418-421.

Menges, S., et al., 2008. Utilization of laser-assisted hatching to improve the pregnancy rate of in vitro fertilized bovine embryos. Reprod Fertil Dev. 20, 150.

Neev, J., et al., 1995. Assisted hatching in mouse embryos using a noncontact Ho:YSGG laser system. J Assist Reprod Genet. 12, 288-93.

Schmoll, F., et al., 2003. Effects of different laser-drilled openings in the zona pellucida on hatching of in vitro- produced cattle blastocysts. Fertil Steril. 80 Suppl 2, 714-9.

Seif, M., Edi-Osagie, EC, Farquhar, C, Hooper, L, Blake, D, McGinlay, P, 2006 Assisted hatching on assisted conception (IVF & ICSI). Cochrane Database Syst Rev. CD001894.

Tadir, Y., et al., Laser Effects in the Manipulation of Human Eggs and Embryos for In vitro Fertilization. Methods in Cell Biology, Vol. Volume 82. Academic Press, 2007, pp. 409-431.

Tinney, G. M., et al., 2005. Use of a zona laser treatment system in assisted hatching: optimal laser utilization parameters. Fertil Steril. 84, 1737-41.

Tucker, M. J., et al., Infertility: Enhancement of outcome from intracytoplasmic sperm injection: does co-culture or assisted hatching improve implantation rates? , Vol. 11, 1996, pp. 2434-2437.

Vajta, G., Holm, P, Greve, T, Callesen, H 1997. Survival and development of bovine balstocysts produced in vitro after assisted hatching, vitrification, and in-straw direct rehydration. Journal of Reproduction and Fertility. 111, 65-70.

Long C.R. 2008. Eclosão assistida a laser em embriões bovinos produzidos in... Laser assisted hatching in bovine in vitro

LASER ASSISTED HATCHING IN BOVINE IN VITRO PRODUCED EMBRYOS TO