Döner Sermaye İşletmelerinin Yararları

1 _{Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Estación Experimental Bariloche, CC 277 (8400), Bariloche,}

Argentina, 2 _{Lab. Biotecnología de la Reproducción, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires,}

Argentina, *_{phone: 0054 2944 422731, fax: 0054 2944 429600, [email protected]} Resumo

O avanço nas biotécnicas como a clonagem e a transgênese depende, entre outros fatores, do desenvolvimento dos aspectos metodológicos direcionados às técnicas de colheita de oócitos. Atualmente, em pequenos ruminantes, estamos melhorando a eficiência da técnica de colheita de oócitos através da observação por laparoscopia. A eficiência desta técnica se baseia na quantidade e qualidade dos oócitos colhidos, podendo apresentar uma variabilidade de resultados segundo o tipo de agulha, pressão de aspiração, regime de aplicação e número de injeções do tratamento farmacológico para o desenvolvimento folicular, segundo o indivíduo, espécie, raça, tratamentos sucessivos e o tamanho do folículo que deu origem ao oócito. Novas pesquisas deverão contribuir para melhorar de forma significativa as metodologias de produção in vitro de embriões, a fim de obter uma ferramenta para a produção de ovinos e caprinos geneticamente modificados. Palavras-chave: ovino; caprino; oócitos, folículos; laparoscopia.

Introdução

Atualmente, a produção in vitro de embriões (PIVE) representa o domínio inovador na reprodução animal. Recentemente esta técnica tem sido especialmente utilizada para a clonagem (Wilmut et al., 1997) e a transgênese (Baldassarre et al., 2002, 2003).

Entre os principais fatores que influenciam o sucesso da PIVE temos a qualidade dos oócitos utilizados na maturação in vitro (MIV) para posterior fecundação, clonagem ou transgênese.

A importância da qualidade oocitária na PIVE incentivou o desenvolvimento de técnicas de colheita que permitam obtenção sucessiva de oócitos de boa qualidade. A colheita oocitária por laparoscopia (COL) ou laparoscopic ovum pick-up (LOPU) começou a desenvolver-se a partir dos anos 90 e estudos posteriores ampliaram a possibilidade de sua utilização para a PIVE. Vale assinalar que diferentemente dos oócitos colhidos de animais em abatedouro, através da COL é possível conhecer o estado sanitário e o potencial genético das doadoras e aumentar o número, tamanho folicular e a competência oocitária através do uso de tratamentos com hormônios gonadotrópicos.

Técnicas de colheita oocitária

A primeira técnica utilizada para a obtenção de oócitos foi a partir de ovários de animais para consumo, permitindo a colheita de oócitos sem afetar sua capacidade de desenvolvimento (Wani, 2002). Todavia, não é possível conhecer o estado sanitário, nutricional e a idade dos animais doadores. Mesmo sendo uma fonte de grande quantidade de oócitos, a eficiência da colheita oocitária não é maior que a obtida por COL (Sevillano et al., 1997). A laparotomia é uma técnica cirúrgica utilizada para a colheita de oócitos de fêmeas vivas e tem como vantagem dar a possibilidade de conhecer o estado sanitário e genético das fêmeas doadoras. Todavia, não é um método rápido, predispõe às aderências ovarianas, dificulta colheitas repetidas e pode causar infertilidade nas doadoras (Kühholzer et al., 1997).

A COL consiste na obtenção de oócitos a partir de folículos da superfície de ambos os ovários, aspirados através de observação laparoscópica. As vantagens da técnica são: colher oócitos de fêmeas doadoras com problemas de fertilidade, em período de gestação, anestro, senilidade e pré-púberes, possibilita diminuir o intervalo de gerações e acelerar a propagação de animais de elevado valor genético (Baldassarre et al., 2002). Por sua vez, em comparação coma técnica cirúrgica, é menos traumática, rápida (20 minutos por animal), permitindo sua utilização sucessiva e sem diminuição da futura fertilidade das doadoras (Stangl et al., 1999; Alberio et al., 2002).

Snyder & Dukelow (1974) descreveram pela primeira vez o uso desta técnica em ovelhas. Logo depois, a COL foi aperfeiçoada por Tervit et al. (1992). Estima-se que por cada sessão de COL se obtém entre quatro a 10 oócitos por fêmea doadora, com uma taxa de colheita oocitária de 33 a 60% (Tervit et al., 1992; Alberio et al., 2002; Gibbons et al., 2007, Tabelas 1 e 2). Valores superiores de colheita foram obtidos em ovinos (Baldassarre et al. 1994; 1996) e caprinos (Baldassarre et al., 2002; 2003). Vale mencionar que a COL foi utilizada internacionalmente em uma grande variedade de espécies (ovinos: Stangl et al., 1999; Alberio et al., 2002; Rodríguez et al., 2006; Cox

Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s223-s230, 2008.

ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online)

& Alfaro, 2007; Gibbons et al., 2007; caprinos: Baldassarre et al., 2002, 2003, 2007; Cox & Alfaro, 2007; Gibbons et al., 2007; Rahman et al., 2007; eqüinos: Hinrichs et al., 1990; cervídeos: Comizzoli et al., 2001 e felinos: Goodrowe et al., 1989). A eficiência desta técnica se baseia na quantidade e qualidade de oócitos colhidos, podendo apresentar variabilidade dos resultados de acordo com o tipo de agulha, pressão de aspiração, regime de aplicação e número de injeções do tratamento para desenvolvimento folicular, intervalo entre as COLs nos tratamentos sucessivos e tamanho folicular de procedência dos oócitos. De maneira breve, estas são algumas das considerações a respeito das variáveis descritas.

O tipo de agulha é um dos fatores que alteram a porcentagem de colheita oocitária (oócitos colhidos/folículos puncionados) e qualidade dos oócitos. As variáveis são o diâmetro da agulha e a largura do bisel. A primeira pode modificar a qualidade oocitária, já que em um menor diâmetro da agulha o oócito é submetido a forças de atrito que podem retirar parte da cobertura de células do cumulus. O bisel determina a porção da agulha que será introduzida no folículo para realizar a retirada e conseqüente absorção do oócito. Esta última característica condiciona a porcentagem de colheita (Bols et al., 1997). Diversos autores experimentaram vários tamanhos de agulha, obtendo excelentes resultados de colheita e qualidade oocitária (Baldassarre et al., 1994, 1996, 2003; Kuhholzer et al., 1997; Ptak et al., 1999; Stangl et al., 1999; Alberio et al., 2002; Berlinguer et al., 2004; Rodríguez et al., 2006; Gibbons et al., 2007).

A pressão de aspiração é outro fator a definir. As pressões ótimas de aspiração por meio do uso de bombas a vácuo, estariam entre 50 e 70 mm de mercúrio (Baldassarre et al., 2003; Koeman et al., 2003), enquanto que pressões menores na ordem dos 25 mm apresentam menores taxas de colheita (Alberio et al., 2002; Rodríguez et al., 2006) Deve-se considerar que existe uma relação inversamente proporcional entre a pressão de aspiração e a qualidade dos oócitos colhidos (Cognié et al., 2003). Portanto, deve-se adotar uma solução entre a pressão de aspiração, a taxa de colheita e a qualidade oocitária. Convém lembrar que é possível reduzir e simplificar o custo da COL utilizando seringas de uso convencional e adaptadas para este fim (Kuhholzer et al., 1997; Stangl et al., 1999; Berlinguer et al., 2004) Também é possível utilizar uma cânula de inseminação artificial intra-uterina com controle (Alberio et al., 2002) ou sem controle de vácuo (Gibbons et al., 2007).

O regime de aplicação e número de injeções do tratamento hormonal para estimulação do desenvolvimento folicular estão baseados na sincronização da onda folicular. O objetivo é aumentar a quantidade e o tamanho dos

folículos no momento da COL. A técnica mais utilizada é a sincronização mediante o uso de esponja intravaginal com 60 mg de acetato de medroxiprogesterona. O uso de prostaglandina está associado aos tratamentos com progestágenos para otimizar a sincronização das fêmeas doadoras. A aplicação de 50 µg de prostaglandina por animal, 48 horas antes da estimulação folicular, assegura a luteólise e o começo de uma nova onda folicular. Na última década os hormônios mais utilizados tem sido o FSH combinado com eCG. Vários autores citam que os hormônios gonadotróficos aumentam a quantidade e qualidade dos oócitos colhidos (Baldassarre et al., 1994, 1996; Van Wagtendonk de Leeuw & Ruigh, 2002; Cognié et al., 2003; Berlinguer et al., 2004; Agus Setiadi et al.; 2004; Locatelli et al., 2004; Tomkins et al., 2004). Atualmente, a dose para estimulação folicular com hormônios gonadotróficos está praticamente uniformizada, porém o regime e o tempo entre estimulação hormonal e punção folicular é um tema de discussão. Existem vários protocolos de estimulação, entre os quais se utilizam doses decrescentes (Baldassarre et al., 1994, 1996; Crozet et al., 1995; Alberio et al., 2002; Berlinguer et al., 2004) ou doses constantes a cada 12 ou 24 horas (Ptak et al., 1999; Berlinguer et al., 2004). Em relação ao número de injeções, alguns autores realizam protocolos de seis a duas injeções sucessivas (Baldassarre et al., 1994, 1996; Crozet et al., 1995; Ptak et al., 1999; Alberio et al., 2002; Berlinguer et al., 2004), enquanto outros utilizam dose única, tratamento denominado “One Shot” ( Stangl et al., 1999; Baldassarre et al., 2002, 2003; Keefer et al., 2002; Koeman et al., 2003; Gibbons et al., 2007). As COLs são realizadas às 10, 24, 36 ou 48 horas do final da estimulação gonadotrófica (Tervit et al., 1993; Baldassarre et al., 1994, Crozet et al., 1995; Alberio et al., 2002; Berlinguer et al., 2004). A estimulação com uma só injeção é feita às 24, 36 ou 48 horas antes de realizar a COL (Stangl et al., 1999; Baldassarre et al., 2002, 2003; Keefer et al., 2002; Koeman et al., 2003; Gibbons et al., 2007). Baldassarre et al. (1996) não descreveram diferenças entre uma injeção em comparação às injeções múltiplas decrescentes. Estes diferentes tratamentos de estimulação anteriores à COL determinam o estado e o tamanho dos folículos presentes no ovário no momento da colheita oocitária. Neste último aspecto, é de especial importância que para colher oócitos mais competentes, é necessário puncionar folículos maiores que 3 mm de diâmetro, pois a competência oocitária está condicionada por proteínas e fatores de maturação que são sintetizados unicamente durante a etapa final de crescimento folicular (Crozet et al., 1995). É importante levar em conta os fatores intrísecos da doadora de oócitos, em particular a condição corporal, raça, idade e potencial genético, pois estes influenciam a dinâmica folicular e consequentemente influenciarão a qualidade e número de oócitos obtidos. A resposta individual dos animais seria um dos fatores mais importantes da grande variabilidade na eficiência da técnica (Cognié et al., 2004).

O tempo entre as COL entre os tratamentos sucessivos varia de quatro a 16 dias (Baldassarre et al., 1994,

1996; Alberio et al., 2002; Berlinguer et al., 2004; Gibbons et al., 2007). Com relação a realização de sucessivas COL no mesmo animal, vários autores destacam que não afeta a quantidade dos folículos ovarianos nem a qualidade Gibbons A., Bonnet F.P., Cueto M.I., Salamone D. & Catala M. 2008. Colheita de oócitos guiada por laparoscopia em caprinos e ovinos. Recovery of sheep and goat oocytes by laparoscopy. Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s223-s230.

dos oócitos obtidos (Kuhholzer et al., 1997; Stangl et al., 1999; Ptak et al., 1999; Alberio et al., 2002; Berlinguer et al., 2004; Gibbons et al., 2007; Tabelas 1 e 2).

O tamanho do folículo que deu origem ao oócito determina a eficiência da colheita oocitária por laparoscopia

em ovinos, sendo maior em folículos grandes. Contudo, em caprinos o tamanho folicular não condiciona a eficiência da colheita oocitária (Gibbons et al., 2007).

Conclusão Geral

O avanço nas modernas biotécnicas depende do desenvolvimento de alguns aspectos metodológicos como, por exemplo, as técnicas de obtenção de oócitos competentes. As investigações sobre as variáveis determinantes da eficiência global da obtenção in vivo de oócitos mediante a COL, têm contribuído para uma melhoria significativa na obtenção de oócitos de animais geneticamente conhecidos e com segurança sanitária. As colheitas sucessivas por laparoscopia em ovinos e caprinos têm demonstrado a facilidade de obter alta quantidade e qualidade de oócitos para a produção in vitro de embriões. Por conseguinte, a COL seria uma excelente ferramenta para ser integrada aos processos de clonagem e transgênese em pequenos ruminantes. Por último, cabe ressaltar que a utilização da COL em outras espécies permitirá a obtenção de germoplasma para conservar a biodiversidade e preservar os recursos genéticos.

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RECOVERY OF SHEEP AND GOAT OOCYTES BY LAPAROSCOPY