Para avaliação do potencial de produção de enzimas hidrolíticas extracelulares, foram realizados testes qualitativos em meio sólido. Os resultados foram expressos em Indices Enzimáticos (IE), que correspondem à razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro da colônia. Todas as amostras foram testadas em triplicata.
4.2.3.1 Produção do inóculo para os ensaios em meio sólido
Para a avaliação do potencial de produção de enzimas hidrolíticas extracelulares, as leveduras foram reativadas das culturas estoques, repicadas pela técnica do esgotamento em placas contendo ágar Sb e incubadas a 25-28ºC por 48 horas. Decorrido esse tempo, as colônias foram transferidas com o auxílio de uma alça descartável para tubos de ensaio contendo 2 mL de salina esterilizada formando uma suspensão. A concentração de células foi padronizada por meio da escala de McFarland nº1, correspondente à presença de 3 x 108 UFC/mL para leveduras.
38 4.2.3.2 Amilases
A habilidade de degradar amido foi usada como critério para determinação da produção de enzimas amilolíticas (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de amido solúvel, 0,67% de YNB e 2% de ágar. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados a 28ºC por 120 horas e, ao final deste período, a revelação foi realizada pela sublimação de iodo depositado nas tampas das placas. A atividade amilolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro. O restante do meio permaneceu corado de violeta (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975).
4.2.3.3 Celulases
A habilidade de degradar carboximetilcelulose foi usada como critério para determinação da produção de enzimas celulolíticas (TEATHER & WOOD, 1982). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de carboximetilcelulose, 0,67% de YNB e 1,5% de ágar. Para o preparo deste meio, a carboximetilcelulose foi homogeneizada com o auxílio de um liquidificador. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C e a revelação foi realizada adicionando-se 5 mL de uma solução aquosa de vermelho Congo a 0,03% às placas inoculadas. Decorridos 15 minutos após esse procedimento, as placas foram lavadas com uma solução de NaCl 1M. A hidrólise da carboximetilcelulose foi evidenciada pela formação de um halo de coloração clara ao redor da colônia (TEATHER & WOOD, 1982). A atividade celulolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.
4.2.3.4 Pectinases
A habilidade de degradar pectina cítrica foi usada como critério para determinação da produção de enzimas pectinolíticas (BRIZZIO et al., 2007). Os
39 ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de pectina cítrica, 0,67% de YNB e 1,5% de ágar. Para o preparo deste meio, a pectina foi homogeneizada com o auxílio de um liquidificador e autoclavada separada do ágar. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C e a revelação foi realizada pela sublimação de iodo depositado nas tampas das placas. A hidrólise da pectina foi evidenciada pela formação de um halo de coloração clara ao redor da colônia (BRIZZIO et al., 2007). A atividade pectinolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.
4.2.3.5 Xilanases
A habilidade de degradar xilana foi usada como critério para determinação da produção de enzimas xilanolíticas (BHADRA et al., 2008). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de xilana, 0,67% de YNB e 2% de ágar. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C e a revelação foi realizada adicionando-se 5 mL de uma solução aquosa de vermelho Congo a 0,03% às placas inoculadas. Decorridos 15 minutos após esse procedimento, as placas foram lavadas com uma solução de NaCl 1M. A hidrólise da xilana foi evidenciada pela formação de um halo de coloração clara ao redor da colônia (BHADRA et al., 2008). A atividade xilanolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.
4.2.3.6 Proteases
A habilidade de degradar caseína foi usada como critério para determinação da produção de enzimas proteolíticas (DUARTE et al., 2013). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 2,5% de SkimMilk base (fonte de caseína), 0,1% de glicose, 0,5% de peptona, 0,3% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte e 1,5% de agar. Para o preparo deste meio, a base SkimMilk foi autoclavada separadamente dos demais componentes do meio e, após autoclavados, as
40 soluções foram misturadas a 60ºC, antes da distribuição nas placas. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura, e os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C. A hidrólise da caseína foi evidenciada pela formação de um halo translúcido ao redor da colônia (DUARTE et al., 2013). A atividade proteolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.
4.2.3.7 Lipases
A habilidade de degradar azeite de oliva foi usada como critério para determinação da produção de enzimas lipolíticas (COLEN, 2006). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de azeite de oliva; 0,5% de (NH4)2SO4; 0,2% de ureia; 0,1% de MgSO4.7H20; 0,1% de NaCl; 0,2% de sais biliares; 0,05% de extrato de levedura; e 1,5% de agar. Para o preparo deste meio todos os reagentes foram misturados e aquecidos até solubilização do agar e, posteriormente, a mistura foi homogeneizada com o auxílio de um liquidificador. A emulsão produzida pela mistura do azeite de oliva ao meio persiste mesmo após autoclagem. Dessa forma, foi possível obter um meio homogêneo para o ensaio qualitativo. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura, e os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C. A hidrólise do óleo de oliva foi evidenciada pela formação de um halo translúcido ao redor da colônia (COLEN, 2006). A atividade lipolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.
4.2.4 Avaliação do potencial de produção de fatores promotores de