TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TEMEL METAL ALAŞIMI ve ALAŞIMLARDAN SALINAN ELEMENTLERİN HÜCRE METABOLİZMASI ÜZERİNE ETKİSİ
İrem GÖKTEPE ATEŞ
PROTETİK DİŞ TEDAVİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN Prof. Dr. Gülşen CAN
Bu tez, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğü tarafından 20050802067 proje numarası ile desteklenmiştir.
2007– ANKARA
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TEMEL METAL ALAŞIMI ve ALAŞIMLARDAN SALINAN ELEMENTLERİN HÜCRE METABOLİZMASI ÜZERİNE ETKİSİ
İrem GÖKTEPE ATEŞ
PROTETİK DİŞ TEDAVİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN Prof. Dr. Gülşen CAN
2007– ANKARA
Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Protetik Diş Tedavisi Doktora Programı
çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir.
Tez Savunma Tarihi: 26 / 07 / 2007
Prof. Dr. Ali ZAİMOĞLU Ankara Üniversitesi Jüri Başkanı
Prof. Dr.Nurşen SARAÇ Prof. Dr. Gülşen CAN Ankara Üniversitesi Ankara Üniversitesi
Prof. Dr. Aykut ÖZKUL Prof. Dr. Bülent ULUDAĞ Ankara Üniversitesi Ankara Üniversitesi
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay ii
İçindekiler iii
Önsöz v
Simgeler ve Kısaltmalar vi
Şekiller ve Resimler vii
Çizelgeler viii
1. GİRİŞ 1
1.1. Alaşımlar 1
1.2. Biyouyumluluk 10
1.2.1. Sistemik Etki 10
1.2.2. Lokal Etki 12
1.2.3. Alerjik Etki 14
1.2.4. Mutajenik ve Karsinojenik Etki 14 1.3. Dental Materyallerin Biyouyumluluk Değerlendirme 15 Yöntemleri
1.3.1. İn Vitro Test Yöntemleri 16
1.3.1.1. Biyolojik Sistem 18
1.3.1.2. Hücre-Materyal Teması 22
1.3.1.3 Değerlendirme Yöntemleri 23
1.4. Spektrofotometri 25
1.5. Amaç 26
2. GEREÇ VE YÖNTEM 27
2.1. Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması 27 2.2. Metal Örneklerin Hazırlanması 29 2.3. Hücre Kültürünün Hazırlanması 30
2.4. Deney 31
3. BULGULAR 36
4. TARTIŞMA 45
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 57
ÖZET 59
SUMMARY 61
KAYNAKLAR 63
ÖZGEÇMİŞ 70
ÖNSÖZ
Fakülte hayatım ve doktora eğitimim süresince tüm yardımları ve manevi desteğini esirgemeyen, bilgi ve deneyimi ile yol gösteren değerli tez danışmanım Sayın Prof.
Dr. Gülşen Can’a,
Tez çalışmalarım süresince yardımları ve desteği için A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı öğretin üyesi Sayın Prof. Dr. Aykut Özkul’a,
Hayatım boyunca her zaman yanımda olan ve hep yanımda olacağını bildiğim, beni her konuda destekleyen sevgili ailem ve eşime,
teşekkür ederim.
SİMGELER VE KISALTMALAR
AAS Atomik Absorpsiyon Spektrometresi Aº Angström
Al2O3 Aluminyum oksit
BSA Bovine Serum Albumine ºC Santigrat derece
CO2 Karbondioksit
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium FBS Fetal bovine serum
IU/ ml İnternasyonal Ünite / mililitre
ISO Internatıonal Organization for Standards LD50 %50 letal doz
L929 Fare fibroblast hücresi
mg miligram
mL mililitre
mg / kg miligram / kilogram µg mikrogram µmol / L mikromol / litre
µL mikrolitre
µm mikrometre
µmol mikromol
nm nanometre
ppm milyonda partikül sayısı TC50 %50 toksik konsantrasyon
ŞEKİLLER ve RESİMLER
Şekil 3.1.Kumlanmış, parlatılmış metal örneklerin bulunduğu ortamdaki 36
hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları canlılık sonuçları Şekil. 3.2. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu 39
hücrelerin ve kontrol grubunun 24. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri Şekil 3.3.Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu 39
hücrelerin ve kontrol grubunun 72. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri Resim 2.1. Ticari metal tuzları 27
Resim 2.2. Metal iyon tuzları 28
Resim 2.3. Ni-Cr (Wiron 99) metal alaşımı 29
Resim 2.4. Pirinç metal örneği 30
Resim 2.5. Metal iyonu çözeltileri yerleştirilmiş 96 göz hücre kültürü 32 tableti Resim 2.6. Metal iyon çözeltileri ile temasta olan kristal viyole ile 32 boyanmış hücreler Resim 2.7.Spektrofotometre 33 Resim 2.8.Metal örnekler yerleştirilmiş 24 göz hücre kültürü tableti 34 Resim 2.9.Metal örnekler ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış 34 hücreler
ÇİZELGELER
Çizelge 1.1. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin 3
Fiziksel Etkileri
Çizelge 1.2. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin 7
Biyolojik Etkileri
Çizelge 1.3. LD 50 değerine göre toksisite dereceleri 11
Çizelge 1.4. Bazı elementlerin diyetle günlük alınım dozları 11
Çizelge 1.5. Dental döküm alaşımlarına katılan metal iyonlarının 13
TC50 değerleri
Çizelge 2.1. Ni-Cr temel metal alaşımı içindeki elementler ve ağırlık 28
yüzdeleri
Çizelge 2.2.Metal iyonları, kullanılan çözeltiler ve konsantrasyonlar 29
Çizelge 3.1. Kumlanmış ve parlatılmış metal örneklerin bulunduğu 36 ortamdaki hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda
ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerleri
Çizelge 3.2.Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu 38 hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda
ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerleri
Çizelge 3.3.Seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda 40 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)
canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları
Çizelge 3.4. Seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonunda 41 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)
canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları
Çizelge 3.5. Derişik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda 42 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)
canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları
Çizelge 3.6. Derişik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonunda 43 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)
canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları
1.GİRİŞ
1.1. Alaşımlar
Günümüz diş hekimliğinde restoratif amaçlı değişik materyallerin kullanımı, materyal ve canlı doku arasındaki ilişkinin uyumlu olmasını gerektirmektedir.
Dental amaçlarla kullanılan alaşımlar, genellikle erimiş halde birbirleri içinde çözünen iki veya daha fazla metalin birleşmesiyle meydana gelirler.
Alaşımların ekonomik ve mekanik açıdan olumlu özelliklerini üst seviyelere taşıma gerekliliği biyolojik uyum özelliklerini de göz önüne alma zorunluluğu yaratmaktadır (Kawahara ve ark., 1968; Çetin, 1977; Wataha, 2000; O'Brien, 2002).
Diş hekimliğinde protetik amaçla kullanılan alaşımların sınıflandırılması Mc Lean (1979) tarafından aşağıdaki şekilde yapılmıştır:
Soy Metal Alaşım Sistemleri
Yüksek Altın Alaşımları - Altın-Platin-Paladyum Alaşımları - Altın-Platin-Tantal Alaşımları Düşük Altın Alaşımları - Altın- Paladyum-Gümüş Alaşımları Altınsız Alaşımlar - Paladyum-Gümüş Alaşımları
Temel Metal Alaşım Sistemleri -Nikel-Krom Alaşımları -Kobalt-Krom Alaşımları
Soy ve Temel Metal Alaşımları İçerisindeki Elementler
Yüksek altın içeren soy metal alaşımlarının biyolojik olarak yüksek uyumlulukları gösterdikleri bilinmektedir. Ancak özellikle temel metal alaşımlarının bileşiminde bulunan nikel, krom, kobalt, bakır ve berilyum, biyolojik yönden olumsuz özelliklere sahip elementler olarak değerlendirilmektedir (Zaimoğlu ve ark.,1993) (Çizelge 1.1).
Altın
Lekelenme ve korozyona direnç sağlanabilmesi için bir alaşımın altın içeriğinin ağırlıkça en az % 75 olması gerekir (Zaimoğlu ve ark., 1993).
Altına bağlı lokal ya da sistemik yan etkiler nadiren görülür. Altın tuzlarının intravenöz uygulamalarında bile toksisite oldukça nadirdir. Genellikle altın alerjisi olduğu bildirilen hastaların tamamında, nikel, kobalt ya da krom alerjisi de görülür (Craig ve Powers, 2002; Özen, 2001).
Platin
Yüksek erime ısısı ve yüksek korozyon direnci ve buna bağlı olarak yüksek biyouyumluluğu ile diş hekimliğinde, özellikle seramik restorasyonların yapımında; tıpta implant materyali olarak sıklıkla kullanılan bir metaldir (Craig ve Powers, 2002).
Paladyum
Altın ve gümüş ile birlikte pek çok alaşımın içerisinde kullanılır. Alaşımın erime sıcaklığını yükseltir. Üstün mekanik özellikleri ve biyouyumluğu sayesinde diş hekimliğinde, özellikle seramik restorasyonların alt yapısında;
tıpta implant materyali olarak kullanılmaktadır (Craig ve Powers, 2002).
Çizelge1.1. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin Fiziksel Etkileri (Zaimoğlu ve ark., 1993)
Nikel
Soy metal alaşımlara ilave edildiğinde, alaşımların mekanik özelliklerinde olumlu etkilere neden olur. Altın alaşımlarına düşük konsantrasyonda nikel ilavesi, alaşımın beyazlığını ve sertliğini arttırır. Ni-Cr-Co alaşımları % 81 oranında nikel içerebilirler. Nikel içeren soy olmayan temel metal alaşımlarının diş hekimliğinde yaygın kullanımı ile alerjik reaksiyonların sıklığı dikkat
Metal Katılma Oranı(%) Özellikler
Berilyum 1-2 Dökülebilirlik, çekilebilirlik ve iletkenliği arttırır, birleşme sıcaklığını düşürerek alaşım elementlerini birarada tutar
Demir 0,2-2,5 Sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur
İndiyum 0,2-1 Sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur
Kalay 0,2-1 Sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur
Manganez 0,5-6 Korozyon direnci sağlar, sertlik verir,akıcılığı ve dökülebilirliği arttırır Silisyum 0,5-3,5 Dökülebilirliği ve iletkenliği arttırır, sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur
Aluminyum 1,1-6 Sertlik verir
Titanyum 0,02-1 Sertlik verir, oksit tabakası oluşturur Boron 0,5 Ergime aralığını genişletir, korozyona
direnç sağlar, sertlik verir
Molibden 2-12 Termal genleşme katsayısını kontrol eder, korozyon direncini arttırır, oksit oluşturur
Tunsten 6-7 Termal genleşme katsayısını kontrol eder, korozyon direncini arttırır
İridyum 0-15 Korozyon direnci ve elastikiyet katsayısını arttırır
Karbon 0,05-0,4 Dayanıklılık, sertlik ve iletkenlik sağlar
çekmiş, biyouyumlulukları konusunda sorunların ortaya çıkmasına neden olmuştur (Kansu, 1991; Craig ve Powers, 2002).
İnsanda akciğer, böbrek, karaciğer ve bağırsak dokularında değişik konsantrasyonlarda nikel elementi bulunur. Yaş ilerledikçe akciğerlerdeki nikel oranı artar. Normal idrar konsantrasyonu yaklaşık 2.3 mg / 100 ml’dir. İnsan tükürüğündeki nikel miktarı 0.8 - 4.5 mg / 100 ml arasında değişirken, yapılan doku kültürü araştırmalarında, insan gingivasındaki fibroblastlar için toksik miktarın 0.25 mg / 100 ml olduğu bildirilmiştir (Kansu, 1991; Özen, 2001).
Nikel içerikli alaşımların korozyon oranı yüksektir. Ağız boşluğunda oluşan korozyon ürünleri dokular tarafından tutulup hedef organlara taşınır. Bu, özellikle nikele duyarlı hastalarda, vücudun çeşitli yerlerinde yayılma reaksiyonu şeklinde kendini gösterir (Kansu, 1991).
Genel populasyonda nikele aşırı duyarlılık insidansı kayda değer oranda yüksek bulunmuştur (% 28,5). Kadınlarda bu insidans erkeklere oranla on misli fazladır (Kansu, 1991).
Nikel dermatitisi ellerde oluşan, parmaklara, bileklere ve ön kola yayılabilen, kaşıntı ve yanma hissi ile beraber seyreden papiller eritemlerle karakterize bir deri hastalığıdır (Suzuki, 1995). Genellikle nikel alerjisi semptomları, metale temas eden vücudun bir bölgesinde egzamatöz reaksiyon ile başlar (Kansu, 1991).
Nikele duyarlılık gelişmesine etki edebilen nonspesifik etkenler mekanik irritasyon, deri iltihabı, nikele temas etme şiddeti ve sürekliliği, deri ısısının artması ve nem gibi çevresel faktörlerdir. Nikel içerikli alaşımlara duyarlılık reaksiyonları, vücut salgılarının fazla olduğu sıcak ve nemli bölgelerde ortaya çıkar. Isı artışı ile oluşan ter içindeki klorit, alaşım içindeki nikeli iyonize eder.
Korozyona uğrayan nikel tuzları, dokudaki taşıyıcı molekül ile birleşerek
antijenik özellikler kazanır ve deride duyarlılık reaksiyonlarına neden olurlar (Kansu, 1991).
Krom
Krom, alaşımlara, lekelenme ve paslanmaya karşı direnç özelliği kazandırır.
Alaşım içindeki krom oranı % 20-30 olmalıdır. % 30 üzerindeki krom, alaşımın kırılganlığını arttırır, dökümü zorlaştırır. Kromun % 20’nin altında olduğu durumlarda alaşımın dayanıklılığı ve lekelenmeye karşı direnci azalır (Kansu, 1991).
Endüstriyel alanda krom toksisitesine maruz kalanlarda, solunum sistemi irritasyonları, septum nazi perforasyonları, pulmoner fibrozis ve hatta akciğer kanserine rastlanılmaktadır. Ancak diş hekimliği uygulamalarından kaynaklanmış böyle bir etki bildirilmemiştir. Kan konsantrasyonları 10-100 ppm’i bulduğunda hücrelerde sitotoksik değişikliklere neden olabilmektedir (Kansu, 1991; Messer ve Lucas, 1999; Özen, 2001).
Kobalt
Alaşımın elastisite modülünü nikelden daha fazla arttırır. Alaşıma % 35-66 oranında ilave edilir. Alaşıma sertlik ve dayanıklılık verir (Kansu, 1991).
Kronik kobalt toksikasyonunda, bireylerde hipertroidi, hematolojik bozukluklar, dispne oluşabilmekteyken dişhekimliğinde kullanılan formlarının bu yönde bir sistematik oluşturduğuna dair yayın mevcut değildir (Kansu, 1991; Özen, 2001).
Gümüş
İyi bir ısı ve elektrik iletkeni olan gümüş, ağızdaki metal yapılar üzerinde siyah sülfid formasyonu oluşturur. Korozyon direnci düşüktür. Gümüş içeren
alaşımlara paladyum ilavesi bu alaşımların korozyon oranını düşürür (Craig ve Powers, 2002).
Çinko
Altın ve platinle kullanıldığında alaşımın sertliğini ve parlaklığını arttırır.
Ayrıca ısıtma ve döküm işlemleri esnasında deokside edici görev yapar. Alaşım yapısına % 1-2 oranında katılır. Bu oranın yükselmesi alaşımın kırılganlığını arttırır (Craig ve Powers, 2002).
Bakır
Yüksek ısı ve elektrik iletkenliği ile bilinen yumuşak ve işlenebilir bir metaldir.
Altın alaşımlarının direnç ve sertliğini arttırır. Ancak alaşımın lekelenme ve korozyon direncini azalttığından alaşımlara en fazla % 0,5-1 oranında katılır (Craig ve Powers, 2002; Kansu,1991).
Berilyum
Dental alaşımlara % 0.48-1.89 oranında ilave edilen berilyum, alaşımın sertliğini ve dayanıklılığını arttırırken, dökülebilirliğini kolaylaştırır (Kansu, 1991).
Endüstriyel berilyuma maruz kalan bireylerde özellikle akciğer kanseri insidansının yüksek olduğu bildirilmektedir. Çeşitli yayınlarda protetik restorasyonlarda toksik olduğuna dair bilgiler mevcut olmamasına rağmen, diş hekimliği alanında son yıllarda alaşımların bileşiminden çıkarılmıştır (Kansu, 1991).
Diş hekimliği materyallerinin yapısına giren bu temel elementlerin yanısıra bileşimde eser miktarda bulunan diğer elementleri de göz ardı etmemek gerekir
Klinik uygulamalarda alaşımların, fizik ve mekanik özellikleri ile birlikte biyolojik özelliklerinin de göz önünde bulundurulması büyük önem taşır. Diş hekimliğinde kullanılan alaşımların ağız ortamında bulunmaları ve canlı dokularla ilişki halinde olmaları bu alaşımların alerjenite, toksisite ve karsinojenite özellikleri açısından detaylı incelemeleri gereğini ortaya çıkarmıştır (Zaimoğlu ve ark.,1993) (Çizelge 1.2.).
Çizelge 1.2. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin Biyolojik Etkileri (Zaimoğlu ve ark., 1993)
Element Toksisite verileri
Berilyum Hayvan deneyleri pozitif, karsinojen, küçük partiküller halindeyken yüksek derecede toksik
Nikel Hayvan deneyleri pozitif, karsinojen
Krom Hayvan deneylerine göre kesin olmamakla birlikte karsinojen Kalay Tüm organik bileşikleri toksik, elemental kalay düşük
derecede toksik. Havadaki elemental kalaya tolerans sınırı 0,1 mg/m³
Boron Halojen bileşikleri yüksek derecede toksik
Molibden Elemental olarak toksik değil, bileşikleri düşük derecede toksik. Havadaki tolerans sınırı 5 mg/m³
Aluminyum Toksik değil Titanyum Toksik değil
Demir Toksik değil, Havadaki tolerans sınırı 10 mg/m³
İndiyum Düşük derecede toksik. Havadaki tolerans sınırı 0,1 mg/m³ Manganez Element ve bileşik halinde düşük derecede toksik
Tunsten Düşük derecede toksik
İridyum Muhtemelen düşük derecede toksik Silisyum Düşük derecede toksik
Alaşımın biyolojik güvenilirliğini ortaya koyan özelliği, korozyona olan yatkınlık derecesidir (Wataha, 2000). Korozyon genel bir ifade ile, olumsuz çevre koşulları etkisiyle metallerde meydana gelen bozunma olarak tanımlanabilir. Alaşımın aktif ya da soy element içeriği, tek fazlı ya da çok fazlı olabilen mikro yapısı, homojen ya da inhomojen durumu, pasivasyon özelliği gibi yapısal özellikleri, döküm şartları ve bitirme işlemleri, farklı metal alaşımlarla karşılıklı etkileşimleri, bulunduğu ortam korozyon direnci üzerine etkilidir (Akpınar, 2001). Alaşımdan, bu faktörlerden bir veya birkaçı nedeniyle başlangıçta fazla ancak daha sonra pasivasyona bağlı olarak azalan ve sabit bir oranda devam eden element salınımı meydana gelmektedir (Geis-Gerstorfer ve ark., 1991; Wataha ve Lockwood, 1998; Wataha ve ark., 1999a,b,c). Yüzeyde pasif tabakanın oluşması, başlangıçta fazla olan salınımın azalmasına ve yüzeyde korozyona dirençli bölgelerin oluşmasına neden olur. Bu bölgeler herhangi bir etkiyle bozulana dek korozyon oranı düşük bir şekilde seyreder (Geis-Gerstorfer ve ark., 1991).
Dental uygulamalarda kullanılacak alaşımların seçiminde korozyon direnci önemli bir faktördür. Korozyon metalik yapıya zarar verir. Yapılan araştırmaların çoğunda korozyon nedeniyle salınan elementlerin, oral kavitede sert ve yumuşak dokulara penetre olduğu rapor edilmiştir. Korozyon ürünleri bazı bireylerde oral mukozada ülser, lökoplazi gibi lezyonlara, alerjiye, ağız içinde tuzlu metalik tat oluşmasına, deride birtakım döküntülere neden olurlar (Şahin ve ark., 1991).
Alaşım içindeki elementlerin iyonize olmaları korozyona neden olur.
Başlangıçta alaşım içinde yüksüz olan elementler, solüsyon içine bırakıldıklarında pozitif yüklü iyonlar haline gelirler (Wataha, 2000).
Bazı elementlerin alaşımlardan yüksek bir salınım eğilimi vardır. Bu eğilim o elementin kararsızlığı olarak tanımlanır. Bakır, nikel, galyum, çinko ve kadmiyum kararsız elementler olup, kolayca salınma eğilimindedirler (Wataha,
1977; Brune, 1986; Geis-Gerstorfer ve ark., 1991; Zaimoğlu ve ark., 1993).
Ancak çok fazlı alaşımlarda soy metal içeriğinin fazla olması, alaşımdan element salınımını azaltmada etkili değildir (Niemi ve Hensten-Pettersen, 1985;
Wataha ve ark., 1991a).
Element salınımı, elementin ve alaşımın özelliklerine ve hazırlanma şekline ek olarak ağız içi faktörlere de bağlıdır. Olumsuz çevre koşulları, sıcaklık değişimleri, nem varlığı, pH değişimleri, oksijen miktarındaki değişimler, ağza alınan yiyecek ve içeceklerin fiziksel ve kimyasal özellikleri, dental plak, ilaç kullanımı, ısırma kuvvetlerinin miktar ve dağılımındaki değişiklikler, ağızda bulunan diğer metalik restorasyonlarla etkileşim ve diş fırçalama korozyon hızını ve miktarını belirler. Vücut sıvıları ile karşılaşan birçok biomateryal korozyona uğramaktadır (Covington ve ark., 1985; Niemi ve Hensten- Pettersen, 1985; Bergman, 1986; Brune, 1986; Craig ve Hanks, 1988 ; Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve ark, 1991a; Wataha ve ark, 1993a; Zaimoğlu ve ark., 1993; Messer ve Lucas, 1999; Messer ve Lucas, 2000; Wataha ve ark, 2000; Wataha ve ark, 2002).
Korozyon direncini arttırmak için; alaşıma katılan diğer elementlerin yanı sıra Ni-Cr ve Co-Cr alaşımlarına % 16-30 oranında katılan krom, krom oksit adı verilen bir pasivasyon tabakası oluşturmakta ve buna bağlı olarak düşük iyon salınımı meydana gelmektedir (Çetin, 1977; Brune, 1986; Geis-Gerstorfer ve ark., 1991; Zaimoğlu ve ark., 1993).
Biyolojik sıvılara maruz kaldığında alaşım yüzeyinde meydana gelen değişiklikler ve bunun element salınımı ile ilgisi, alaşımın yüzey bileşiminin, hacim bileşiminden daha önemli olduğunu düşündürmektedir. Alaşımın yüzeyden itibaren 5 Aº alttaki bileşimin yüzeyden farklı bulunması, etkilenme derinliğinin önemini gösterir. Buna göre 5 Aº luk kalınlık, element salınımına engel olan veya izin veren tabakadır. Dental döküm alaşımlarındaki her bir element atomunun metalik çapı yaklaşık 3 Aº olduğuna göre, söz konusu 5 Aº
1.2. Biyouyumluluk
Klasik tanımı ile biyouyumluluk, herhangi bir materyalin canlı dokularla temas halinde iken lokal ya da sistemik toksisiteye, alerjik, mutajenik ve karsinojenik etkiye neden olmayan inert özellikleri ile vücudun sert ya da yumuşak dokularında doku reaksiyonu oluşturmamasıdır (Smith, 1982; Bergman, 1986).
Biyouyumluluk bir başka deyişle, materyalin uygulamalar sonrası uygun konakçı doku cevabı oluşturabilme yeteneğidir (Schmalz, 1994).
Vücuda yerleştirilen herhangi bir restorasyon, çevredeki sert ve yumuşak dokuda birtakım değişikliklere yol açar (Smith, 1982). Oral epitel, bağ dokusu, diş sert dokusu ve kemik ile temas eden restorasyonlarda kullanılan metalik materyallere karşı oluşan bu değişiklikler doku reaksiyonu olarak adlandırılır ve materyalin kimyasal yapısına, restorasyonun tasarımı ve elde edilme yöntemlerine, mekanik özellikleri, dokularla olan temasının şekli ve süresine bağlı olarak çeşitli şekillerde ortaya çıkar (Smith, 1982; Wataha, 2000).
1.2.1. Sistemik Etki
Sistemik etki veya toksisite, materyalin vücuda girdikten sonra, kan dolaşımına katılarak hedef bölgeye ulaşmasıyla meydana gelir. Sistemik toksisitede reaksiyon, toksik materyalin uygulandığı bölgeden uzakta meydana gelir (Schmalz, 1998).
Sistemik toksisite ölçüsü LD50 (Letal Doz) değeri ile belirlenir (Çizelge 1.3).
Bu değer, deney hayvanlarının % 50’sini öldüren doz olup, birimi mg / kg dir (Schmalz, 1998; Wataha, 2000).
Çizelge 1.3. LD50 değerine göre toksisite dereceleri (Akpınar,2001) Toksisite Derecesi LD50 (mg / kg)
etkisiz > 15 000
az 5 000 - 10 000
orta 500 - 5 000
çok 50 - 500
şiddetli 5 – 10
süper <5
Diş hekimliğinde kullanılan alaşımlardan salınan elementlerin, vücutta sistemik etki yaptığına dair çok az kanıt vardır. Birçok durumda, dental alaşımı oluşturan elementlerin günlük diyetle alımları (Çizelge 1.4) ile karşılaştırıldığında, dental alaşımdan salınan elementlerin miktarının diyetle alına miktardan çok daha az olması nedeni ile sistemik toksisite oluşmaması sürpriz değildir ( Akpınar, 2001 ).
Çizelge 1.4. Bazı elementlerin diyetle günlük alınım dozları (Wataha, 2000)
Element Doz (µg)
Altın < 7
Civa 20
Gümüş 25
Krom 240
Kobalt 250
Molibden 400
Nikel 300-600
Titanyum 750
Bakır 3110
Çinko 14250
Demir 23250
Alüminyum 9000-36000
1.2.2. Lokal Etki
Lokal etki veya toksisite, toksik materyalin vücuda giriş bölgesinde oluşturduğu reaksiyondur (Hanks ve ark.,1996; Wataha, 2001).
Dental döküm alaşımlarından salınan metal iyonları lokal toksisiteye neden olabilir. Lokal toksisite için gereken konsantrasyon, sistemik toksisite için gereken konsantrasyondan daha düşük olabilir (Wataha, 2000).
Dental döküm alaşımları, lokal dokularla uzun süre sıkı temas halinde olduklarından, alaşımla doku arasında mikro çevre oluşur. Restoratif kronlar genellikle gingival seviyenin altına uzanarak, gingiva ile alaşım arasında bir sulkus oluşturur. Eğer alaşımdaki elementler bu sulkusa salınırlarsa, tükürük ve diğer sindirim sıvılarıyla dilüe olmadıklarından, yüksek konsantrasyona ulaşabilirler (Wataha, 2000).
Metal iyonlarının lokal toksisitesi TC50 (toksik konsantrasyon) değeri ile ölçülür (Çizelge 1.5). Bu değer, hücresel olayların gerçekleşmesinde gereken enerjinin sağlanmasından sorumlu olan mitokondriyal aktiviteyi % 50 oranında azaltan iyon konsantrasyonudur. Metal iyonlarına 24 saat maruz bırakılarak belirlenmiş olan TC50 değerleri, hücre tipine ve toksisite parametresine göre 6 µmol / L’den 3000 µmol / L ‘e kadar değişkenlik gösterir (Wataha, 2000).
Çizelge1.5. Dental döküm alaşımlarına katılan metal iyonlarının TC50
değerleri (Schmalz, 2002)
Metal İyonları TC50
Ag+1 AgNO3 4.8 Au+3 HAuCl4.3H2O 21 Cd+2 CdCl2 10 Co+2 CoCl2.6H2O 100 Cr+3 CrCl2.6 H2O 1790 Cu+2 CuCl2.2 H2O 139 Ga+3 GaCl3 1530 Hg+2 HgCl2 11 In+3 InCl3 2310 Mn+2 MnCl2.4H2O 556 Mo+5 MoCl5 775 Ni+2 NiCl2.6H2O 188 Pd+2 PdCl2 281 Pt+6 H2PtCl6 33 Sn+2 SnCl2.2H2O 3110 Zn+2 ZnCl2 7
Düşük TC50 değerlerine ve yüksek salınma oranına sahip elementler biyolojik açıdan daha zararlıdır. Artan salınım süresi, toksisiteyi arttırırken TC50 değeri azalır. Metal, hücreyle ne kadar uzun süre temas ederse hücrede zararın oluşması için o kadar düşük miktarda metal iyonu gerekir. Bu nedenle, uzun süre boyunca element açığa çıkaran alaşımlar daha fazla lokal toksik etki oluşturmaya eğilimlidirler (Wataha, 2000).
Bir metalin element ya da alaşım formunda olmasının toksik reaksiyonları üzerinde bir etkisinin bulunmadığı sonucuna varılmıştır. Ancak yüzey alanının artması, mekanik preparasyonun şekli, rezidüel streslerin varlığı ve yüzey temizliği gibi bazı lokal faktörlerin kimyasal etkileşimi arttırarak sitotoksik cevabı etkilediği düşünülmektedir. Materyalin partikül boyutu ne kadar küçülürse toksik cevap ihtimali de o derece artar. Bu nedenle dental alaşımın biyolojik uyumluluğuna karar verirken içerdiği elementlerin bilinen toksik
özelliklerine göre değil, alaşımın özelliklerine, hazırlanma şekline ve kompozisyonuna göre karar verilmelidir (Smith, 1982).
1.2.3. Alerjik Etki
Alerji ve aşırı duyarlılık terimleri immün sistemle ilgilidir. İmmün sistemin unsurlarından olan antijen, alerjik reaksiyonu oluşturan proteindir. Antijene ilk maruz kalındığında, antijene karşı organizmayı savunmak amacıyla oluşturulan protein ise antikordur. Bazı durumlarda immün reaksiyonlar, koruyucu ve iyileştirici olmaktan çıkarak doku ve organlar için zarar verici nitelik kazanabilirler. Optimum immün cevabın aksine, antijene karşı organizmanın oluşturduğu bu zarar verici immün cevaba alerji ve aşırı duyarlılık (hipersensitivite) denmektedir (Güven, 1995; Kılıçturgay, 1994).
İmmünolojide bir diğer unsur haptenlerdir. Kimyasal madde yapısındaki haptenler tek başlarına immün cevap meydana getirmeyip, proteinle birleşerek antijenik yapı oluştururlar (Güven, 1995). Metal iyonları organizmada hapten olarak rol oynarlar; protein, nükleik asit ya da karbonhidrat moleküllerine bağlanarak alerjiye yol açarlar (Wataha, 2000).
Alerjik reaksiyonlar sıklıkla toksik reaksiyonlarla karıştırılırlar. Alerjik reaksiyonlar dozdan bağımsız oluşur. Düşük dozlar immün hücreleri aktive ederek alerjik reaksiyon oluştururken toksisiteye yol açmaz (Wataha, 2000).
Toksisiteden farklı olarak alerjik reaksiyonlar ilk karşılaşmada görülmez.
Toksik reaksiyonlar bireyler arası farklılık göstermezken, alerjik reaksiyonlar ayrı bireylerde farklı, ayrıca aynı bireyde değişik zamanlarda değişik etki gösterebilir (Güven, 1995).
1.2.4. Mutajenik ve Karsinojenik Etki
Mutajenite DNA’ nın çift sarmal yapısındaki değişikliktir. Karsinojenite ise
getirememesidir. Karsinojenite mutasyonlar sonucu oluşur; ancak, tüm mutasyonlar karsinojeniteye neden olmaz. Rutin olarak DNA’da birçok mutasyonlar oluşmaktadır. Ancak vücudumuz bu mutasyonları tamir edecek çok çeşitli mekanizmalara sahiptir. Metaller, direkt olarak DNA’da mutasyonlara neden olacak şekilde etki etmezler; ancak, DNA’yı değiştirecek serbest radikallerin oluşmasına neden olabilirler (Wataha, 2000).
Karsinojenite veya mutajenitenin oluşması için alaşımdan element salınımı gereklidir.Bu nedenle, bir metalin karsinojenite veya mutajenite oluşturabilmesi direkt olarak korozyonla ilgilidir. Ayrıca metalin formu da mutajenik aktivitede rol oynar. Örneğin, kromun oksidasyon durumu mutajenik potansiyelini etkiler.
Cr+3 mutajen değilken, Cr+6 mutajen özellik gösterir. Metal iyonun moleküler formu da mutajenitede önemlidir. Nikel iyonları tek başına zayıf mutajenken, nikel subsülfit yüksek seviyede mutajendir (Wataha, 2000).
Restorasyon nedeniyle ağızda kullanılan materyallere karşı gelişen immün- nonimmün, allerjik ve kronik inflamatuar yanıtların değerlendirilebilmesi için araştırmaların, hücresel düzeyde ve moleküler biyolojik yaklaşımlarını da içermesi önem taşımaktadır.
1.3. Dental Materyallerin Biyouyumluluk Değerlendirme Yöntemleri
Dental materyallerin biyolojik uyumluluklarını değerlendirmek için çok sayıda yöntem geliştirilmektedir. Standart değerlendirme metodlarına göre çeşitli metodları kullanarak sonuçlar değerlendirilmeye çalışılmaktadır. Biyolojik uyumluluk testleri,
1- İn vitro testler (Öncül testler )
2- İn vivo hayvan deneyleri (İkincil testler) 3- Kullanım testleri olarak sınıflandırılabilir.
İn vitro testler; materyalin toksik profilini veren testlerdir. Sonuçlarının in vivo koşulların sonuçlarıyla bağıntısının kurulması güç olsa bile, kontrollü olması ve tekrarlanabilirliği ile in vitro hücre kültürü deneyleri, potansiyel biyolojik zararların analizine dayanmaktadır.
İn vivo hayvan deneyleri; değerlendirilecek materyalin subkutan, kas ya da kemik içerisine yerleştirildikten sonra doku cevabının incelenmesine dayanır.
Kullanım testleri; in vitro ve in vivo testlerde güvenilirliği kanıtlanmış bir materyalin insanlarda klinik kullanılımı takiben, materyale karşı gelişen cevapların gözlenmesi esasına dayanır (Browne, 1988; Craig ve Hanks, 1988;
Schmalz, 1988; Phillips, 1991; Hanks ve ark., 1996; Schmalz ve ark, 1996;
Wataha, 1996; Nelson ve ark., 1999a).
1.3.1. İn Vitro Test Yöntemleri
Dental materyallerin olası toksik etkilerinin in vivo değerlendirilmesindeki kısıtlamalar, in vitro test yöntemlerinin geliştirilmesini zorunlu kılmıştır (Browne, 1988).
İn vivo değerlendirme yöntemlerinin doğasından kaynaklanan sorunları içermeyen, kontrollü deney şartlarında yürütülen, tekrarlanabilir ve hızlı sonuç alınabilen in vitro test yöntemleri; aynı zamanda dental materyallerin ağız içerisine uygulanmalarından hemen sonraki kısa periodda meydana getirdikleri toksik etkilerinin gösterilmesinde de önemli rol oynarlar (Browne, 1988;
Schmalz, 1994).
Bununla beraber, in vivo testler ve kullanım testleri karşılaştırılan çalışmalara bakıldığında, in vitro testlerin uygunluğu ile ilgili tartışmalar da vardır. Bu tartışmalar, özellikle in vitro deneylerin nispeten kısa süreli olması üzerinde yoğunlaşmaktadır (Craig ve Hanks, 1988; Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve
aydan uzun süre tutmak mikroorganizmalarla kontaminasyon ve ortam bileşenlerinin azalması gibi nedenlerle uygun değildir (Wataha ve Lockwood, 1998). Kültüre edilmiş hücrelerle ilgili sınırlamalar yüzünden pek çok deney 168 saatten kısadır (Niemi ve Hensten-Pettersen, 1985; Craig ve Hanks, 1988;
Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve Lockwood, 1998; Wataha ve ark., 1999a).
İn vitro biyouyumluluk değerlendirmelerinde sitotoksisite testleri, en yaygın kullanılan test yöntemidir (Hanks ve ark., 1996). Sitotoksisite testleri, test edilecek materyalin, uygun hücre kültüründe, negatif ve pozitif kontrol materyali kullanılarak, hücre büyüme oranı ve hücre ölümü esas alınarak değerlendirme yapılan bir in vitro test yöntemidir (Hensten-Pettersen, 1988;
Kansu, 1991).
Sitotoksisitenin belirlenmesinde kullanılan in vitro test yöntemleri ISO 10993-5 standartlarına göre aşağıdaki gibi sınıflandırılmıştır:
1. Agar diffüzyon testi 2. Filtre diffüzyon testi
3. Direkt temas ya da ekstrakt testi 4. Dentin Bariyer Testi
Aynı standartlara göre özel kullanım alanına sahip testler ise:
1. Akut sistemik toksisite - oral uygulama (ISO 10993-11) 2. Akut sistemik toksisite - inhalasyon yoluyla (ISO 10993-11) 3. Subkronik sistemik toksisite- oral uygulama (ISO 10993-11) 4. Deri irritasyonu ve intrakutanöz reaktivite(ISO 10993-10) 5. Sensitizasyon (ISO 10993-10)
6. Subkronik sistemik toksisite- inhalasyon yoluyla (ISO 10993-11) 7. Genotoksisite (ISO 10993-3)
8. İmplantasyon sonucu lokal etkiler (ISO 10993-6),
Farklı yöntemlere sahip bu sitotoksisite testlerinin her biri üç temel faktöre göre yürütülür:
- Biyolojik sistem - Hücre-materyal teması
- Değerlendirme yöntemi (Schmalz, 1994)
1.3.1.1. Biyolojik Sistem
İn vitro sitotoksisite testlerinde biyolojik sistem olarak hücre kültürleri, organ kültürleri ve hücre organelleri kullanılmaktadır (Schmalz, 1994).
Hücre, içinde çekirdeğin ve diğer organellerin bulunduğu bir sitoplazma kitlesinden oluşmaktadır. Hücrenin % 75–80 ’ini su, % 15’ini protein (yapısal proteinler, enzim ve aminoasitler), % 3’ünü yağ, % 1’ni elektrolitler oluşturur.
Çeşitli dokularda yer alan hücreler yassı, oval, armut, ipliksi ya da çok sayıda uzantılı olarak görülebilirler. Hücrelerin büyüklükleri çaplarıyla ölçülür ve 5-200 μ arasında değişir (Erkoçak, 1983; Tekelioğlu, 1989; Soydan, 1992). Bu yapı içinde, canlılığın devamını sağlayacak tüm fizyolojik ve kimyasal olaylar gerçekleşir.
Hücre organelleri; çekirdek, çekirdekçik, hücre membranı, endoplazma retikulumu, golgi cisimciği, mitokondri, lizozom, ribozom, sitosol, vakuol ve veziküller, granüller ve değişik hücre tiplerine göre bulunan diğer bazı yapıları içerirler.
Çekirdek biyosentez olaylarını kontrol eden informasyonel makromolekülleri (haberci RNA, ribozomal RNA, taşıyıcı RNA) kapsar, hücre metabolizmasında ve fonksiyonunda dolaylı rol oynar.
Çekirdekçik RNA, DNA ve bunlara bağlı proteinlerden oluşmuş membransız bir yapıdır. Profaz sırasında oluşan kromozomların yapısına katılırlar.
Membranlar lipoprotein yapıda olup, hücrenin farklı fonksiyonel bölümlerini birbirinden ayırır. Hücre enzimlerinin çoğu, bu membranlar üzerindedir. Hücre membranı, hücre içi ve dışı ortam arasında farklı yapı ve iyon konsantrasyonunun korunmasını sağlar, seçici geçirgen bir yapıdır. Çekirdek membranı ise sitoplazmayla nükleoplazmayı birbirinden ayırır.
Endoplazma retikulumu, granüllü ve granülsüz olmak üzere iki tiptir.Granüllü endoplazma retikulum protein sentezinde görevlidir.
Golgi cisimciği, endoplazma retikulumunda yapılan salgının toplanıp yoğunlaşarak vezikül ve granüller halinde hücreden boşaltılmak üzere sitosol içine verilmesinde rol oynar.
Mitokondrilerin büyük kısmı protein, geri kalanı lipittir. Hücrenin solunum merkezi ve her çeşit hücre olayı için gerekli enerjinin üretilmesinde görevlidir.
Hücre enzimlerinin % 45-50’ si mitokondride yer alır.
Lizozom, proteolitik enzimleri içeren organellerdir. Normal koşullarda lizozom yüzey membranı, lizozom enzimlerinin sitosol içine geçmesine engel olur. Ölü hücrelerde bu enzimler membranı geçerek sitoplazmaya dağılır.
Ribozom, sitoplazma proteinlerinin sentezinde rol oynarlar. Su, RNA ve proteinden oluşurlar.
Sitosol, hücre iskeletini yapar. Mikrotübülüsler, mikrofilamanlar ve ara filamanlardan oluşan üç tip lif grubunu içerir. Bu yapılar, hücrenin şeklinin korunması, hücresel hareketlerin düzenlenmesi, hücre içi organel ve vezikül taşınması gibi fonksiyonlara sahiptir (Darnell ve ark., 1990).
Vakuol ve veziküller membran ile sınırlanmiş sitoplazma boşluklarıdır.
Granüller, içerisinde bazı maddelerin toplandığı, yoğunluğu değişken olan
Doku; belli bir faaliyeti yapmak üzere, aynı yapısal özelliklere sahip hücrelerin bir araya gelmesi ile oluşan yapıdır. Görünüş, yapı ve fonksiyon bakımından 4 tip doku mevcuttur. Bunlar; epitel dokusu, bağ doku, kas dokusu ve kemik dokusudur.
Bağ dokusunun sabit ve en çok bulunan hücreleri fibroblastlardır. İnaktif fibroblastlara fibrosit denir. Fibroblastlar protein ve mukopolisakkarit sentezi yaparak, bağ dokusu liflerini ve hücreler arası maddeyi meydana getirirler.
İltihap bölgeleri, yara yerleri ve çeşitli patolojik etkenlere bağlı doku harabiyeti
bölgelerinde yeni bağ dokusu yapımı fibroblastlar tarafından sağlanır (Erkoçak, 1983).
Hücrelerin ya da dokuların hipertrofi, atrofi gibi geri dönüşümü olan ve nekroz (denetimsiz hücre ölümü) ve apopitoz (programlı hücre ölümü) gibi geri dönüşümü olmayan değişik fizyolojik durumları vardır.
Nekroz; hipoksi, aşırı ısı değişiklikleri, toksinler gibi daha çok hücre dışından gelen çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenler sonucunda gelişen travmatik hücre ölümüdür. Apopitoz ise yaşlanmış, fonksiyonunu yitirmiş, düzensiz gelişmiş veya genetik olarak hasarlı hücrelerin, organizma için güvenli bir şekilde yok edilmelerini sağlayan ve genetik olarak kontrol edilen programlı hücre ölümüdür. Nekroz patolojik bir olaydır. Apopitoz ise fizyolojik veya patolojik uyaranlarla oluşabilir (Öztürk, 2002). Fizyolojik olayların meydana gelmesinden önce ortaya çıkabilecek hücre içi metabolik aktivitelerin şiddeti oldukça önemlidir.
Kültür hücreleri, dental materyallerin sitotoksisite değerlendirmelerinde en yaygın olarak kullanılan biyolojik sistemdir. Kültür hücreleri ya ticari olarak kültürlerden elde edilen hücre dizileri ya da doku parçalarından izole edilen hücrelerden elde edilmektedir (Schmalz, 1994). Bu hücre dizilerine insan pulpa, gingiva, deri hücreleri, periodontal membran, embriyo akciğer hücresi,
(HeLa), mürin hücre dizileri (C3H-L, Balb/c 3T3, L929), T-Lenfosit hücresi, maymun, tavşan, öküz pulpa hücreleri, hamster ve maymun yanak epitel hücresi ve Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücresi (VERO) örnek gösterilebilir. Bu hücreler biyouyumluluğu değerlendirilen materyale karşı ölçülebilir ve kolay gözlemlenebilir reaksiyonlar meydana getirirler (Wataha ve ark., 1994a; Cenni ve ark., 1999).
Dental materyallerin in vitro hücre kültürü testlerinde kullanılmak üzere ISO 10993-5:1999 ( E )’ de önerilen hücreler ise; American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929 fare fibroblast hücresi (Woody ve ark., 1977;
Wennberg, 1988; Wataha ve ark, 1994a; Schedle ve ark., 1995; Schmalz ve ark., 1998; Wang ve Li, 1998; Sjögren ve ark., 2000), CCL 163 (Balb/c 3T3 clone A31 fare embriyo fibroblast hücresi) (Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve ark, 1992a; Wataha ve ark, 1993a; Wataha ve ark, 1994a,b; Wataha ve ark, 1995a,b; Nelson ve ark, 1999a,b; Wataha ve ark, 1999a,b,c; Nelson ve ark., 2001; Wataha ve ark, 2002a; Al-Hiyasat ve ark, 2002; Al-Hiyasat ve ark, 2003a,b; Al-Hiyasat ve ark, 2005), CCL 171 (MRC-5, insan embriyo akciğer fibroblast hücresi), CCL 75 (WI-38, insan embriyo akciğer fibroblast hücresi) (Wataha ve ark, 1994a), THP-1 insan monosit makrofajları (Wataha ve ark, 1995c; Wataha ve ark, 1996; Edwards ve ark., 1998; Wataha ve ark, 1999a;
Wataha ve ark, 2000; Wataha ve ark, 2002b; Heil ve ark., 2002), insan epitelyal hücreleri (Niemi ve Hensten-Pettersen, 1985; Exbrayat ve ark., 1987;
Wennberg, 1988), insan mast hücreleri (Schedle ve ark., 1995), CCL 81 (VERO [Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücresi]), CCL 10 [(BHK-21) C-13 hamster böbrek fibroblast hücresi] ve V-79 379A (Çin fare karaciğer fibroblast hücresi), ROS 17/2.8 (Wataha ve ark, 1994a), P338D1 fare makrofajları (Wataha, 1995c), NIH 3T3 fibroblastları (Hornez ve ark., 2002 ), L132 (Hornez ve ark., 2002), KB hücre dizisi (Huang ve ark, 2001) dir.
Hücre kültürlerinin kullanıldığı test sistemlerinde hücre tipleri; mortal (sonlu, primer, diploid) hücre kültürleri ve immortal (ölümsüz, devamlı) hücre
Primer hücreler, laboratuarlarda doku eksplantlarından elde edilirler, yavaş büyürler ve yaşam süreleri sınırlıdır (Schmalz, 1994). Spesifik metabolik potansiyele sahip olduklarından in vivo şartlara daha yakın deney koşulları sağlarlar (Arenholt-Bindslev ve Blegg, 1990).
Devamlı hücre kültürleri, standart kültür örnekleri olan embriyonik veya malignant hücrelerden üretilerek standardize edilmiş ve kodlanarak kullanıma hazırlanmışlardır (Browne, 1988; Schmalz, 1994). Primer hücrelere göre daha basit şekilde çoğalırlar ve uygun şekilde pasajlandıkları sürece sınırsız yaşam süresine sahiptirler (Schmalz, 1994).
1.3.1.2. Hücre-Materyal Teması
İn vitro sitotoksisite testlerinde hücre-materyal teması; direkt veya indirekt şekilde materyalin kendisinin veya materyal yapısından salınan bileşenlerin kullanılması ile sağlanmaktadır.
Direkt hücre-materyal teması uygulanan testlerde hücreler materyalin yanında veya üzerinde bulunurlar (Wennberg ve ark., 1979; Schmalz, 1988). Bu testler dişeti, pulpa, periapikal dokular gibi canlı dokularla temas halinde bulunan dental materyallerin etkilerini taklit etmek amacıyla düzenlenirler (Schmalz, 1994).
İndirekt temas testlerinde materyal ve hücreler bir bariyer yardımıyla ayrılmışlardır. Bu testler, dolgu maddelerinin canlı dokulardan dentin veya smear tabakası gibi bir bariyer ile ayrıldığı durumları taklit edebilmek için kullanılır. Bu sistemde agar, agaroz veya selüloz asetat filtre gibi maddeler bariyer olarak kullanılır (Schmalz, 1994).
Hücre-materyal temasını sağlamanın bir başka yolu, dental materyallerin belirli bir zaman periodu boyunca, besi ortamı gibi sıvı bir ortamda bekletilmesi ve testlerde materyalin kendisi yerine bu sıvının kullanılmasıdır (Akpınar, 2001).
İn vitro hücre kültürü deneylerinde, hücrelerin yaşatılması için açık ya da kapalı sistem inkübatörü kullanılmaktadır.
Açık sistemde kültür ortamı ile inkübatör içindeki hava ilişkidedir. Ortama, sisteme bağlı bir tüpten CO2 gelir. Hücrelerin yaşatılması için gerekli 37 ºC lik,
% 5 CO2 li, % 95 nemli ortam sağlanmış olur. Uzun süreli kültürlerde mutlaka açık sistem inkübatörü kullanılmalı ve metabolizma artıklarının uzaklaştırılması için kültür vasatı birkaç gün arayla yenilenmelidir.
Kapalı sistemde, kültür kaplarının ağzı hava almayacak şekilde sıkıca kapatılır.
Bu yüzden ortama CO2 verilmesine ihtiyaç yoktur. Kısa süreli kültürlerde kullanılır.Hücreler kültür kaplarına aseptik şekilde ekildikten sonra, kültür vasatı ilave edilir. Kültür vasatının besleyici madde karışımını proteinler, vitaminler, tuzlar, büyüme faktörleri, glikoz, metabolitler, mineraller, polipeptitler, organik maddeler ve inhibitörler oluşturur. Mikrobiyal gelişimi engellemek için antibiyotikler ve antifungal ilaçlar katılır. Bu amaçla pek çok hücre kültürü çalışmasında hücre çoğalma periodu sırasında fetal ya da yeni doğan calf serumu kullanılmaktadır (Erkoçak, 1983; Hensten-Pettersen, 1988;
Akpınar, 2001).
1.3.1.3 Değerlendirme Yöntemleri
Sitotoksisite değerlendirme testlerinde, hücre morfolojisinde, hücre membranında , hücre aktivitesindeki ya da değişikliklere hücre proliferasyon oranlarındaki değişiklere göre değerlendirme yapılabilmektedir (Schmalz, 1994).
Hücre aktivitesini değerlendiren test sistemlerinde bir enzim ya da enzim grubunun veya bir maddenin ölçülmesi ile değerlendirme yapılmaktadır (Schmalz,1994).
Sitoplazmik bir enzim olan LDH (Laktat Dehidrojenaz), membran bütünlüğüne zarar verebileceğinden membran bütünlüğünün değerlendirildiği testlerde kullanılmaktadır (Messer ve Lucas, 1999).
Mitokondriyal aktivitenin incelenmesiyle hücre canlılığının değerlendirilmesinde, SDH (Süksinik Dehidrojenaz) enziminin ölçülmesine yönelik MTT (3-{4,5-dimethylthiazol-2-yl}-2,5-diphenyltetrazolium bromide) testi (Wataha ve ark., 1992a; Wataha ve ark., 1993a; Wataha ve ark., 1994a,b;
Wataha ve ark., 1995a,b,c; Schmalz ve ark., 1998; Wataha ve ark., 1999a,b,c;
Nelson ve ark., 1999a,b; Sjögren ve ark, 2000; Huang ve ark., 2001; Heil ve ark., 2002; Wataha ve ark., 2002a,b; Al-Hiyasat ve ark, 2002; Al-Hiyasat ve ark, 2003a,b; Al-Hiyasat ve ark, 2005); protein sentezi (Wataha ve ark, 1995;
Messer ve Lucas, 1999), RNA ve DNA sentezi (Messer ve Lucas, 1999);
nötral kırmızının lizozom içine alınmasıyla lizozomal aktivitenin değerlendirilmesi (Messer ve Lucas, 1999); lusiferin- lusiferaz reaksiyonu esnasında salınan fotonların ölçülmesi ile intrasellüler ATP seviyesinin değerlendirilmesi (Messer ve Lucas,1999) hücre aktivitesini belirleyen testlere örnek olarak verilebilir.
Materyallere karşı gelişen inflamatuar ve immün reaksiyonlar da, sitotoksisite değerlendirmelerinde kullanılmaktadır (Wataha ve ark., 1996; Edwards ve ark., 1998; Wataha ve ark., 2000)
Tüm sitotoksisite testlerinde takip aralığı, bitiş noktası ve kayıt metodu seçimlerinde, hedeflenen veriye bağlı olarak modifikasyonlar yapılmaktadır (Schmalz, 1994).
1.4. Spektrofotometri
Spektrofotometri; ışığın dalga boyu fonksiyonu olarak, bir cisim tarafından geçirilen ya da yansıtılan radyant enerjinin ölçümüdür.
Spektrofotometre moleküller tarafından absorbe edilen radyant ışık enerjisinin miktarını ölçen cihazdır. Spektrofotometrelerin görünür ışık (380 -760 nm), ultraviole (190-1100 nm) ve infrared dalga boylarında ölçüm yapabilme özelliklerine sahip çeşitleri bulunmaktadır.
Spektrofotometrenin 5 temel komponenti; ışık kaynağı, prizma ya da dağıtma ızgarası, açıklık, dedektör (fotoelektrik tüpü) ve sonuçları okuyup kaydeden dijital sayıcıdır.
Işık ışınları, prizma ya da dağıtma ızgarasından yansıtıldıktan sonra dalga boylarına ayrılarak birbirlerinden uzaklaşırlar. Işınlar, açıklıktan geçtikten sonra fotoelektrik tüpüne ulaşır ve tüpe çarpan fotonların sayısıyla orantılı olarak bir elektrik akımı oluşur. Fotoelektrik tüpüne eğer bir dijital sayıcı bağlı ise elektrik akım değerleri ışık geçirgenliği yüzdesi ya da optik dansite birimleri olarak ölçülüp kaydedilebilir (Louisiana State University, 2007).
Optik dansite, geçen ışığın miktarının ölçümüyle bir materyaldeki maddenin rölatif miktarının ölçülmesini ifade eder (Wikipedia, 2007).
1.5. Amaç
Dental alaşımlarda ekonomik şartları düşürme, daha gelişmiş mekanik özellik ve üstün biyolojik güvenilirlik gerekliliği günümüzde hala materyaller üzerindeki çalışmaların sürdürülmesine neden olmaktadır. Dental materyallerin kimyasal yapılarının komplike oluşu ve özellikle biyolojik problemleri materyal teknolojisini üzerinde ileri çalışmaları gerektirmektedir. Teknolojik gelişmeler diş dokularının sağlığının ve bütünlüğünün korunması için yeni yöntemlerin bulunmasını zorunlu kılmaktadır. Diş hekimliğinde materyallerin sıklıkla kullanım gerekliliği materyal-canlı doku arası ilişkinin uyumlu olmasını gerektirmektedir.
Protetik restorasyonlarda kullanılan materyallerin bileşimlerinde bulunan elementlerinin metalurjik yapılarında diğer elementlerle etkileşimleri veya bulundukları ortam değişiklikleri nedeniyle korozyona uğrayıp stabil özellik gösterememesi, canlı doku-materyal ilişkisinin incelenmesini zorunlu kılar.
Dental alaşımların biyolojik etkileri, çoğunlukla materyalin, canlı hücre dizileri ile direkt temasta olduğu hücre kültürü ortamlarında sitotoksisite incelemeleri ile araştırılmaktadır.
Bu bilgilerin ışığı altında çalışmamızda, yüzey pürüzlülüğü, metal iyon konsantrasyonu ve sürenin canlı doku-materyal arasında önemli olduğu hipotezi ile bir metal alaşımı ve alaşımları oluşturan elementlerin iyon hallerinin canlı doku-materyal arası ilişkisinin belli sürelerde ortaya konması amaçlanmıştır. Hücre kültürü ortamında kumlanmış ve parlatılmış bir temel metal (Ni-Cr) alaşımı ile alaşımların yapısına katılan Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be elementlerinin değişik konsantrasyonlarda çözeltileri kullanılarak L929 fare fibroblast hücrelerinin 24. ve 72. saatlerde metabolik aktivitesi spektrofotometrik analizler ile ortaya konmuştur. Hücrelerin canlılığını biyolojik açıdan değerlendiren bulgularımızın, materyal teknolojisi üzerine katkıda bulunacağı düşünülmektedir.
2. GEREÇ ve YÖNTEM
Dental alaşım ve alaşımların yapısına giren elementlerin hücresel metabolizma üzerine etkisini in vitro hücre kültürü ortamında hücre canlılığını inceleyerek değerlendirmeyi amaçlayan çalışmamız, Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Protetik Diş Tedavisi Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı ve Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü laboratuarlarında yürütüldü.
2.1. Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması
Derişik ve seyreltik konsantrasyonlarda metal iyon çözeltilerinin hazırlanabilmesi için ticari olarak satın alınan (Resim 2. 1 ve Resim 2.2) Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be metal iyon tuzları (Riedel-de Haën, Sigma-Aldrich GmbH Seelze, Germany) kullanıldı.
Resim 2.1. Ticari metal tuzları
Resim 2.2. Metal iyon tuzları
Bu metal tozları, derişik ve seyreltik konsantrasyonlar için 1000 ml su içine ölçülerek konuldu. Ni, Cr, Co, Cu, Zn, Mo metal iyonları klorid çözeltisinden elde edilirken, Ag ve Be iyonları sülfat çözeltisinden hazırlandı.
Çalışmamızda kullanılan metal iyonları, hazırlanan çözeltiler, derişik ve seyreltik konsantrasyonları Çizelge 2.1.’ de gösterilmektedir.
Çizelge 2.1. Metal iyonları, hazırlanan çözeltiler ve konsantrasyonlar Metal
İyonları
Çözeltiler Konsantrasyonlar (µmol/ L)
Ni+2 NiCl2.6H2O 10 - 500
Cr+3 CrCl3.6H2O 10 - 2000
Co+2 CoCl2.6H2O 10 - 200
Ag+1 Ag2SO4 1 - 20 Cu+2 CuCl2.2H2O 10 - 500 Zn+2 ZnCl2.6H2O 1 - 50
Mo+5 MoCl5 10 - 1000
Be+2 BeSO4.4H2O 10 - 500
2.2. Metal Örneklerin Hazırlanması
Çalışmamızda, Çizelge 2.2.’de içerdiği elementlerin ağırlık yüzdeleri belirtilen Ni-Cr temel metal alaşımının (Wiron 99 [Bego, Bremen, Germany]) (Resim 2.3) sitotoksik değerlendirmeleri yapıldı.
Çizelge 2.2. Ni-Cr temel metal alaşımı içindeki elementler ve ağırlık yüzdeleri Cr Ni Mo Fe Si C Ce Nb 22.5 65.0 9.5 0.5 1.0 0.02 0.5 1.0
Resim 2.3. Ni-Cr (Wiron 99) metal alaşımı
Temel metal alaşımı örnekleri, ISO 10993-5 standardına göre sitotoksisite deneyleri için uygun olan 5 mm çapında ve 2 mm yüksekliğinde, ortasında 1 mm çap ve 7 mm yüksekliğinde tutucu kısım bulunan pirinç metal örneklerden (Resim 2.4) hazırlandı.
Resim 2.4. Pirinç metal örneği
Bu pirinç modelden silikon esaslı elastomerik ölçü maddesi (Panasil Contact Plus-PC-Kettenbach, Eschenburg, Germany) kullanarak 32 adet mum örnek hazırlandı. Mum eritme tekniği ile, Unicast (VOP Co., Botevgrad, Bulgaristan) indüksiyonlu döküm makinesinde, üretici firma tarafından önerilen eritme ve döküm ısıları kullanılarak, metal örnekler hazırlandı. Hazırlanan 32 metal örnekten 16 tanesine bilinen tesviye ve parlatma işlemleri yapıldı. Geri kalan 16 örneğe ise, tesviye işlemini takiben 250 µm’lik Al2O3 ile kumlama uygulandı.
Örnek yüzeylerindeki kalıntıları uzaklaştırmak için % 70’lik etanol içerisinde 15 dakika ultrasonik temizleme yapıldı. Örnekler distile suyla durulandıktan sonra, otoklavda (Heraeus Ins) 125 ºC’ de 30 dakika steril edilip, 72 saat 40 ºC’de etüvde (Heraeus Ins) kurumaya bırakıldı.
2.3. Hücre Kültürünün Hazırlanması
İn vitro sitotoksisite incelemelerinde hücre kültürü, canlı hücre ve bu hücrelerin gelişiminin devam ettirileceği ortamın konulduğu 96 göz hücre kültürü tabletlerinde ( Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) yürütüldü.
Deneylerde L929 fare fibroblast hücreleri (NCTC clone 929, ATCC CCL1, American Type Culture Collection, Rockville Md.) kullanıldı ve kullanılacak düzeye çoğaltılmaları amacıyla subkültürleri yapıldı.
Hücre kültürünün hazırlanması için öncelikle hücre kültürü tabletlerinin herbir gözüne 80.000 / ml olacak şekilde hücreler konuldu. Tabletlere hücrelerin canlılıklarını devam ettirilebilmesi için DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, pH 7.4, Sigma, USA), % 10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve kristalize streptomisin sülfat 100 ml / 2 gr, kristalize penisilin G potasyum 100 ml / 2 milyon IU ilave edilerek 37 ºC’ de % 5 CO2’li ve % 97 nemli ortamda 24 saat inkübe edildi.
2.4. Deney
İnkübasyonu takiben derişik ve seyreltik konsantrasyonlarda hazırlanan metal iyon çözeltileri, 2 nm’ lik enjektör filtreden süzüldükten sonra her bir göze 100 µL hacimde olacak şekilde hücre kültürü tableti gözlerine ayrı ayrı konuldu (Resim 2.5). Seyreltik ve derişik metal iyon çözeltisi için hücre kültürü tabletinde 64 göz kullanıldı. Metal iyon çözeltilerinin derişik ve seyreltik konsantrasyonları 24. ve 72. saatler için 4 ayrı hücre kültürü tabletinde yürütüldü. Kontrol grubu için hazırlanan 8 göze metal iyon çözeltisi konulmadı.
Resim 2.5. Metal iyonu çözeltileri yerleştirilmiş 96 göz hücre kültürü tableti
Canlı hücre-metal iyon temasının 24. ve 72. saatleri sonunda sıvı ortam uzaklaştırılarak hücreler % 10’luk formaldehit ile fikse edildi. Daha sonra yıkanan hücreler kristal viyole (Merck, Germany) ile 20 dakika süresince boyandı. Boyama sonunda tekrar yıkanan hücre kültürü tabletlerinin gözlerine, her bir göze 100 µl olacak şekilde % 70’ lik etil alkol ilave edilip oda ısısında 5 dakika bekletilerek incelemeler yapıldı (Resim 2.6).
Resim 2.6. Metal iyon çözeltileri ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış hücreler
Hücre kültürü tabletlerinde kristal viyole ile boyanan canlı hücrelerin optik dansitesi spektrofotometrede (ELISA; Multiscan Plus, Helsinki, Finland) 492 nm dalga boyu kullanılarak değerlendirildi (Resim 2.7).
Resim 2.7. Spektrofotometre
Parlatılmış ve kumlanmış metal örnekler ile yürütülen deneylerde metal örnekler, 24 göz hücre kültürü tabletinin her gözüne 0.5 mL olacak şekilde hücre içermeyen DMEM içerisine yerleştirilip (Resim 2.8) 72 saat boyunca, 37 ºC’ de % 5 CO2 içeren etüvde bekletildi. Kumlanmış ve parlatılmış metal örnekler için hücre kültürü tabletinde ayrı ayrı 8 göz kullanıldı. Metal örneklerin incelenmesi 24. ve 72. saatler için 2 ayrı hücre kültürü tabletinde yürütüldü. Kontrol grubu için hazırlanan gözlere metal örnek konulmadı.
Resim 2.8. Metal örnekler yerleştirilmiş 24 göz hücre kültürü tableti
Metal örnekler, 72 saat sonunda hücre kültürü tabletlerinden uzaklaştırıldıktan sonra tabletlerde kalan DMEM solusyonu, içinde 24 saat boyunca inkübe edilmiş L929 hücreleri bulunan 96 göz hücre kültürü tabletlerindeki DMEM alındıktan sonra her göze 100 µL olacak şekilde konuldu.
Kumlanmış ve parlatılmış metal örnekler için de, 24. ve 72. saat sonunda metal iyon çözeltileri için izlenen protokol (Resim 2.9) uygulanarak, spektrofotometrik ölçümle optik dansite değerlendirildi.
Resim 2.9. Metal örnekler ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış hücreler
Sonuçlar, istatistiksel olarak Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı’nda değerlendirildi. Seyreltik ve derişik farklı metal iyon konsantrasyonlarının, ayrıca parlatılmış ve kumlanmış farklı yüzey özellikleri taşıyan Ni-Cr temel metal alaşımının 24. ve 72. saat sonunda, L929 fare fibroblast hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkilerinin sonuç verileri, parametrik test yöntemlerinin gerektirdiği ön şartlar yerine getirilmediği için parametrik olmayan test yöntemleri kullanılarak analiz edildi. Verilerin analizi Kruskal- Wallis Varyans analizi, Wilcoxon Testi, Mann-Whitney U Test ve ikili olarak çoklu karşılaştırma testi ile ortaya konuldu.
3.BULGULAR
Çalışmamızda bulgular, parlatılmış ve kumlanmış bir temel metal alaşımı (Ni-Cr) ve temel metal alaşımları yapısına katılan Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be elementlerinin derişik ve seyreltik konsantrasyondaki çözeltilerinin, hücre kültürü ortamında L929 fare fibroblastları üzerine 24. ve 72. saatler sonundaki etkileri, spektrofotometrik analiz ile elde edilen optik dansite verileri ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi.
Temel metal alaşımının sitotoksisite bulguları Çizelge 3.1 ve Şekil 3.1’ de görülmektedir.
Çizelge 3.1. Kumlanmış ve parlatılmış metal örneklerin bulunduğu ortamdaki hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerleri
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
24 saat 72 saat
süre
hücre canlılığı
kumlanmış parlatılmış kontrol grubu
Şekil 3.1. Kumlanmış, parlatılmış metal örneklerin bulunduğu ortamdaki hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları canlılık sonuçları
Kumlanmış metal Parlatılmış metal Kontrol grubu p 24 saat ,624 (,545- ,698) ,709 (,604-,755) ,796 (,769-,894) < 0,05 72 saat ,248 (,230-,267) ,281 (,244-,287) ,360 (,353-,381) < 0,05
Her iki sürede kumlanmış, parlatılmış örnekler ve kontrol gruplarının karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis Varyans analizi kullanıldı. Kruskal-Wallis varyans analizi sonucu elde edilen p değeri anlamlı bulunduğunda, hangi grupların birbirinden farklı olduğunu bulmak için gruplar ikili olarak çoklu karşılaştırma testi ile karşılaştırıldı.
Ni-Cr alaşım bulgularını incelediğimizde;
24 saatlik sürede kumlanmış ve parlatılmış Ni-Cr alaşımının hücre canlılığı üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Kumlanmış metal alaşımı (,624), parlatılmış metal alaşımının (,709), ortaya koyduğu bu canlı hücre değerlendirmelerinin kontrol grubu (,796), ile karşılaştırılmasında çıkan sonuç istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0,05).
72 saatlik süre içinde parlatılmış (,281) ve kumlanmış (,248) Ni-Cr alaşımının hücre ölümü üzerinde daha etkili olduğu görülürken, kontrol grubu (,362) ile de istatistiksel fark yarattığı gözlenmiştir (p< 0,05).
Kumlanmış ve parlatılmış örnekler ve kontrol grupları için 24 ve 72 saatlerindeki canlılık değerleri arasındaki karşılaştırmalar Wilcoxon testi kullanılarak yapıldı. Buna göre; sürenin hücre ölümü üzerinde etkin olduğu, metal örnekler ile elde edilen sonuçlar ile kontrol grubu arasında sitotoksisite açısından belirgin değişiklik bulunduğu gözlenmiştir (p< 0,05).
Sonuç olarak sitotoksisite üzerinde süre ve yüzey özelliği, ortaya koyduğu istatistiksel farklar ile önemli faktörlerdir.
Metal iyon çözeltileri ile yapılan incelemede elde edilen bulgular Çizelge 3.2’
de görülmektedir.
Metal iyonlarının seyreltik çözeltilerinin her iki sürede ortaya koydukları canlılık değerleri ile derişik çözeltilerin ortaya koydukları canlılık değerleri arasındaki karşılaştırma Wilcoxon testi kullanılarak yapıldı.
Metal iyonlarının seyreltik ve derişik konsantrasyonlarının hücre canlılığı üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Derişik konsantrasyon ve artan sürenin hücre ölümü üzerinde daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır.
Çizelge 3.2. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları ortalama canlılık değerleri
Metal İyonu Konsantrasyon 24 saat 72 saat p
seyreltik ,302 ,164 ,012
Nikel
derişik ,113 ,055 ,012
seyreltik ,303 ,164 ,012
Krom
derişik ,106 ,110 ,041
seyreltik ,242 ,226 ,107
Kobalt
derişik ,161 ,055 ,012
seyreltik ,248 ,112 ,012
Gümüş
derişik ,050 ,055 ,062
seyreltik ,296 ,160 ,012
Bakır
derişik ,049 ,052 ,012
seyreltik ,325 ,189 ,012
Çinko
derişik ,129 ,069 ,012
seyreltik ,359 ,270 ,012
Molibden
derişik ,269 ,157 ,012
seyreltik ,235 ,137 ,012
Berilyum
derişik ,076 ,059 ,017
seyreltik ,354 ,293 ,012
Kontrol grubu
derişik ,370 ,316 ,018
Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be iyon çözeltilerinin seyreltik konsantrasyonlarının 24 saatlik süre sonunda hücre sitotoksisitesi üzerinde ortaya koydukları değerlerle, etkili oldukları gözlenmiştir (Çizelge 3.2, Şekil 3.2).
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
seyreltik derişik
konsantrasyon
hücre canlılığı
Ni Cr Co Ag Cu Zn Mo Be kontrol grubu
Şekil 3.2. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu hücrelerin ve kontrol grubunun 24. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri
Aynı elementlerin seyreltik çözeltilerinin artan süre (72 saat) ile de artmış değerlerde hücre ölümüne sebep oldukları sonucuna ulaşılmıştır (Çizelge 3.2, Şekil 3.3). Her iki süre için her elementin seyreltik konsantrasyonlarının kontrol grubu ile karşılaştırılmalarında elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak anlamlıdır (p< 0,05).
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
seyreltik derişik konsantrasyon
hücre canlılığı
Ni Cr Co Ag Cu Zn Mo Be kontrol grubu
Şekil 3.3. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu hücrelerin ve kontrol grubunun 72. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri
