Deney

İnkübasyonu takiben derişik ve seyreltik konsantrasyonlarda hazırlanan metal iyon çözeltileri, 2 nm’ lik enjektör filtreden süzüldükten sonra her bir göze 100 µL hacimde olacak şekilde hücre kültürü tableti gözlerine ayrı ayrı konuldu (Resim 2.5). Seyreltik ve derişik metal iyon çözeltisi için hücre kültürü tabletinde 64 göz kullanıldı. Metal iyon çözeltilerinin derişik ve seyreltik konsantrasyonları 24. ve 72. saatler için 4 ayrı hücre kültürü tabletinde yürütüldü. Kontrol grubu için hazırlanan 8 göze metal iyon çözeltisi konulmadı.

Resim 2.5. Metal iyonu çözeltileri yerleştirilmiş 96 göz hücre kültürü tableti

Canlı hücre-metal iyon temasının 24. ve 72. saatleri sonunda sıvı ortam uzaklaştırılarak hücreler % 10’luk formaldehit ile fikse edildi. Daha sonra yıkanan hücreler kristal viyole (Merck, Germany) ile 20 dakika süresince boyandı. Boyama sonunda tekrar yıkanan hücre kültürü tabletlerinin gözlerine, her bir göze 100 µl olacak şekilde % 70’ lik etil alkol ilave edilip oda ısısında 5 dakika bekletilerek incelemeler yapıldı (Resim 2.6).

Resim 2.6. Metal iyon çözeltileri ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış hücreler

Hücre kültürü tabletlerinde kristal viyole ile boyanan canlı hücrelerin optik dansitesi spektrofotometrede (ELISA; Multiscan Plus, Helsinki, Finland) 492 nm dalga boyu kullanılarak değerlendirildi (Resim 2.7).

Resim 2.7. Spektrofotometre

Parlatılmış ve kumlanmış metal örnekler ile yürütülen deneylerde metal örnekler, 24 göz hücre kültürü tabletinin her gözüne 0.5 mL olacak şekilde hücre içermeyen DMEM içerisine yerleştirilip (Resim 2.8) 72 saat boyunca, 37 ºC’ de % 5 CO2 içeren etüvde bekletildi. Kumlanmış ve parlatılmış metal örnekler için hücre kültürü tabletinde ayrı ayrı 8 göz kullanıldı. Metal örneklerin incelenmesi 24. ve 72. saatler için 2 ayrı hücre kültürü tabletinde yürütüldü. Kontrol grubu için hazırlanan gözlere metal örnek konulmadı.

Resim 2.8. Metal örnekler yerleştirilmiş 24 göz hücre kültürü tableti

Metal örnekler, 72 saat sonunda hücre kültürü tabletlerinden uzaklaştırıldıktan sonra tabletlerde kalan DMEM solusyonu, içinde 24 saat boyunca inkübe edilmiş L929 hücreleri bulunan 96 göz hücre kültürü tabletlerindeki DMEM alındıktan sonra her göze 100 µL olacak şekilde konuldu.

Kumlanmış ve parlatılmış metal örnekler için de, 24. ve 72. saat sonunda metal iyon çözeltileri için izlenen protokol (Resim 2.9) uygulanarak, spektrofotometrik ölçümle optik dansite değerlendirildi.

Resim 2.9. Metal örnekler ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış hücreler

Sonuçlar, istatistiksel olarak Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı’nda değerlendirildi. Seyreltik ve derişik farklı metal iyon konsantrasyonlarının, ayrıca parlatılmış ve kumlanmış farklı yüzey özellikleri taşıyan Ni-Cr temel metal alaşımının 24. ve 72. saat sonunda, L929 fare fibroblast hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkilerinin sonuç verileri, parametrik test yöntemlerinin gerektirdiği ön şartlar yerine getirilmediği için parametrik olmayan test yöntemleri kullanılarak analiz edildi. Verilerin analizi Kruskal-Wallis Varyans analizi, Wilcoxon Testi, Mann-Whitney U Test ve ikili olarak çoklu karşılaştırma testi ile ortaya konuldu.

3.BULGULAR

Çalışmamızda bulgular, parlatılmış ve kumlanmış bir temel metal alaşımı (Ni-Cr) ve temel metal alaşımları yapısına katılan Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be elementlerinin derişik ve seyreltik konsantrasyondaki çözeltilerinin, hücre kültürü ortamında L929 fare fibroblastları üzerine 24. ve 72. saatler sonundaki etkileri, spektrofotometrik analiz ile elde edilen optik dansite verileri ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi.

Temel metal alaşımının sitotoksisite bulguları Çizelge 3.1 ve Şekil 3.1’ de görülmektedir.

Çizelge 3.1. Kumlanmış ve parlatılmış metal örneklerin bulunduğu ortamdaki hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerleri

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

24 saat 72 saat

süre

hücre canlılığı

kumlanmış parlatılmış kontrol grubu

Şekil 3.1. Kumlanmış, parlatılmış metal örneklerin bulunduğu ortamdaki hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları canlılık sonuçları

Kumlanmış metal Parlatılmış metal Kontrol grubu p 24 saat ,624 (,545- ,698) ,709 (,604-,755) ,796 (,769-,894) < 0,05 72 saat ,248 (,230-,267) ,281 (,244-,287) ,360 (,353-,381) < 0,05

Her iki sürede kumlanmış, parlatılmış örnekler ve kontrol gruplarının karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis Varyans analizi kullanıldı. Kruskal-Wallis varyans analizi sonucu elde edilen p değeri anlamlı bulunduğunda, hangi grupların birbirinden farklı olduğunu bulmak için gruplar ikili olarak çoklu karşılaştırma testi ile karşılaştırıldı.

Ni-Cr alaşım bulgularını incelediğimizde;

24 saatlik sürede kumlanmış ve parlatılmış Ni-Cr alaşımının hücre canlılığı üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Kumlanmış metal alaşımı (,624), parlatılmış metal alaşımının (,709), ortaya koyduğu bu canlı hücre değerlendirmelerinin kontrol grubu (,796), ile karşılaştırılmasında çıkan sonuç istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0,05).

72 saatlik süre içinde parlatılmış (,281) ve kumlanmış (,248) Ni-Cr alaşımının hücre ölümü üzerinde daha etkili olduğu görülürken, kontrol grubu (,362) ile de istatistiksel fark yarattığı gözlenmiştir (p< 0,05).

Kumlanmış ve parlatılmış örnekler ve kontrol grupları için 24 ve 72 saatlerindeki canlılık değerleri arasındaki karşılaştırmalar Wilcoxon testi kullanılarak yapıldı. Buna göre; sürenin hücre ölümü üzerinde etkin olduğu, metal örnekler ile elde edilen sonuçlar ile kontrol grubu arasında sitotoksisite açısından belirgin değişiklik bulunduğu gözlenmiştir (p< 0,05).

Sonuç olarak sitotoksisite üzerinde süre ve yüzey özelliği, ortaya koyduğu istatistiksel farklar ile önemli faktörlerdir.

Metal iyon çözeltileri ile yapılan incelemede elde edilen bulgular Çizelge 3.2’

de görülmektedir.

Metal iyonlarının seyreltik çözeltilerinin her iki sürede ortaya koydukları canlılık değerleri ile derişik çözeltilerin ortaya koydukları canlılık değerleri arasındaki karşılaştırma Wilcoxon testi kullanılarak yapıldı.

Metal iyonlarının seyreltik ve derişik konsantrasyonlarının hücre canlılığı üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Derişik konsantrasyon ve artan sürenin hücre ölümü üzerinde daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır.

Çizelge 3.2. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları ortalama canlılık değerleri

Metal İyonu Konsantrasyon 24 saat 72 saat p

seyreltik ,302 ,164 ,012

Nikel

derişik ,113 ,055 ,012

seyreltik ,303 ,164 ,012

Krom

derişik ,106 ,110 ,041

seyreltik ,242 ,226 ,107

Kobalt

derişik ,161 ,055 ,012

seyreltik ,248 ,112 ,012

Gümüş

derişik ,050 ,055 ,062

seyreltik ,296 ,160 ,012

Bakır

derişik ,049 ,052 ,012

seyreltik ,325 ,189 ,012

Çinko

derişik ,129 ,069 ,012

seyreltik ,359 ,270 ,012

Molibden

derişik ,269 ,157 ,012

seyreltik ,235 ,137 ,012

Berilyum

derişik ,076 ,059 ,017

seyreltik ,354 ,293 ,012

Kontrol grubu

derişik ,370 ,316 ,018

Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be iyon çözeltilerinin seyreltik konsantrasyonlarının 24 saatlik süre sonunda hücre sitotoksisitesi üzerinde ortaya koydukları değerlerle, etkili oldukları gözlenmiştir (Çizelge 3.2, Şekil 3.2).

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

seyreltik derişik

konsantrasyon

hücre canlılığı

Ni Cr Co Ag Cu Zn Mo Be kontrol grubu

Şekil 3.2. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu hücrelerin ve kontrol grubunun 24. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri

Aynı elementlerin seyreltik çözeltilerinin artan süre (72 saat) ile de artmış değerlerde hücre ölümüne sebep oldukları sonucuna ulaşılmıştır (Çizelge 3.2, Şekil 3.3). Her iki süre için her elementin seyreltik konsantrasyonlarının kontrol grubu ile karşılaştırılmalarında elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak anlamlıdır (p< 0,05).

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

seyreltik derişik konsantrasyon

hücre canlılığı

Ni Cr Co Ag Cu Zn Mo Be kontrol grubu

Şekil 3.3. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu hücrelerin ve kontrol grubunun 72. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri

Seyreltik ve derişik metal iyon çözeltilerinin 24 ve 72 saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerlerinin kendi aralarındaki ikili karşılaştırmaları KruskalWallis varyans analizi ile yapıldı. Kruskal-Wallis varyans analizi sonucu bulunan p değeri anlamlı bulunduğunda hangi grupların farklı olduğunu bulmak için çoklu karşılaştırma testi yapıldı.

Buna göre seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri arasında anlamlı ve anlamsız sonuçlara rastlanmıştır (Çizelge 3.3). Ni ile Cr ve Cu; Cr ile Cu ve Zn; Cu ile Zn; Co ile Ag ve Be; Ag ile Be arasındaki fark anlamsızken, diğer elementler arasındaki fark anlamlıdır (p< 0,05).

Çizelge 3.3. Seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)

canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları Metal İyonu Ortalama (Minimum-Maksimum) * Ni

Cr Co Ag Cu Zn Mo Be

Kontrol grubu

,302 (,261-,331) ,303 (,288-,383) ,242 (,216-,285) ,248 (,209-,306) ,296 (,292-,329) ,325 (,317-,360) ,359 (,341-,375) ,235 (,217-,269) ,354 (,338-,471)

A AB

C C AB

B D C E *Farklı harflere sahip ortalama değerleri arasındaki fark istatiksel olarak anlamlıdır (p < 0,05).

Metal iyon elementlerinin seyreltik konsantrasyonlarının 72 saat sonundaki ikili karşılaştırmalarında da (Çizelge 3.4) anlamlı ve anlamsız sonuçlara rastlanmıştır. Ni ile Cr, Cu, Zn; Cr ile Cu, Zn; Ag ile Be; Cu ile Zn arasındaki fark anlamsızken, diğer elementler arasındaki fark anlamlı görülmüştür.

(p< 0,05).

Çizelge 3.4.Seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonunda hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)

canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları Metal İyonu Ortalama (Minimum-Maksimum) * Ni

Cr Co Ag Cu Zn Mo Be

Kontrol grubu

,164 (,146-,198) ,164 (,116-,199) ,226 (,143-,240) ,112 (,048-,163) ,160 (,155-,171) ,189 (,107-,233) ,270 (,228-,297) ,137 (,085-,148) ,293 (,275-,316)

A AB

C CD

A AB

E D F *Farklı harflere sahip ortalama değerleri arasındaki fark istatiksel olarak anlamlıdır (p < 0,05).

Derişik metal iyon çözeltilerine bakacak olursak; Çizelge 3.2, Şekil 3.2’ de elde ettiğimiz bulgulara göre 24 saatlik süre sonunda incelenen Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be iyonların derişik konsantrasyonlarda hücre sitotoksisitesi üzerinde ortaya koydukları değerlerle, etkili oldukları gözlenmiştir.

Derişik metal iyonu konsantrasyonları da 72 saat sonunda hücre canlılığı üzerine olumsuz etki yapmıştır. Her iki süre için her elementin derişik konsantrasyonlarının kontrol grubu ile karşılaştırılması istatistiksel olarak anlamlıdır.(p< 0,05).

Derişik metal iyon çözeltilerini oluşturan elementlerin kendi aralarında ikili olarak 24 saat sonundaki karşılaştırmalarında seyreltik solüsyonlarda olduğu gibi anlamlı ve anlamsız sonuçlara rastlanmıştır. Ni ile Zn; Ag ile Cu arasındaki fark anlamsızken, diğer elementler arasındaki fark anlamlıdır (p< 0,05) (Çizelge 3.5).

Çizelge 3.5. Derişik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)

canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları

*Farklı harflere sahip ortalama değerleri arasındaki fark istatiksel olarak anlamlıdır (p < 0,05).

Metal İyonu Ortalama (Minimum-Maksimum) * Ni

Cr Co Ag Cu Zn Mo Be

Kontrol grubu

,113 (,096-,159) ,106 (,098-,113) ,161 (,135-,177) ,050 (,046-,059) ,049 (,042-,060) ,129 (,104-,164) ,269 (,251-,312) ,076 (,052-,095) ,370 (,340-,431)

A B D C C A E F G

Derişik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonundaki kendi aralarında ikili karşılaştırmalarında Ni ile Co, Ag , Cu, Be; Cr ile Mo; Co ile Ag, Cu, Be; Ag ile Cu, Be; Cu ile Be arasındaki arasındaki fark anlamsızken, diğer elementler arasındaki fark anlamlıdır (p< 0,05) (Çizelge 3.6).

Çizelge 3.6.Derişik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonunda hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum)

canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları Metal İyonu Ortalama (Minimum- Maksimum) * Ni

Cr Co Ag Cu Zn Mo Be

Kontrol grubu

,055 (,050-,065) ,110 (,103-,115) ,055 (,046-,059) ,055 (,047-,066) ,052 (,047-,061) ,069 (,052-,092) ,157 (,150-,163) ,059 (,031-,085) ,316 (,245-,369)

A B AC AC AC D B AC

E

*Farklı harflere sahip ortalama değerleri arasındaki fark istatiksel olarak anlamlıdır (p < 0,05).

Seyreltik metal iyonu çözeltileri elementlerinin 24 ve 72 saatlik süre açısından karşılaştırıldığında (Çizelge 3.2), her iki süre arasında genellikle elementler arasında fark görülmüştür (p< 0,05). Ni, Cr, Ag, Cu, Zn, Mo, Be elementleri için artan sürenin canlılığa negatif yönde etki ettiği gözlenmiştir.

Bununla beraber Co iyonu her iki süre arasında istatistiksel olarak farka yol açmamıştır (p>0,05).

Derişik metal iyonu çözeltileri elementleri 24. ve 72. saatler için değerlendirildiğinde genellikle artan süre elementler arasında farka yol açmıştır. Ancak Ag iyonu çözeltileri arasında süre açısından istatistiksel olarak anlamlı fark görülmemiştir (p>0,05).

Her iki sürede, seyreltik ve derişik çözeltiler arasında konsantrasyonun hücre canlılığı üzerine etkisi Mann-Whitney U testi ile karşılaştırıldığında ortaya çıkan fark her element için anlamlı olup, konsantrasyon arttıkça sitotoksisite artmaktadır (p< 0,05).

Seyreltik ve derişik konsantrasyonlar ve 24. ve 72. saatlerde en yüksek toksisiteye sahip iyonlar Be, Ag, ve Cu iken Ni, Cr, Co ve Zn orta derecede toksisite göstermişler; en düşük toksisiteye sahip iyon Mo olarak tespit edilmiştir.