DİŞ HEKİMLİĞİNDE KULLANILAN BAZI SİMANLARIN MUTAJENİK POTANSİYELLERİNİN SALMONELLA AMES
MİKROZOM TESTİ VE SOS CHROMOTEST İLE DEĞERLENDİRİLMESİ
BARAN DADAKOĞLU
DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ
GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
ŞUBAT 2011 ANKARA
Baran DADAKOĞLU tarafından hazırlanan “DİŞ HEKİMLİĞİNDE KULLANILAN BAZI SİMANLARIN MUTAJENİK POTANSİYELLERİNİN SALMONELLA AMES MİKROZOM TESTİ VE SOS CHROMOTEST İLE DEĞERLENDİRİLMESİ adlı bu tezin Doktora tezi olarak uygun olduğunu onaylarım.
Prof. Dr. Güven URAZ ……….
Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı
Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile BİYOLOJİ Anabilim Dalında Doktora tezi olarak kabul edilmiştir.
Prof. Dr. Nilüfer AKSÖZ ……….
Biyoloji Anabilim Dalı, Hacettepe Ü.
Prof. Dr. Güven URAZ ……….
Biyoloji Anabilim Dalı, G. Ü
Prof. Dr.Fatma ÜNAL ……….
Biyoloji Anabilim Dalı, G. Ü
Prof. Dr. Nedim SULTAN ……….
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, G. Ü
Doç Dr. Kanuni Barbaros BALABANLI ……….
Biyoloji Anabilim Dalı, G. Ü
Tarih: 18/02/2011
Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Doktora derecesini onamıştır.
Prof. Dr. Bilal TOKLU ……….
Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü
TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
Baran DADAKOĞLU
DİŞ HEKİMLİĞİNDE KULLANILAN BAZI SİMANLARIN MUTAJENİK POTANSİYELLERİNİN SALMONELLA AMES
MİKROZOM TESTİ VE SOS CHROMOTEST İLE DEĞERLENDİRİLMESİ
(Doktora Tezi)
Baran DADAKOĞLU GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Şubat 2011
ÖZET
Diş hekimliğinde değişik amaçlarla kullanılan simanların kimyasal yapıları nedeniyle insan sağlığı üzerinde meydana getirebileceği olumsuzluklar önemlidir. DNA hasarına yol açan ve kanser oluşumuna neden olan kimyasal maddelerin etkilerini araştırmak için kısa zamanlı testler kullanılmaktadır.
Salmonella Ames Mikrozom Testi ve SOS Chromotest bu testlerdendir.
Çalışmada 6 farklı simanın [Voco Meron (Cam iyonomer) DENTSPLY POLY- F PLUS (Çinko polikarboksilat), Cavex (Çinko oksit öjenol), RelyX U100 (Self- Adeziv Rezin), HARVARD (Çinko fosfat), SDI-SETPP (Self-Adeziv Rezin)] 3 farklı dozu mutajenite ve genotoksisite deneyleri için kullanılmıştır. Simanların Salmonella typhimurium TA98 ve TA100 suşlarında S9 mikrozom enzimi kullanılarak ve kullanılmadan mutajenitesi, Escherichia coli PQ37 suşunda ise genotoksisitesi araştırılmıştır. Mutajenite belirlenmesinde Salmonella Ames Mikrozom testi ve genotoksisite belirlenmesinde SOS Chromotest kullanılmıştır.
Test sonuçları değerlendirildiğinde, TA 98 suşunda S9 enzimi kullanılarak yapılan testlerde Poly-F-Plus simanının 40 mg’lık ve Harvard simanının 13 mg’lık dozlarının mutajen olmadığı, diğer dozlarının mutajen olabileceği belirlenmiştir. Cavex, SDI, RelyX ve Voco simanlarının tüm dozlarının mutajen olabileceği belirlenmiştir. TA 98 suşunda S9 enzimi kullanılmadan yapılan testlerde, Voco simanının 26 mg’lık dozunun mutajen olmadığı, diğer dozlarının mutajen olabileceği belirlenmiştir. Cavex, SDI, RelyX, Poly-f-Plus ve Harvard simanlarının tüm dozlarının mutajen olabileceği belirlenmiştir. TA 100 suşunda S9 enzimi kullanılarak yapılan testlerde tüm simanların tüm dozlarının mutajen olabilceği belirlenmiştir. TA 100 suşunda S9 enzimi kullanılmadan yapılan testlerde, Voco simanının 40 mg’lık dozunun mutajen olmadığı, diğer dozlarının mutajen olabileceği belirlenmiştir. Cavex, SDI, RelyX, Poly-F-Plus ve Harvard simanlarının tüm dozlarının mutajen olabileceği belirlenmiştir.
SOS Chromotest ile test edilen simanların hiç biri genotoksik etki göstermemiştir.
Bilim Kodu : 912.1.050
Anahtar Kelimeler : Mutajenite, genotoksisite, dental simanlar, ames testi, sos chromotest Sayfa Adedi : 124
Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Güven URAZ
THE EVALUATION OF MUTAGENIC POTENTIALS OF SOME DENTAL CEMENTS IN USED DENTISTRY WITH SALMONELLA AMES
MICROSOME TEST AND SOS CHROMOTEST (Ph. D Thesis)
Baran DADAKOĞLU
GAZI UNIVERSITY
INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY February 2011
ABSTRACT
Cements used in dentistry can bring important negative effects on human health due to their chemical structures. Chemicals can cause DNA damage and cancer cells. Various short-time tests are used to investigate these effects. Salmonella Ames Microsome test and SOS chromotest is commonly used short-time tests.
6 various cements with 3 different doses [Voco meron (glass-ionomer), Cavex (zinc-oxide eugenol), RelyX U100 (self-adhesive resin), Harvard (zinc phosphate), SDI-SetPP (self-adhesive resin), Dentsply Poly-F-Plus (zinc- polycarboxylate)] were used in this study. These cements were tested on Salmonella typhimurium TA98 and TA100 strains, both in presence and absence of S9 microsome enzymes for mutagenic activity and tested on Escherichia coli PQ 37 strain for genotoxic activity. Salmonella AMES Microsome test was used to identify mutagenic, SOS Chromotest was used to identify genotoxic activity.
According to the test results, the tests using TA98 strain with S9 microsome enzyme, 40mg doses of Poly-F-Plus and 13mg doses of Harvard cements were not mutagenic but the other doses may have mutagenic effect. All doses of Cavex, Voco, SDI and RelyX may have mutagenic effect. The tests using TA98
strain without S9 microsome enzyme 26mg doses of Voco cements were not mutagenic but the other doses of this cements may have mutagenic effect. All doses of Cavex, Harvard, Poly-F-Plus, SDI and RelyX cements may have mutagenic effect. The test using TA100 strain with S9 microsome enzyme, all doses of the all cements may have mutagenic effect. The test using TA100 strain without S9 microsome enzyme 40mg doses of Voco cements were not mutagenic but the other doses of this cements may have mutagenic effect. All doses of Cavex, Harvard, Poly-F-Plus, SDI and RelyX cements may have mutagenic effect.
According to SOS Chromotest results all of the tested cements and doses were non- genotoxic.
Science Code : 912.1.050
Key Words : Mutagenicity, genotoxicity, dental cements, Ames test, sos chromotest
Page Number : 124
Adviser : Prof. Dr. Güven URAZ
TEŞEKKÜR
Çalışmalarım boyunca değerli emek ve katkılarıyla beni yönlendiren çok kıymetli danışman hocam Prof. Dr. Güven URAZ’a, yine kıymetli tecrübelerinden faydalandığım çok değerli hocam Prof. Dr. Nilüfer AKSÖZ’e, tez izleme komitemde yer alan Prof. Dr. Fatma ÜNAL’a, katkılarından dolayı Prof. Dr. Hakan TERZİOĞLU’na teşekkür ederim.
Tüm çalışmalarım sırasında bana her türlü desteği sağlayan ve sabırla katlanan çok değerli arkadaşım Dr. Ebru YILMAZ’a, her zaman yanımda olan aileme ve özellikle emeklerini asla ödeyemeyeceğim Annem’e teşekkür ederim. Ayrıca manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili arkadaşım İlknur ÖZGENÇ’e çok teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET………... iv
ABSTRACT……… vi
TEŞEKKÜR……… vii
İÇİNDEKİLER……… ix
ÇİZELGELERİN LİSTESİ………. xii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ………... xiv
RESİMLERİN LİSTESİ……….. xvi
SİMGELER VE KISALTMALAR………. xvii
1. GİRİŞ………... 1
2. GENEL BİLGİLER………. 5
2.1.Mutasyonlar……….. 5
2.1.1. Kromozom sayısı değişmeleri………. 6
2.1.2. Kromozom yapsısı değişmeleri………... 7
2.1.3. Gen mutasyonları……… 9
2.2.Mutajenler……….. 12
2.3.Metabolik Aktivasyon……… 14
2.3.1 Mikrozomal enzimler……….. 15
2.4.DNA Onarım Teknikleri……… 17
2.5.Mutajen ve Kanserojenlerin Saptanmasında Kullanılan Kısa Zamanlı Test Sistemleri……… 20
2.6.Salmonella Ames Mikrozom Mutajenite Test Sistemi………. 22
Sayfa
2.6.1 Histidin mutasyonu………. 24
2.6.2. Rfa mutasyonu………. 24
2.6.3. UvrB mutasyonu……….. 24
2.6.4. R-faktörü………. 25
2.7.SOS Chromotest (Beta Galaktosidaz Enzim Aktivitesi Testi)…………. 25
2.8.Diş Hekimliğinde restoratif materyal olarak Kullanılan Simanlar……... 26
2.8.1. Çinko fosfat simanlar……….. 28
2.8.2. Polikarboksilat simanlar……….. 29
2.8.3. Cam iyonomer simanlar………... 30
2.8.4. Rezin esaslı yapıştırma simanları……… 31
2.8.5. Çinko oksit öjenol simanlar………. 34
2.9 Simanların Çözünürlüğü……….. 35
3.MATERYAL VE METOD……….. 36
3.1. Materyal……….. 38
3.1.1. Mutajenitesi test edilen simanların seçimi ve dozlarının belirlenmesi………. 38
3.1.2. Salmonella typhimurium test suşlarının seçimi ve kontrollerin yapılması………. 39
3.1.3 Yapay tükürük hazırlanması ve kullanılması………... 40
3.1.4. AMES test kiti……… 41
3.1.5. SOS chromotest kiti……… 41
3.2. Metod………. 42
Sayfa 3.2.1. Test maddelerinin sitotoksik etkilerinin kontrolü ve
deneyde kullanılacak dozların belirlenip hazırlanması…….. 42
3.2.2. Master plakların hazırlanması………. 44
3.2.3. Salmonella suşlarının stoklanması ………. 45
3.2.4. Sıvı kültürde bakteri sayısının belirlenmesi……… 45
3.2.5. Test suşlarının genotip kontrollerinin yapılması………. 46
3.2.6. Ames testinin yapılışı……….. 48
3.2.7. Ames test kitinin uygulanışı……… 51
3.2.8. SOS chromotest kitinin uygulanışı……….. 54
3.2.9. Ames test sonuçlarının değerlendirilmesi……… 58
4. BULGULAR……… 59
4.1. Simanların ames mutajenite test sonuçları……….. 60
4.2. Muta chromoplate test kitinden alınan sonuçlar………. 83
5. TARTIŞMA VE SONUÇ……… 93
KAYNAKLAR……… 101
EKLER……… 113
ÖZGEÇMİŞ………. 123
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge Sayfa
Çizelge 2.1. Nokta ve çerçeve kayması mutasyonları………..11 Çizelge 2.2. Salmonella typhimurium mutant suslarının genetik özellikleri………23 Çizelge 3.1. Muta Chromo Plate Kitinde bulunan TA98 ve TA 100
suşlarının özellikleri………..………52 Çizelge 4.1. CAVEX simanının TA 98 ve TA 100 için S9 (+) ve S9 (-) Sonuçları
(DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK)………..60 Çizelge 4.2. HARVARD simanının TA 98 ve TA 100 için S9 (+) ve S9 (-)
Sonuçları (DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK)…….……….61 Çizelge 4.3. POLY-F PLUS simanının TA 98 ve TA 100 için S9 (+) ve S9 (-) Sonuçları (DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK)……….……….62 Çizelge 4.4. VOCO simanının TA 98 ve TA 100 için S9 (+) ve S9 (-) Sonuçları (DMSO)……….………..63 Çizelge 4.5. RELY X (3M) simanının TA 98 ve TA 100 için S9 (+) ve
S9 (-) Sonuçları (DMSO)………... 64 Çizelge 4.6. SDI simanının TA 98 ve TA 100 için S9 (+) ve S9 (-) Sonuçları (DMSO)………..64 Çizelge 4.7. Tüm Sonuçların Karşılaştırmalı Toplu Halde Gösterimi (DMSO)…79 Çizelge 4.8. Yapay Tükürükten Elde Edilen Sonuçların Toplu Halde Gösterimi .80 Çizelge 4.9. Mutachromoplate Test Kitinden TA 98 Suşunda Alınan Sonuçlar (S9-)……….84 Çizelge 4.10. Mutachromoplate Test Kitinden TA100 Suşunda Alınan Sonuçlar (S9-).………..84 Çizelge 4.11. Mutachromoplate Test Kitinden TA 98 Suşunda Alınan Sonuçlar (S9+)..………84 Çizelge 4.12. Mutachromoplate Test Kitinden TA 100 Suşunda Alınan Sonuçlar (S9+)………..84
Çizelge Sayfa Çizelge 4.13. CAVEX Simanında Spontan Revertant Değerleri
Hesaplandıktan Sonraki Mutajenite Sonuçları……….85 Çizelge 4.14. Rely X (3M) Simanında Spontan Revertant Değerleri
Hesaplandıktan Sonraki Mutajenite Sonuçları……….86
Çizelge 4.15. 405 nm de Cavex, Voco ve POLY-F Plus Simanlarından Alınan OD Değerleri………...……89
Çizelge 4.16. 405 nm de Harvard, Rely X (3M) ve SDI Simanlarından Alınan OD Değerleri………...……89 Çizelge 4.17. 615 nm de Cavex, Voco ve POLY-F Plus Simanlarından Alınan OD Değerleri………...……90 Çizelge 4.18. 615 nm de Harvard,Rely X (3M) ve SDI Simanlarından Alınan OD Değerleri………...……90
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil Sayfa
Şekil 2.1. Geleneksel cam iyonomer simanın kimyasal yapısı………..30
Şekil 2.2. Rezin modifiye cam iyonomer simanın kimyasal yapısı………...32
Şekil 2.3. Poliasit modifiye kompozit rezin simanın (kompomer) kimyasal yapısı 33 Şekil 2.4. Kompozit rezin simanın kimyasal yapısı………...34
Şekil 4.1. TA 98 S9 (-) (DMSO Çözücü)………...65
Şekil 4.2. TA 98 S9 (+) (DMSO Çözücü)………..66
Şekil 4.3. TA 100 S9 (-) (DMSO Çözücü)……….66
Şekil 4.4. TA 100 S9 (+) (DMSO Çözücü)………67
Şekil 4.5. TA 98 S9 (-) (YAPAY TÜKÜRÜK)……….67
Şekil 4.6. TA 98 S9 (+) (YAPAY TÜKÜRÜK)………68
Şekil 4.7. TA 100 S9 (-) (YAPAY TÜKÜRÜK)………...68
Şekil 4.8. TA 100 S9 (+) (YAPAY TÜKÜRÜK)………..69
Şekil 4.9. CAVEX simanı için TA98 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK revertant koloni sayıları………….…….70
Şekil 4.10. CAVEX simanı için TA100 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK revertant koloni sayıları…………..…..70
Şekil 4.11. HARVARD simanı için TA98 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK revertant koloni sayıları………71
Şekil 4.12. HARVARD simanı için TA100 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK revertant koloni sayıları………71
Şekil 4.13. POLY-F PLUS simanı için TA 98 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK revertant koloni sayıları………72
Şekil 4.14. POLY-F PLUS simanı için TA100 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO ve YAPAY TÜKÜRÜK revertant koloni sayıları………..……72
Şekil Sayfa Şekil 4.15. VOCO simanı için TA98 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO
revertant koloni sayıları……...………...………73 Şekil 4.16. VOCO simanı için TA100 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO
revertant koloni sayıları………….……….73 Şekil 4.17. RELY X (3M) simanı için TA98 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO revertant koloni sayıları……….………..74 Şekil 4.18. RELY X (3M) simanı için TA100 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO
revertant koloni sayıları………...………74
Şekil 4.19. SDI simanı için TA98 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO revertant koloni
sayıları………..75
Şekil 4.20. SDI simanı için TA100 suşunun S9 (+) ve S9 (-) DMSO revertant
koloni sayıları………...75
RESİMLERİN LİSTESİ
Resim Sayfa
Resim 3.1. TA98 suşunun HBA da üremesi………..46
Resim 3.2. TA100 suşunun HBA da üremesi………47
Resim 3.3. Muta Chromo Plate Kitte Mutajenite Belirlenmesi………..51
Resim 3.4. İnkübasyona hazır hale getirilmiş mikroplaklar………...53
Resim 3.5. Mutasyon Sonucu Renk Değişimi………...53
Resim 3.6. SOS Chromotest Çalışma Prensibi………..56
Resim 4.1. TA 100 Suşu Revertant Kontrol Plağı (DMSO) (S9-)………...76
Resim 4.2. TA 98 Suşu Poly-F Plus 13 mg. (DMSO) (S9+)……….76
Resim 4.3. TA 100 Suşu Pozitif Kontrol (DMSO) (S9-)………..77
Resim 4.4. TA 98 Suşu Cavex 13 mg (DMSO) (S9-)………..77
Resim 4.5. TA 100 Suşu Cavex 13 mg ve Poz.K. (Yapay Tük.) (S9-)…………..78
Resim 4.6. TA 100 Suşu Harvard 13 mg Poly-F 26 mg ve Poz.K. karşılaştırma (Ypy. Tük.) (S9+)………..………....78
Resim 4.7. TA 100 suşu Revertant Kontrol Mikroplak (S9-) ………..86
Resim 4.8. TA 98 ve TA 100 suşları Pozitif Kontrol Plak (S9+)………..87
Resim 4.9. Rely X (3M) TA 100 suşu 13 mg Test Plak (S9+) ……….87
Resim 4.10. Cavex TA98 suşu 40 mg Test Plak (S9-) ………...……...88
Resim 4.11. Cavex, Voco ve Poly-F Plus Simanlarının SOS Chromotest Sonuçları………..………92
Resim 4.12. Harvard, RelyX (3M), SDI Simanlarının SOS Chromotest Sonuçları………...92
SİMGELER VE KISALTMALAR
Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur.
Simgeler Açıklama
gr gram
ml mililitre
mg miligram
µl mikrolitre
µg mikrogram
nm nanometre
Kısaltmalar Açıklama
DNA Deoksiribo Nükleik Asit
DMSO Dimetil sülfoksit
HB Histidin/Biyotin
HBA Histidin/Biyotin/Ampisilin
NB Nutrient Broth
P.K Pozitif Kontrol SP.K. Negatif Kontrol Y.T Yapay Tükürük
YT. K Yapay Tükürük Kontrol
1. GİRİŞ
Teknolojinin hızla geliştiği günümüzde insanoğlu giderek artan çeşitli kimyasal maddelerin, başta ilaçlar olmak üzere, çeşitli katkı maddelerinin etkileri altında kalmaktadır. Teknolojik gelişmelerin insan yaşamına sunduğu, fiziksel ve kimyasal ajanların da dahil olduğu çok sayıda çevresel faktör, sağlık açısından tehlike oluşturma boyutundadır ve insanın genetik bütünlüğünü tehdit etmektedir [1].
Doğadaki tüm canlılar günlük yaşamda sık sık doğal ya da yapay kimyasal maddelerle yüz yüze gelmektedir. İnsan populasyonunun çevredeki kanserojen ve mutajen maddelerin etkisinden korunması için çevremizdeki bu özelliğe sahip bileşiklerin tespit edilmesi ve etkilerinin değerlendirilmesi öncelikle gerekli ve önemlidir [2-5].
Kimyasal maddelerin olası mutajenik aktivitelerini araştıran ilk çalışmalar ikinci dünya savaşından hemen sonra bir grup kimyasal üzerinde yapılmış ve ilk olarak hardal gazının etkili bir mutajen olduğu tespit edilmiştir. Ardından dünyanın hemen her yerinde yapılan deneylerle, diğer bazı kimyasallara dikkat çekilmiştir. 1972 yılında yapılan bir araştırmada yiyecekleri renklendirme, koruma ve diğer amaçlarla kullanılan 2500 kadar katkı maddesi olduğu tespit edilmiştir. Yiyeceklere bulaşarak vücuda giren pestisitler ve çeşitli amaçlarla kullanılan ilaçlar üzerinde durulmuş ve bu sayede pek çok mutajenite test sistemi geliştirilmiştir [6].
Kimyasal maddelerin biyolojik aktivitelerine bağlı olarak meydana gelen mutasyonun, kanser ile yakından ilgisi vardır. Genellikle, doğrudan veya metabolize edildikten sonra kanserojenik etki gösteren tüm maddelerin, aynı zamanda mutajenik etki gösterecekleri kabul edilmektedir. Karsinojenite araştırmalarına esas olabilecek, kısa zamanda sonuç verebilen ve düşük maliyetli birçok kısa zamanlı test sistemleri geliştirilmiştir. Bu testler kimyasal maddelerin mutajenik etkilerini belirlemeye yöneliktir. Kısa zamanlı test sistemlerinden en yaygın olarak kullanılanlardan biri de bakteriyel testlerdir [7].
Bakteriyel test sistemlerinde mutajen olduğu saptanan birçok bileşiğin aynı zamanda kanserojen olduğu gösterilmiştir. Kanserojen ve mutajenlerin neden olduğu özgül DNA hasarları tiplerini saptamada, bakteriyel test sistemleri kullanılmaktadır. Kısa zamanlı bakteriyel test sistemleri, karmaşık kimyasal örneklerdeki mutajenik bileşiklerin ve metabolik aktivasyon sonucu ortaya çıkan, reaktif birleşenlerin saptanmasında analitik araçlar haline gelmişlerdir [7].
Kanserojen ve mutajen maddelerin araştırılması çeşitli testlerle tespit edilebilir [3,8,9,10]. Bunlardan bazıları DNA hasarlarına sebep olan kimyasal mutajen ve kanserojenlerin test edildiği sitogenetik metotlardır. Bu testler, kardeş kromatid değişimi (SCE= sister chromatid exchange) [9,11,12,13], comet testi (gen konversiyonları ve DNA kırılmaları) [3,9,14], kromozom bozulma testi (CA=
chromosome aberation) [15], mikronükleus testi (MN) [16,17], programlanmamış DNA sentezi (UDS=Unscheduled DNA synthesis) [18,19,20], SOS kromotest [10,12], transformasyon yöntemi, umu test [10] ve Ames/Salmonella/Mikrozom test yöntemi şeklinde sıralanabilir [3,8,9,16,17].
Tüm bu mutajenite test yöntemleri Salmonella test suşları, çeşitli E.coli suşları, rat, primat ve tavşan türleri kullanılarak hazırlanmış memeli hücre kültürleri ve memelilerin kan, kemik iliği hücreleri, Saccharomyces cerevisia suşları ve farklı organizmalar kullanılarak uygulanmaktadır [16,21-24]. Bu testlere kısa zamanlı (short term) testler de denir [9,15,22].
Sözü edilen yöntemlerin tümü söz konusu olası mutajenik etkileri saptamak amacıyla, bağımsız ya da birkaçı birlikte karşılaştırmalı olarak kullanılmaktadır. Bir testte pozitif olan diğerinde negatif olabilir ya da değişik mutasyona neden olabilmektedir [25,26,27].
Son yıllarda, tıp ve farmokoloji alanlarında yeni ilaçların gelişiminde üretilen ilaç hammaddelerinin biyolojik sistemlerdeki toksik ve mutajenik etkilerinin araştırılmasında kısa zamanlı testler kullanılmaktadır. Yukarıda sayılan test yöntemleri kullanılarak ilaç hammaddesi olması düşünülen test maddelerinin toksik,
mutajenik, karsinojenik etkilerini incelemek için daha çok Ames testi kullanılmaktadır. Ames testinde mutajenik etkileri diğer canlı gruplarına göre daha fazla duyarlı olan bakteriler üzerindeki etkilerinin araştırılmasının yanı sıra, bu test ile aynı zamanda ortama ilave edilen memeli metabolik aktivasyon enzimleri ile test bakterilerinin memeli metabolizmaları sonucu oluşabilecek metabolitlerinin de mutajenik etkileri araştırılmıştır [4,5,28,29,30].
Ames /Salmonella /Mikrozom test yöntemi 1975 yılında Prof. Dr. Ames ve Dr.
Maron tarafından geliştirilen ve daha sonra yaygın olarak uygulanmaya çalışılan mutajenite testidir [4,11,19,31,32,33]. Bu testin amacı, yapay mutasyonla oluşturulmuş olan Salmonella typhymurium’un histidin sentezleme yeteneklerini kaybetmiş His- (oksotrof) olan suşlarının test bileşeni ile muamele edildikten sonra ikinci bir mutasyon geçirip tekrar His+ hale geri dönüşmesi temeline dayanır. Test suşları histidin mutasyonuna ek olarak belirli mutajenlere karşı duyarlıklarını arttıran başka mutasyonlar da içerirler. Bu mutasyonlardan biri Rfa’dır. Bu mutasyon bakteri yüzeyini kaplayan lipopolisakkarit bariyerin bölgesel kaybına neden olur ve normal hücre duvarından geçemeyen büyük moleküllere karşı geçirgenliğini arttırır.
Ayrıca DNA onarım mekanizmasında etkili olan uvr B mutasyonlarını ve ampisiline dirençlilik sağlayan PKM 101 plazmitini içermektedir. Geri dönüşüm (revertant) bakteri kolonileri sayılarak değerlendirilir. Fakat normalde mutajenlere maruz kalmadan spontan olarak geri dönüşebilen bakterilerde olmaktadır. Mutajenik etkiden bahsetmek için spontan revertant sayısından daha fazla sayıda revertant koloni elde edilmesi gerekir [4,34,35].
Bu test ile birçok mutajenik madde tespit edilmiştir. Bu test Salmonella typhymuriumun TA ve YG suşları ile uygulanmaktadır. En çok kullanılan bakteri suşları, TA 97, TA 98, TA 100, TA 102, TA 1535, TA 1538 suşlarıdır.
Ames/Salmonella/Mikrozom testi ile yapılan çalışmalar hala en güvenilir test olmasından dolayı 1975 yılından bu yana kullanımı devam etmektedir [4].
Ames/Salmonella/Mikrozom testi kullanılarak memeli hücrelerinde P450IA2 cDNA gen ifadesi ile promutajenlerin tanımlanması sağlanmıştır [36-42].
Simanlar üzerine yapılan çalışmalar olduğu gibi bunları bileşimlerinde bulunan maddelerin de genotoksik ve mutajenik etkilleri üzerine de çalışmalar yapılmaktadır.
Giderek artan siman kullanımı dolayısı ile firmalar farklı özelliklere sahip yeni simanlar piyasaya sürmektedirler. Birçok özelliği bir arada bulundurması istenilen simanlar tedavinin yanı sıra dişlerde estetik kaygılarla da sıkça kullanılmaya başlamıştır. Ağız içinde bulunan simanların tükürüğün etkisiyle çözünebilirliği üzerine yapılan araştırmalar uzun vadede ağız içinde emilimlerinin arttığını, bu nedenle olumsuz etkilerinin mutlaka incelenmesi gerektiği yönündedir.
Çalışmada diş hekimliğinde kulanılmakta olan çeşitli simanlardan 6 tanesi 3 farklı dozda test edilmiştir. Tümör oluşumu ve kanserle direkt ilişkisi olan mutajen ve genotoksik kimyasal maddelerin kullanımı günlük yaşantımızda giderek artmaktadır.
Bu nedenle bu maddelerin genotoksik ve mutajenik potansiyellerinin belirlenmesi çok önemlidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar diş hekimliğinde kullanılan diğer kimyasallar ile birlikte simanların da mutajenik ve genotoksik etkilerinin olduğunu göstermektedir. Çalışmada simanların mutajenik ve genotoksik potansiyelleri Salmonella AMES Mikrozom Testi ve SOS Chromotest ile belirlenmeye çalışılmıştır.
Her ne kadar çalışmada invitro yöntemler ve mutajenite testleri için bakteriler kullanılmış olsa da yapılan çalışmalar bakteriler üzerinde mutajenik etkisi olan maddelerin aynı zamanda memeliler ve insanlar üzerinde de benzer etkiler ortaya çıkardığını göstermiştir. Çalışmada kullanılan kısa zamanlı testlerin in vitro ve bakteriyel kökenli olduğu göz önünde bulundurularak, bu maddelerin bir de memeli hücreleri üzerindeki etkilerini araştırmaya yönelik testlerin yapılması uygun olacaktır. Bu sayede elde edilen sonuçların ışığında bu maddelerin insan sağlığı üzerine olumsuz etkileri çok daha iyi bir şekilde değerlendirilip gerekli önlemler alınabilir.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Mutasyonlar
DNA kalıtsal bir materyal olduğu için gelecek nesillere değişmez bir formda aktarılması gerekir. Fakat zaman zaman doğal ve yapay koşullar altında mutasyon denen değişiklikler gözlenebilir. DNA’nın türe özgü kalıtsal kombinasyonu değişmeksizin, taşıdığı bilgi içeriğinde meydana gelen değişmeye “mutasyon” denir.
Eğer, depo edilmiş genetik bilgide herhangi bir değişiklik olursa, bu değişiklik bilginin ifadesine de yansır ve replikasyon yoluyla aktarılır. Mutasyon, hem kromozomal hem de genlerdeki değişimleri ifade edebilir. Birçok genetik kavramın geliştirilmesinde, kalıtsal materyalin yapı ve içeriğinin dölden döle geçerken değişmediği kabul edilir. Her ne kadar, genler dikkati çekecek kadar kararlı ve yeni döllerde bütün özelliklerini koruyarak katılıyorsa da, zaman zaman doğal ve yapay koşullar altında mutasyona uğrarlar [43-47].
Mutasyonlar doğada kendiliğinden meydana gelebildiği gibi, mutajen adı verilen fiziksel ve kimyasal dış etkenler tarafından da meydana gelebilirler. Genelde mutasyonun kendiliğinden meydana gelebilme olasılığının çok düşük olmasına karşın, mutajenlerin etkisi ile mutasyon frekansı oldukça yükselmektedir. Normal koşullarda kendiliğinden olan mutasyon frekansı her nesilde10-5–10-10 gibi düşüktür.
İki ayrı gende aynı anda iki ayrı mutasyonun oluşması ise10-10–10-20 gibi çok daha düşüktür [48,49]. Bir genin baz dizisindeki bir değişim bazen o gen tarafından kodlanmış olan üründe de değişime sebep olabilir. Böyle mutant bir genin mutant enzimi, aminoasit dizisindeki meydana gelen değişme sebebiyle inaktif ya da daha az aktif olabilmektedir. Eğer hücre mutasyon sonucu ihtiyaç duyduğu bir fenotipik özelliği yitirirse genotipteki bu değişiklik zararlı ya da öldürücü olabilir. Bununla birlikte bir mutasyon faydalı da olabilir. Örneğin mutant bir gen tarafından kodlanan enzim, hücreye avantaj sağlayan yeni bir aktiviteye sahip olursa bu mutasyon çeşidi nadir de olsa canlıya doğal seleksiyonda avantaj kazandırır. Mutasyonlar, populasyondaki çeşitliliği sağladığından, yeni türlerin oluşumuna katkıda bulunduğundan dolayı evrimsel öneme sahiptir [45,50,51,52].
Basit mutasyonların birçoğu nötraldir. DNA baz dizisindeki değişme, bu gen tarafından kodlanan ürünün aktivitesinde herhangi bir değişmeye yol açmaz.
Mutasyon vücut hücrelerinde ya da üreme hücrelerinde olabilir. Vücut hücrelerinde olan mutasyonlara “somatik mutasyonlar” denir ve bu mutasyonlar hastalıklara ve dejenerasyonlara yol açarak gelişmeyi ve metabolizmayı olumsuz etkileyebilirler.
Birçok kanser türünün somatik hücrelerde genellikle bir mutasyon nedeni ile ortaya çıktığı bilinmektedir. Üreme hücrelerinde görülen mutasyonlara ise “germinal mutasyonlar” denir. Üreme hücrelerinin DNA’sında görülen değişmeler genetik içeriğin farklılığına yol açar ve bu mutasyon kalıtsal olarak yeni nesillere aktarılır.
Mutasyonlar iki temel grupta incelenebilir. Bunları “kromozom mutasyonları” ve
“gen mutasyonları” olarak ayırabiliriz. Kromozom mutasyonları da “kromozom sayı değişmeleri” ve “kromozom yapı değişmeleri” olarak iki gruba ayrılabilir [45,52,53].
2.1.1. Kromozom sayısı değişmeleri
Kromozom sayısı türlere göre farklılık gösterir, ancak bu sayı her tür için sabittir, değişmez. Canlıların gelişmişliğinde, kromozom sayısı önemli değildir. Önemli olan, kromozomlar üzerindeki genetik şifrenin dizilişidir. Canlı bireyin her bir hücresi, onun ait olduğu türe özgü kromozom taşır. Eşeyli üreyen canlıların gametlerinde bulunan kromozomlara ‘‘takım’’ ya da ‘‘genom’’adı verilir ve ‘‘n’’ sembolü ile gösterilir. ‘‘n’’ kromozom sayısına sahip gametler, monoploid (haploid) dir. Somatik hücrelerde (vücut hücreleri) ise, iki takım kromozom bulunur ve ‘‘2n’’ sembolü ile gösterilir. Ökaryotların çoğu diploid’ dir ve iki takım kromozom taşır. [7,47,52]. İki grup altında incelenir:
Euploidi
Kromozom sayısı takımındaki değişmelerdir. Bir takımdaki kromozomların hepsinin birden sayısının tam katlar halinde yükselmesi veya organizmada sadece tek takım kromozom bulunması biçiminde olabilir. Monoploidi ve poliploidi olarak iki kısımda incelenir. Monoploidlerde her kromozomdan sadece bir tane taşındığı için bütün genler de tek kopya halinde bulunur. Mayoz bölünme sırasında monoploidlerde
kromozom eşleşmesi olmadığından kromozomların kutuplara çekilişleri düzensizdir, sonuçta da dengesiz eşey hücreleri meydana gelir.
Poliploidi ise bir genomdaki kromozom sayısının hepsinin birden, ikiden fazla kata yükselmesidir. Bu olay; mayozda kromozom sayısının değişmesinin önlenmesi ile somatik hücrelerdeki kadar genoma sahip gametlerin oluşumuyla (yüksek veya düşük sıcaklık ya da bazı kimyasal maddeler kullanıldığında sıklıkla meydana gelmektedir), zigotun ilk mitoz bölünmeleri sırasında kromatidlerin farklı kutuplara çekilmesinin veya enine çeper oluşumunun engellenmesiyle ve en son olarak da bir yumurta hücresinin birden fazla sperm tarafından döllenmesi sonucunda meydana gelmektedir. Bir poliploidin sahip olduğu takımların hepsi aynı türe ait ise olaya otopoliploidi, farklı türe ait ise allopoliploidi denir [7,43].
Aneuploidi
Bir takımdaki kromozomların birinin veya birden fazlasının sayısını değiştirmesi olayıdır. Aneuploid bir fert normal haploid sayıdan fazla veya eksik sayıda kromozom içeren gametlerin ürünüdür.Aneuploid başlıca 3 gruba ayrılır. Bunlar;
a-)Monosomi: Diploid bir fertte tek bir kromozom eksik olması olayıdır.
b-)Nullisomi: Bir canlıda bir kromozomun, homoloğu ile eksik olması olayıdır.
c-)Polisomi: Bir takımda bulunan kromozomlardan birinin veya birkaçının sayısını yükseltmesi olayıdır [7,43].
2.1.2. Kromozom yapısı değişmeleri
Kromozomların yapısında meydana gelen değişimler, kalıtsal bilgide de değişime neden olur. Yani, kromozomların bazı parçalarının artması, azalması veya yer değiştirmesi, kalıtsal maddenin değişimine yol açar. Ancak, bu tip olaylarda kromozom sayısı sabit kalır. Kromozomlardaki yapısal değişimler farklı şekillerde olsa da, hepsinin kökeninde; kromozomu oluşturan kromatitlerin birinde, bir ya da birden fazla meydana gelen kırılmalar ve yeniden birleşmeler yer alır. Bu kırılmalar, hiçbir etken olmadan kendiliğinden olabileceği gibi, X, UV, gama ışınları, fiziksel
stres ya da kimyasal maddeler gibi dış etkenler tarafından da oluşturulabilir.
Kromatid tipi kırılmalarda, iki kromatidden sadece birinde kırılma olur ve genellikle kırık uçlu parçalar birbirine yeniden yapışır. Kromozom tipi kırılmalarda ise, bir kromozomun iki kromatidi aynı anda, aynı yerden kırılır. Böylece, kromozomun bir yanı sentromerli (sentrik), bir yanı sentromersiz (asentrik) hale gelir. Kromozom yapı değişimleri farklı şekillerde olabilir [7,43,44,54,55].
Delesyon
Delesyon, DNA yapısından bir ya da daha fazla nükleotid veya baz çiftinin ayrıldığı mutasyonlara verilen addır. Delesyonlar, kromozomların uç kısmından ya da ara bölgelerinden olabilir. Kopan parça eğer sentromer taşımıyorsa yani asentrik ise mayoz ve mitoz bölünmelerdeki kromozomların kutuplara gitmesini saglayan sentromer olmadığı için kromozomlar kutuplara ulaşmazlar. İçten eksiklik durumunda kromozom iki noktasından kırılır ve kırılan parça ayrılıp serbest uçlar birbirine bağlanır. Kromozomun sarmal yapısından dolayı oluşan halka kopmaları da bu gruba girer. Uçtan kopmalarda ise tek noktadan kırılma olur [56].
Duplikasyon
Duplikasyon, bir kromozomun bir parçasının o kromozom üzerinde iki veya daha fazla sayıda tekrarla görülmesi şeklindeki kromozom anomalisidir. Yani kromzomun bir kısmının kendi kendini eşlemesi olarak da tanımlanabilir. Duplikasyonlu bir parça sentromerli serbest bir parça veya tamamlayıcı bir kromozom parçası olabilir. Eğer sentromere sahip yani sentrik bir kromozom parçası ise bu parça küçük, ekstra bir kromozom olarak kabul edilir. Bir kromozom parça değişimi sırasında karşısındakine belirli genleri vermez, sadece alırsa o gen bakımından diploid olur. Bu çoğunlukla düzenli işlemeyen bir krossing-overde meydana gelir. Normal olarak mayozun ilk evrelerinde eş genler sinapsis yapar. Ayrılırken normal bir bölünme olmazsa kromatidlerden biri o gen bakımından diploid olur diğeri ise o genlerden yoksun kalır. Duplikasyonun değişik özelliği bulunur. Birincisi, duplikasyon geninin birden
fazla kopyasının bulunmasını sağlayabilir. İkincisi, delesyonlarda olduğu gibi, duplikasyon sonucu fenotipik çeşitlilik oluşabilir [56].
İnversiyon
İnversiyon, bir kromozomun kırılması ve kopan parçanın 180° ters dönerek tekrar aynı kromozoma bağlanması seklidir. İnversiyona uğramış kromozomlar normal homologları ile sinapsisle teskil ederken kromozom düzensizliklerinin ortaya çıkmasına neden olurlar. Çünkü böyle heterozigotik homologlarda allel genler nokta nokta karşılıklı gelmek isteyeceklerdir. Kırılmadan önce kromozomda halkaya benzer bir yapı oluşur. Kırılmayla ortaya çıkan yapışkan uçlar birbirine yaklaşır ve tekrar birleşir. Bu durumda gen sayısı ve özelliği aynı olmasına rağmen diziliş sırası değişir. Ters çevrilen parça eğer sentromer içeriyorsa inversiyon perisentrik, içermiyorsa parasentrik inversiyon olarak isimlendirilir. Parasentrik inversiyonda, gen dizilişi ters çevrildiği halde sentromerden uzanan kolların boy oranı değişmezken perisentrik inversiyonda değişir [56].
Translokasyon
Translokasyon, bir kromozomun kopan bir parçasının başka bir kromozoma yapışması seklinde görülen kromozom anomalilerindendir. Translokasyonlar, her zaman homolog olmayan parça değişimleridir. Gen sayısının ve niteliğinin aynı kaldığı translokasyonlara "dengeli translokasyon"lar denir. Gen sayısının ve niteliğinin değiştiği, çoğunlukla anomalilere neden olan translokasyonlara "dengesiz translokasyon" denir [56].
2.1.3. Gen mutasyonları
Gen mutasyonları veya diğer bir deyişle ‘Nokta Mutasyonları’ kromozomların yapısında herhangi bir değişikliğe sebep olmaz ve mikroskopla da görülmezler.
DNA’da bulunan nükleotid dizisinin ya da bazlarının değişmesinden ileri gelir. Baz sırasının veya AT / GC oranının değişmesi, o gene özgü enzimin tamamen
kaybolmasına ya da etkisinin azalmasına neden olur. Bir gen, binlerce baz çiftinden meydana gelmiş bir birim olduğundan ve kuramsal olarak her bazda mutasyon olabileceğinden dolayı, bir genin en azından baz çifti kadar mutasyon çeşidi olabilir.
Çok değişik biçimlerde meydana gelebilen DNA baz sıralanmasında oluşan bozukluklar birkaç grupta incelenebilir [47].
1) Bir gen üzerinde tek bir baz çiftini etkileyen değişiklikler: Bu tip mutasyonlara
‘nokta mutasyonları’ (point mutation) denir. Tek bir baz çiftini etkileyen bu mutasyonlar da farklı sınıflara ayrılabilir [52,56].
a) Bir baz çiftinin yerine başka bir baz çiftinin girmesi (base substitution):
Bu tip değişiklikte, gen yapısındaki bir pürin yerine diğer bir pürinin ( A yerine G ya da G yerine A) veya bir pirimidin yerine diğer bir pirimidinin ( T yerine C veya C yerine T) girmesi söz konusu olabilir. Nokta mutasyonlarının bu tipine ‘geçiş’
(transisyon) denir. DNA yapısında bir pürin yerine bir pirimidin ( A veya G yerine T veya C’nin geçmesi yada bunun tersi ) geçmesi de mümkündür. Bu tip mutasyonlara da ‘çapraz geçiş’ ( transversiyon) denir [56]. Nokta mutasyonu oluşturan bromüraçil, nitrikasit, formalin, hardal gazı gibi kimyasal maddeler, DNA’daki özel bazlarla tepkimeye girer ve onların yapısını değiştirir. DNA’da bazların yerine geçen bu kimyasallara ‘baz anologları’ denir. Ayrıca nadir de olsa iki pirimidinin ve pürinin birleşerek A - G ve C - T baz çiftlerini meydana getirmesi; daha sonraki DNA replikasyonlarında A - T ve G –C dönüşmesine neden olur [47]. DNA kalıp olarak görev yaptığı sırada bazların herhangi birinde oluşabilecek ‘tautomerik’ bir değişikliğin, (örneğin, timin’nin ‘keto’ formundan ‘enol’ formuna yada adenin’in
‘amino’ formundan ‘imino’ formuna değişmesi) moleküllerin hidrojen bağı oluşturma özelliklerini de değiştirmesi nedeniyle, timinin guaninle veya adeninin sitozinle çiftler oluşturması olanağı daima vardır [47]. DNA molekülünün, bir protein için olan kodlarının bir parçasında eğer bir bazın yerine bir başka baz geçerse, bu genin transkripsiyonu sonucu oluşacak mRNA’nın yapısına hatalı bir baz katılacaktır ve sonuçta bu durum protein sentezinde de yer değiştiren aminoasitlerle sonuçlanır. Bu mutasyona ‘yanlış anlamlı mutasyon’ denir. Bazen de yer değiştiren bazların etkisi sonucu mRNA molekülünün ortasında bir stop (anlamsız) kodonun
meydana gelmesiyle fonksiyonel bir proteinin sentezi engellenebilir ve protein yalnızca bir fragmenti sentezlenmiş olur. Böyle mutasyonlara ‘anlamsız mutasyon’(nonsense) denir [34].
b) Gendeki bir bazın aradan çıkması veya yeni bir baz çiftinin yapıya girmesi: DNA molekülü içinde bir nükleotid’in yapıdan ayrılmasına ‘delesyon’, yapıya katılmasına
‘insersiyon’ denir. Örneğin; benzopiren, endüstriyal baca kurumları, sigara katranı ve aflatoksin, besinlerde ve hayvansal ürünlerde bulunmuştur. Bu maddeler DNA’dan baz çıkarır yada DNA’ya baz ekleyerek nokta mutasyonuna sebep olurlar. Nokta mutasyonu geçirmiş bir genin kontrolünde olan bir polipeptit zincirindeki aminoasit sıralanması, söz konusu bölgeden sonra tamamen değişecektir. Böyle bir değişiklik, sentezlenen protein molekülünün yapısının ve bazı fonksiyonlarının tümüyle bozulması sonucunu doğurur [46].
2) Gende birden fazla baz çiftini ilgilendiren değişiklikler: Bir başka baz çifti mutasyonları da “çerçeve kayması” mutasyonlarıdır (frameshift mutation). Burada bir ya da birden çok nükleotit çiftleri DNA’dan kopar (delesyon) yada DNA’ya eklenir (insersiyon). Bu durum ise okunan çerçevenin translasyonunu değiştirir.
Böylece translasyon sırasında tRNA’ların tanıdığı üçlü baz dizileri değişir. Örneğin, bir genin ortasına bir nükleotit çiftinin girmesi, bu bölgeden aşağıda (down stream) birçok aminoasitte değişikliğe yol açar. Çerçeve kayması mutasyonlarında her zaman uzun mesafede yanlış anlamlı ve inaktif protein üretilir ya da en sonunda bir anlamsız kodonun translasyonu sonlandırması ile protein sentezi durdurulabilir [34,52,56]. Çizelge 2.1 de nokta ve çerçeve kayması mutasyonları gösterilmiştir [7].
Çizelge 2.1. Nokta ve çerçeve kayması mutasyonları THE CAT SAW THE DOG
Bir Harfin Değişmesi Bir Harfin Kaybı Bir Harfin Katılması
THE CAT SAV THE DOG THE ATS AWT HED OG
C nin kaybı
THE CMA TSA WTH EDO G
M nin katılması THE BAT SAW THE DOG
THE CAT SAW THE HOG
Nokta Mutasyonu Çerçeve Kayması Çerçeve Kayması
2.2. Mutajenler
Temel olarak mutasyon oluşturabilen faktörler üç ayrı grupta; fiziksel, kimyasal ve biyolojik olmak üzere sınıflandırılabilir.
Fiziksel Mutajenler
Sıcaklık, manyetik alan, elektriksel alan, UV, x, y, proton, nötron ışınları gibi etmenlerdir. Bunlar genellikle bir baz çiftinin yerini bir başka baz çiftinin almasına yol açarlar. Fiziksel mutajenler etki şiddetine ve sürecine göre geçici veya kalıcı değişimlere yol açarlar [45].
Biyolojik Mutajenler
Biyolojik mutajenler olarak virüsler ve transpozibıl elementler bilinmektedir. Virüs genomu konak hücrenin DNA sına girdiğinde, kendi DNA’sında bulunan bazı genleri konak DNA’ sına ekleyerek onun genetik yapısını değiştirdiğinden dolayı bir mutasyon olarak kabul edilir. Transpozonlar ise genom içinde bir pozisyondan diğerine hareket ederler ve kromozom kopması gibi genetiksel değişikliklere neden olurlar [45]..
Kimyasal mutajenler
Etki biçimlerine göre 5 alt grupta incelenir.
Baz Analogları
Baz analoglarının moleküler yapıları nükleik asitlerin purin ve pirimidin bazlarına çok benzediğinden, replikasyon sırasında normal bazların yerine yeni sentezlenen DNA zincirinin yapısına girebilirler. Bunun sonucunda da DNA yapısında bulunan H atomlarında pozisyon değişikliği sebebiyle çok sayıda yanlış eşlenmiş bazın oluşumu sonucu mutasyon meydana gelir. Baz analogları bakteri kültürüne ilave edildiğinde
sentezlenen DNA’nın yapısına girerler ve ilk replikasyonda çift yönlü transisyona neden olurlar. Baz analoglarının kullanılmasıyla geri mutasyon meydana getirilebilir [45].
DNA’da baz değiştiren maddeler
Bu moleküller dinlenme halindeki DNA’nın yapısına girerek bazlarını değiştirirler.
En önemlisi nitröz asidi (HNO2) dir. Doğrudan doğruya DNA bazlarında amino gruplarını çıkarırlar veya baz sırasını değiştirirler. Örneğin, böyle bir etki adenini hipoksantine çevirip sitozinle bağlanmasını sağlar. DNA bazları çok farklı bir yapı kazanabilirler. Bu yeni yapısıyla baz, orijinal bazdan çok farklı bir baz çifti yapmaktadır, tabi genetik kod da değişir [45].
DNA’dan baz çıkaran maddeler
En önemlileri alkilleyici maddelerdir. Kükürt, nitrojen, etilenoksit ve daha az toksik olan etil-metan-sülfonat (EMS) bu gruba girer. Alkilleyici maddeler spesifik olarak guaninin N7 pozisyonunu etkiler. Bu etki sonucu DNA’daki deoksiriboz bağı gevşer ve 7-alkil guanin DNA’dan ayrılır. Sonuçta, DNA’da oluşan pürin boşluğuna 4 bazdan herhangi birisi gelebilir. Hem transisyon hemde transversiyon tipi mutasyon görülebilir [45].
Akridin boyalar
Bu maddeler genellikle C-G...A-T veya A-T...T-A şeklinde transversiyonlara yol açar. Akridin mutasyonları diğer transversiyon mutasyonlarından farklı olarak daima gen fonksiyonlarının tümüyle kaybolmasına yol açar. Birden fazla baz çifti içeren DNA segmenti gen yapısından çıkar (delesyon) yada uzun DNA segmentleri gen yapısına girer (insersiyon). Akridin boyalarının mutasyona yol açtıkları noktalar DNA üzerinde gelişi güzel dağıtılmıştır ve bu noktalara ‘hot spots’ (sıcak noktalar) denir [45].
S.O.S bağımlı mutajenler
Bazı mutajen olan kimyasallar etkilerini S.O.S onarım sistemini kullanarak gösterirler. Bu maddelere ‘S.O.S bağımlı mutajenler’ denir. Bunlara 4-nitro quinolin, benzopiren, aflotoksin, UV ışığı örnek verilebilir. Mutajenler birden fazla bazı etkilediğinde yanlış eşleşen bazların miktarı artacağı için replikasyon engellenecektir. Bunu engellemek için S.O.S yolunun uyarılması gerekir.
Araştırıcılar, bitkilerden izole edilen bitki özütlerinin anti mutajen olup olmadığını S.O.S yöntemi ile araştırmışlardır. Sonuç olarak S.O.S’i baskıladığı düşünülen kimyasal maddelerin, S.O.S aktivitesi sonucu meydana gelebilecek mutasyonları engellediği veya azalttığı, YE’nin (yucca ekstraktı) S.O.S de aktivite gösteren UMU genini baskılayarak mutasyonu azalttığı tespit edilmiştir [45,56-59].
2.3. Metabolik aktivasyon
Organizmalarda meydana gelen ve yaşam için gerekli olan bütün kimyasal olaylara
‘‘metabolizma’’ adı verilir. Çok sık kullanılan ilaçların, kimyasalların enzimlerin etkisi ile kimyasal değişikliklere uğramasına ise; ‘‘biyotransformasyon’’ denir.
Biyotransformasyon sonucu ilaçlar ve diğer kimyasallar genellikle daha az etkili veya etkisiz bileşikler haline getirilir. Bu yüzden biyotransformasyona,
‘‘biyoinaktivasyon’’ veya ‘‘detoksifikasyon’’ (zehirsizlenme) da denilir [60]. Bazen ilaçlar, biyotransformasyon sonucu daha etkili (kodein’in morfine, difenoksilat’ın difenoksin’e dönüşümü gibi) ve/veya daha toksik (metil alkol’ ün formaldehid ve formik asid’e, asetaminofen’in N-asetil-p-benzokinonimin’e dönüşümü gibi) bileşikler haline dönüşebilirler. Bu da, önilaç- ilaç (İnaktif prekürsör = Prodrog) şeklinde ifade edilebilir. Bazen de, etkisiz bir bileşik vücutta biyotransformasyon sonucu etkili hale getirilebilir (Bakampisilin’ in Ampisilin’ e dönüşümü veya Enalapril’ in Enalaprilat’ a dönüşümü gibi) [61,62].
Biyotransformasyon sonucu ilaçlar daha polar hale gelirler, lipid/su partisyon katsayıları azalır ve suda çözünürlükleri artarak vücuttan daha kolay atılırlar. Vücutta sadece ilaçlar değil, diğer bütün kimyasallar da biyotransformasyona uğrar. Besinle
alınan doğal bileşikler dışında kalan ve çeşitli yollardan vücuda giren kimyasal maddelere, ilaçlar dahil, ‘‘zenobiyotikler’’ denilir. İlaç dışındaki bazı zenobiyotikler;
gıda katkıları, insektisid ve fungusid atıkları, hava ve suyu kirleten atıklar, egzoz ve sigara dumanı şeklinde sıralanır [63].
Biyotransformasyon yapan enzimlerin bazıları az veya çok tüm hücrelerde bulunur.
Büyük kısmı ise, spesifik olarak belirli organlarda (karaciğer, GİS mukoza ve lümeni, böbrek, akciğer ve diğer yapılardır) yer alır. Karaciğer, metabolizmada başrol oynayan organdır. Buradaki en önemli fraksiyon; mikrozomal enzimlerdir.
Biyotransformasyonla ilgili enzimatik olaylar esas olarak iki fazda gerçekleşir:
Birinci faz reaksiyonları oksidasyon, redüksiyon ve kopmadır. İkinci faz reaksiyonları ise konjugasyondur. Oksidasyon, karaciğer parenkima hücresinin mikrozomal sitokrom P450 enzimleri tarafından yapılır. Bunlara, karma fonksiyonlu
‘‘oksidazlar’’ veya ‘‘monooksijenazlar’’ denir ve ilaç molekülüne oksijen sokarlar.
Ayrıca bu sistemle eşgüdümlü çalışan NADPH-sitokrom P450 redüktaz sistemi vardır. Enzimin aktif noktası demir iyonudur. Halen varolan ilaçların metabolizmasına en fazla 5 mikrozomal enzim katkıda bulunmaktadır. Redüksiyon, NADPH, FAD ve diğer flavinlerin yardımıyla olur. Olayların çoğu aldehidlerin alkollere dönüşümü, Azo (N=N) grubunun aminlere dönüşümü ve nitro grublarının amin veya hidroksilamin grubuna dönüşümü şeklinde olur. Kopma, ya ilaç molekülünden bir grubun koparılması ya da molekülü oluşturan daha ufak moleküllere ayrılması şeklinde gerçekleşir. Konjugasyon, bir ilaç veya onun metabolitinin molekülüne bir radikalin veya endojen bir molekülün kovalent bağla bağlanmasıyla olur. Birisi hariç diğerleri mikrozomal olmayan enzimlerle yapılır.
Olaya ‘konjugasyon’, meydana gelen ürünlere de ‘‘konjugat’’ adı verilir.
Konjugatlar, genellikle daha kolay atılabilen polar maddelerdir [60-66].
2.3.1. Mikrozomal enzimler
İlaçların ve kimyasalların metabolizması, çok sayıda ve çeşitte enzim gerektirdiği için, bu olay esas olarak karaciğer hücreleri içerisinde gerçekleşir. Yanı sıra, akciğer, böbrek, barsak lümenindeki mikroflora, gastrointestinal mukoza ve daha birçok
çeşidinde, enzimlerle ilaç metabolizmasına katkıda bulunulmaktadır. Çok sayıda ilaç (penisilin G, atraküryum ve ilaç ön maddesi olan dipiron gibi) non-enzimatik yıkılmaya uğrar [60,63,67,68].
Karaciğer hücrelerindeki Endoplazmik Retikulum’ da (ER), ilaç metabolize edici
‘‘mikrozomal enzim sistemi’’ vardır. Bunlar hücrede ER’ un düz kısmında bulunur.
Oksidasyon olaylarının çoğu karaciğer hücresinin mikrozomal enzimleri tarafından yapılır. In vitro enzim incelemeleri için, hücre homojenize edilirken ER membranı
‘‘mikrozom’’ denilen kürecikler haline dönüşür. Mikrozomal enzim sistemine, sitokrom P450’ ye bağımlı ‘‘karma fonksiyonlu oksijenaz sistemi’’ de denir.
Sitokrom P450, karaciğer ER membranlarında en yüksek miktarda bulunur ve bu miktar toplam protein içeriğinin yaklaşık %20 sini oluşturur. Bir hemeprotein olan sitokrom P450’ nin farklı fakat genellikle çakışan substrat özgüllüğü gösteren birçok formu vardır. Bu da, karaciğer monooksijenaz sisteminin geniş substrat özgüllüğünün bir göstergesidir. Ayrıca, mikrozomal enzim sisteminin diğer önemli koplementerleri; bir flavo protein olan NADPH sitokrom P450 redüktaz ve NADPH’
dan sitokrom P450’ ye elektron taşıyan bir lipid olan sitokrom b5’dir [60,69,70,71].
Mikrozomal bir enzimin, substratı olan bir madde tarafından sentezinin arttırılmasına (ya da yıkımının yavaşlatılmasına) ‘‘mikrozomal enzim indüksiyonu’’, enzimin inhibe edilmesine ise ‘‘mikrozomal enzim inhibisyonu’’ denir. Enzim indüksiyonunun pratik önemi; artmış olan enzim etkinliği sonucu, bu enzimler tarafından inaktive edilen ilaçların vücutta yıkımının artması ve etkinliğinin azalmasıdır. Enzim inhibisyonunda ise, birçok ilacın inaktivasyonu önlenerek onların farmakolojik etkileri güçlenir ve plazmadaki ilaç düzeyleri toksik düzeye çıkabilir.
Bazı ilaçlar, kendilerini yıkan enzimleri indükleyerek, kendi inaktivasyonlarını hızlandırırlar. Bu olaya ‘‘oto- indüksiyon’’ denir. Örneğin, karbamazepin, barbitüratlar, alkol gibi. Bazı ilaçlar ise, sitokrom enzimi tarafından oksitlendikten sonra, reaktif bir ara ürüne (metabolit) dönüşür ve kendini yıkan enzimi inaktive ederek, kendi yıkımlarını yavaşlatırlar. Bu ilaçlara “intihar (suicide tipi) inhibitörler”
adı verilir. Örneğin, etinil estradiol, kloramfenikol, sekobarbital gibi. Enzim
aktivasyonu, ilaç tarafından, enzim sentezi arttırılmaksızın enzim etkinliğinin arttırılmasıdır [61,62,68].
2.4. DNA Onarım Teknikleri
Spontan ya da indüklenen mutasyonlar DNA’da hasara sebep olmaktadır. Bu hasar eğer giderilmezse replikasyon yoluyla aktarılabilir. Bunun sonucu olarak mutant hücre ya da organizmalar oluşur. Buna karşın, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde çeşitli onarım sistemleri gelişerek bu DNA hasarlarını giderme yolunda işlev görmektedir. Bilinen DNA onarım mekanizmaları aşağıda açıklanmaktadır.[72,73]
a) DNA polimeraz proofreading ile onarım
Bakterilerde baz çiftlerinin spontan değişme sıklığı her replikasyon için 10-7-10-11 civarındadır. Diğer yandan DNA polimerazın yeni sentezlenen ipliğe nükleotidleri eklerken yaptığı hata sıklığı ise 10-5 dir. Bu iki değer arasındaki fark polimerazın proofreading aktivitesidir. Çoğu bakteriyel DNA polimerazın 5’-3’ yönünde polimerizasyon, 3’-5’ yönünde ise ekzonükleaz aktiviteye sahip olduğu bilinmektedir. Bu sayede doğru olmayan nükleotidler 3’-5’ yönünde çıkarılarak hata düzeltilir [72,73,77].
b) Fotoreaktivasyon ile onarım
UV ışığı uyarısıyla oluşan timin ya da diğer pirimidin dimerleri 320-370 nm dalga boylu görülür ışığın varlığında direkt olarak geri dönüştürülür. Fotoreaktivasyon ya da ışık onarımı denilen bu mekanizma, fotoliyaz enzimi tarafından katalize edilir.
Fotoliyaz ışıkla aktif hale gelerek dimerleri ayırmaktadır. Fotoliyaz tüm prokaryotlarda ve ilkel ökaryotlar da var iken insanda bulunmamaktadır. Hasarlı DNA fotoreaktivasyon tamir sistemi ile onarılır. Timin dimerini oluşturan bağ, mavi ışıkla aktive olması gereken fotoreaktivasyon enzimi (PRE) tarafından kırılır [72,73,77].
c) Alkilasyon hasarı onarımı
Alkilleyici ajan olarak bilinen mutajenler, memeli hücre DNA’sına metil ya da etil gruplarını aktarırlar. Bu gruplar bazların üzerindeki reaktif bölgelere ya da DNA üzerindeki fosfat gruplarına aktarılırlar. Alkillenen bazlar yanlış baz eşleşmeleri yaparlar. DNA’ daki bu hasar, metil transferaz enzimi ile özgün bir şekilde onarılır.
Bu enzim hatalı bazları değil, sadece onlara bağlı metil gruplarını kopararak uzaklaştırır [72-76].
d) Kesme-çıkarma onarım yolu
Bu mekanizma 1964 yılında bir grup bilim adamı tarafından keşfedilen ve tüm canlılarda gerçekleşen bir onarım mekanizmasıdır. Bu sistem dimerleri ışık gerektirmeyen bir reaksiyonla onardığı için “karanlık onarım” olarak da adlandırılır.
E.coli’ de sadece pirimidin dimerlerini değil, DNA heliksinin distorsiyonunu (bükülme, katlanma) uyaran ciddi hasarları da onarabilmektedir. Hasar uvrA, uvrB, uvrC genleri tarafından kodlanan uvr ABC endonükleaz enzimi tarafından tanınmaktadır. Bu enzim DNA tek ipliğindeki hasarlı bölgede 12 nükleotitli kısmı kesmekte ve boşluk DNA polimeraz 5’-3’ aktivitesiyle doldurulmaktadır [72-76].
e) AP bölgelerinin onarımı
DNA’daki bazlarda deaminasyon gibi bir etki oluştuğunda, sitozin urasile, adenin ise hipoksantine dönüşür. DNA glikosilaz enzimi bu anormal bazı tanır ve hidroliz ederek dizinden koparır. Böylelikle DNA baz dizisi üzerinde, küçük bir boşluk şeklinde meydana gelen Apürinik ya da Apirimidinik bölgeler (AP), AP endonükleaz tarafından tanınır. Prokaryot ve ökaryotlarda homolog olduğu kaydedilen bu AP endonükleaz enzim grubu, DNA ipliğini AP bölgesi yakınından keserek bir çentik açar. Bu noktada DNA polimeraz I devreye girerek eksonükleaz aktivitesiyle birkaç nükleotidi koparır. Ardından 5’-3’ polimerizasyon aktivitesiyle, yeni iplik sentezi gerçekleşir ve eksik olan bazın yeri, doğru nükleotitle tamamlanır [72,73,76].
f) Yanlış eşleşme onarımı (mismatch onarım)
DNA replikasyonundan sonra dizide yer alan yanlış baz eşleşmelerinin pek çoğu, yanlış eşleşme onarımı denilen diğer bir sistem tarafından düzeltilebilmektedir. Bu mekanizma E.coli’ de mut S, mut Z ve mut H genlerinin ürünleri tarafından başlatılır. Yanlış bazlar ekzonükleazla çıkarılır. DNA polimeraz III ve ligaz ile tamamlanır. Yanlış eşleme onarımı, ökaryotlarda da E.coli’ dekine çok benzer şekilde, ancak başka genler tarafından yürütülür. Bu genler hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPMS2 olarak belirlenmiştir. hMSH2, E.coli’ nin mut S geni ile diğer üç gen de E.coli mut L geni ile homoloji göstermektedir. Bu genlerin fonksiyon kaybı, genomdaki mutasyon birikimini arttırdığı için “mutator genler” olarak bilinirler [72,73,76].
g) SOS onarım sistemi
E.coli’ de hasarlı DNA’ ya farklı bir yanıt veren diğer bir onarım şeklidir. DNA sentezi esnasında bir lezyonun üstünden atlamak yerine bu sistem, DNA polimerazın lezyon karşısında replikasyonun devamına olanak veren koşulları hazırlar. Boşluk oluşturulmazken, replikasyonun doğruluğundan fedakarlık edilerek uyum sağlanır.
Bu nedenle sistem “hataya meyilli” olarak tanımlanır. Bu sistemde lexA, RecA ve Uvr ‘de dahil olmak üzere 20 kadar farklı genin ürünlerinin, SOS yanıtında görev yapmak üzere DNA hasarı tarafından uyarıldığı saptanmıştır. Burada ilgi çekici olan nokta; sentezlendiği zaman recA ve uvr genleri ile diğer onarım genlerinin transkripsiyonunu baskılayan lexA protein ürünüdür. Bununla beraber recA proteinini boşluk bölgesindeki tek zincirli DNA’ ya bağlandığı zaman, bu bağlanma her nasılsa lexA baskılayıcı molekülün yıkımını aktivite eder ve onun regülatör görevini bozar. İşlevsel bir represör molekülünün yokluğu, RecA ve Uvr genlerinin aktivasyonuna ve bu yolla onların kodladığı proteinlerin üretiminin artmasına olanak sağlar. Bu ürünler lezyonu geçerek DNA’ yı replike etmesini sağlar. Olay tamamlanınca; recA proteini inaktive hale gelir. Bu durumda, lexA artar, bu da recA ve hedef geni inhibe ederek, SOS sistemini kapatır [74-77].
2.5. Mutajen ve Kanserojenlerin Saptanmasında Kullanılan Kısa Zamanlı Test Sistemleri
Çevremizde bulunan ve biyolojik etkileri bilinmeyen sayıları milyonları bulan sentetik ve doğal maddelerin kanserojenik potansiyelleri açısından test edilmeleri sağlığımız açısından gerekmektedir [48]. Bir maddenin kanserojenik potansiyeli, deney hayvanlarıyla veya insanlarla yapılan uzun zamanlı testlerle veya edipemiyolojik çalışmalarla ölçülmektedir. Uzun zamanlı testler, uygun hayvan türleri seçilerek hayvansal maddenin uygulanmasını takiben yapılan otopside patolojik ve histolojik çalışmalarla ölçülmektedir [41,48]. Memelilerde mutasyon testlerinin yapılmasında en önemli zorluk memeliler mikroorganizmalar gibi mutajenlere çok duyarlı değildirler.
DNA çok farklı bölgelerde ve çeşitli mekanizmalarla hasara uğrayabildiği için hasarın direkt olarak gösterilmesi teknik olarak zordur. Kimyasalların insanda oluşturduğu mutajenik ve karsinojenite olgusunun belirlenmesinde bakterilerin kullanımı, yaşayan tüm canlıların ortak genetik materyali olan DNA’ nın primer yapısının incelenmesi temeline dayanmaktadır. Fiziksel ya da kimyasal ajanların DNA’ da meydana getirdiği hasar, bakteriyel mutasyonları ölçebilen kısa-zamanlı testlerle saptanmaktadır [78].
Bakteriler gecelik kültürlerinde çok sayıda gelişirler ve nadir mutasyonel olayların saptanmasına olanak tanırlar. Bakteriyel testlerde; mutajenik etki “ileri=forward” ve
“geri =reverse” mutasyonları belirleyen yöntemlerle ölçülebilmektedir. İleri mutasyonu belirleyen genetik sistemler, geniş bir hedef bölgesinde gerçekleşen mutajen atağından sonra oluşan genetik değişmelerin fenotipe yansıyarak saptanmasını sağladığı için teorik olarak avantajlıdır. Geri mutasyon yönteminde ise mutant bakteriler kullanılmaktadır. Bu bakteriler, fenotipik etkileri kolayca belirlenebilen gen lokuslarında istenilen tip mutasyonun oluşturulmasıyla, amaca uygun halde hazırlanmaktadır. Bu yöntem maruz kalınan test kimyasalının etkisiz olma ya da var olan mutasyonu baskılama sıklığını belirlemektedir. Test kimyasalının genetik hedefi küçük, özgül ve seçicidir. Kullanılan bakteri suşları
mutajenlerin özgüllüğünü gösterecek çeşitli markerlere sahiptir. Geri mutasyon yönteminde en yaygın olarak kullanılan marker, bakterinin büyümesi için gereksinim duyduğu bir aminoasitin, bulunmadığı ortamda gelişerek, geri dönüşüm yapmasıdır.
Mutajenleri tanımlamakta kullanılan test sisteminin her biri farklı bir mutasyonu gösterdiği için değişik test sistemleri gelişmiştir. Bunlardan bazıları DNA hasarlarına sebep olan kimyasalların test edildiği sitogenetik metotlardır. Bu testler kardeş kromatid değişimi (SCE = sister chromatid exhange), comet testi (gen dönüşümleri ve DNA kırılımları ), programlanmamış DNA sentezi (UDS = unscheduled DNA synthesis ), SOS kromotest, transformasyon yöntemi ve Ames/Salmonella yöntemi şeklinde sıralanabilir [3,9,11,14,15,16,18,19].
a) Kardeş kromatid değişimi (SCE) yöntemi:
SCE yönteminin prensibi; kardeş kromatidlerin birbirine kontrast sağlayacak şekilde boyanmasına dayanır. Kardeş kromatidlerden meydana gelen parça değişimi, boyama farklılığından hemen anlaşılır. Bu yöntemler sadece kromozomlarda oluşan yapısal değişimler gözlendiğinden dolayı SCE yöntemi sınırlı amaçlar için kullanılabilir [3,9].
b) Mikronükleus test yöntemi:
Mikronükleus testi bölünme yeteneğine sahip tüm hücrelerde yapılabilen bir testtir ve temel prensibi bazı mitoz anomalileri ve kromozom kaybı gibi durumların ortaya çıkarılmasına yöneliktir. Çekirdek boyanması ile incelenir. Bu amaçla en çok memelilerin polikromotofil (PCE) ve normokromotofil (NCE) eritrositlerinde çalışmalar yapılmaktadır [3,9,14,16,].
c) CA ve COMET test yöntemi:
CA yöntemi hücrelerin metafaz safhasında incelenerek kromozom hatalarının ortaya çıkarıldığı sitogenetik bir yöntemdir. Comet yönteminde ise DNA da meydana gelen tek ve çift zincir kırıkları tespit edilir [9,15,23].
d) UDS yöntemi:
UDS yöntemi, “programlanmamış DNA sentezi” testi olarak adlandırılır. Bu yöntemin prensibi, primer rat hepatositlerinde DNA tamirinin uyarılmasına dayanmaktadır. UV ile pozitif kontrol deneyleri yapılıp otoradyografik olarak değerlendirilmektedir [9,18,19].
e) Transformasyon yöntemi:
Transformasyon yönteminde, M2-C3H fare fibroblast hücrelerinde malignant transformasyonun uyarılmasıyla kimyasal maddelerin mutajenik ve tümorojenik etkileri ölçülür. Kanserojenik maddelerin tespiti için daha uygun bir testtir [22].
f) UMU test yöntemi:
Umu test yöntemi, DNA hasarları için bir kromojenik testtir. Bu test için sadece tek bir bakteri suşu gereklidir. Yüksek bakteriyotoksik etkilere sahip olan kimyasalların teşhisinde kullanılabilir. Umu test suşu olan TA 1535/ psk 1002’ye eklenen çok kopyalı plazmidler, NR (nitroaren) geni, NAT (N-asetil transferaz) geni ya da her ikisini bakteriye aktarmaktadır. Sonuç olarak bu bakteri suşu DNA hasarına sebep olan “nitroantren” ve “aromatik aminler”e karşı hassasiyet kazanır [10].
2.6. Salmonella Ames Mikrozom Mutajenite Test Sistemi
Çevremizde bulunan ve biyolojik etkileri bilinmeyen sayıları milyonları bulunan sentetik ve doğal maddelerin kanserojenik potansiyelleri açısından test edilmeleri sağlığımız açısından gerekmektedir. Bir maddenin kanserojenik potansiyeli, deney hayvanlarıyla veya insanlarla yapılan uzun zamanlı testlerle veya epidemiyolojik çalışmalarla ölçülmektedir. Uzun zamanlı testler, uygun hayvan türleri seçilerek hayvansal maddelerin uygulanmasını takiben yapılan otopside patolojik ve histolojik çalışmalarla ölçülmektedir.
Bruce Ames tarafından geliştirilen Salmonella typhimurium mikrozomal test sistemi, mutajen ve kanserojen maddelerin tespitinde kullanıldığı gibi, basta antioksidanlar olmak üzere çeşitli antimutajenik ve antikanserojenik etkileri olan inhibitör
