400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ
ISLAHINDA KULLANIMI
400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ
ISLAHINDA KULLANIMI
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
Hafta-1 Tarım Bitkileri, Biyoçeşitlilik, Transgenik Bitkiler Hafta-2 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA)
Hafta-3 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA)-UYGULAMA Hafta-4 PCR (Polimerase Chain Reaction)
Hafta-5 PCR (Polimerase Chain Reaction)-UYGULAMA Hafta-6 Kapiller Elektroforez
Hafta-7 Moleküler Markörler ve SSR (Simple Sequence Repeats) Hafta-8 Kapiller Elektroforez - UYGULAMA
Hafta-9 SNP Markırlar, Yeni Nesil Sekanslama Teknikleri ve SNP Haplotiplemesi Hafta-10 DNA Barkodlama
Hafta-11 Markıra Dayalı Seleksiyon (MAS) Hafta-12 Haritalama Yaklaşımları
Hafta-13 Dizi Analizi
Hafta-14 Dizi Analizi-UYGULAMA
Hafta 13: Dizi Analizi
Hafta 13: Dizi Analizi
S ek an s( =d iz i a na liz i)
• DNA örneğindeki nükleotidlerin tam dizisinin belirlendiği bir yöntemdir.
• Bu amaç için günümüzde uygulanan yöntem dideoxy metodudur.
• DNA, dört çeşit deoksinükleotid trifosfatla sentezlenir. Her bir nükleotid 3′ -OH ucundan bir sonraki nükleotide bağlanır.
• Dideoksi metoduyla sentetik oligonükleotid sentezinde 3′ -OH molekülü kritik rol oynar.
• Sentez sırasında zincire bir dideoksinükleotid eklenmesi zincir uzamasını sonlandırır.
• Çünkü 3. karbon atomundaki 3′ -OH molekülünün oksijen atomu bulundurmaması zincirin uzamasına izin vermez.
• Bu nedenle metod aynı zamanda zincir sonlandırma (chain
termination method ) olarak da adlandırılır.
•
Prosedür PCR nin işleyişine benzer
•
DNA tek zincir haline getirilir.Reaksiyona girecek olan karışımda bol miktarda dört çeşit normal nükleotid
– dATP – dGTP – dCTP
– dTTP bulunur.
•
Karışımda aynı zamanda diziyi rastgele sonlandırmak için farklı renkte flouresan kimyasallarla işaretlenmiş dideoxynukleotidler vardır.
– ddATP – ddGTP – ddCTP – ddTTP
•
DNA polymerase I ise sentezde zincirin uzaması aşamasında gereklidir.
• Zincir uzaması esnasında normal nükleotidler sırayla eklenir; fakat DNA polimeraz normal deoxynükleotid yerine dideoxy nükleotid (renkli olarak gösterilen) eklediği zaman zincirin uzaması sonlanır.
Bu eklenme rastgele olduğu için değişik uzunluklarda milyonlarca fragment oluşur.
• Bu fragmentler aynı zamanda sonlandıkları noktada kendilerine
özgü flouresan boya da taşımaktadırlar.
• Reaksiyon sonrasında elektrokinetik enjeksiyon sistemiyle çalışan cihazlarda fragmentler, kısadan uzuna doğru ayrılırlar.
• Bu ayrım kapillerin içerisinde o kadar hassas yapılır ki, birer nukleotid uzunluk farkıyla birbirlerini izlerler.
• Sonlandırıldıkları noktada dideoxynükleotid taşıdıkları için her bir fragment dört çeşit dideoxynükleotidten birine ait floresan boyada bulundurmaktadır.
• Kapillerde bulunan küçük cam pencerenin önünden geçerken cihazın lazer sistemi floresan boyaları uyararak her birinin kendine özgü dalga boyunda ışıma yapmasını sağlar.
• Yine cihaza entegre bir kamera sistemiyle bu ışımalar kaydedilir
,sıraya konup değişik bilgisayar değerlendirmeleri işlemlerinden
geçirildikten sonra DNA dizi bilgisine ulaşılır.
Kalıp DNA Kalıp DNA
• Sanger-Coul sonzincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır.
• PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır.
• Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıpDNA
yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna
aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun
hassasiyetini bozacaktır.
• Kapiler kanallı otomatik dizi analiz sisteminde, dizi analizi uygulamalarında kullanılabilecek DTCS kiti, aşağıda belirtilen içeriğe sahip olmalıdır.
– 10x Sequencing reaction buffer, – dNTP Mix,
– ddUTP dye terminator, – ddGTP dye terminator, – ddCTP dye terminator, – ddATP dye terminator, – Polymerase enzyme, – Glycogen (20 mg/ml), – Mineral oil,
– Sample loading solution (SLS),
– pUC18 control template,
• Kapiler kanallı otomatik dizi analiz sisteminde, dizi analizi
uygulamalarında kullanılabilecek DTCS kit içeriğindeki boya
sonlandırıcı ddNTP moleküllerinin her biri (ddUTP, ddGTP, ddCTP,
ddATP), kırmızı ışık bölgesinde eksitasyon ve emisyon
spektrumuna sahiptir.
• Dizilenecek üründen DNA elde edilir.
• Elde edilen DNA miktarı ve kalitesi (Nanodrop ND1000) ölçülür.
• Çok düşük (10-50ng/mikrolitre) DNA’ ya sahip olan örneklerde, dizi analizi sonucu gerçekleşmeyebilir.
• DNA miktarı yüksek ve saf olan örneklerde tür tanımı daha doğru
yapılabilmektedir.
• Amplifikasyon sonrasında PCR ürünü mutlaka elektroforezde yürütülürek, kontrol edilmelidir.
• PCR sonrasında mutlak pürifikasyon yapılır.
• Pürifikasyon için genellikle spin-kolon protokolü kullanılmaktadır.
• Pürifiye edilen ürün otomatik sekans cihazına yüklenir.
Sonuçların Değerlendirilmesi Sonuçların Değerlendirilmesi
• Elektoroforez işlemi tamamlandıktan sonra bilgisayar ana menüsünden“Sequence Analysis”programı açılır ve yürütülen örnek burada analiz edilir.
• Analiz sonrası örnek isminin bulunduğu alan fare yardımıyla çift tıklandığında örneğimizin baz dizisi yeni bir ekran üzerinde renkli pikler halinde görünür. Her bir pik bir DNA fragmentine karşılık gelir.
• Piklerin rengi ise söz konusu DNA fragmentinin son bazı olan ddNTP’li bazın rengidir. Her bir pik üzerinde o pikin son bazının ilk harfi renkli olarak yazılıdır.
• Eğer istenirse baz dizisi metin olarak da alınabilir ya da her iki sonuç
yazdırıcı vasıtasıyla kağıda aktarılabilir.
Ders KapsamındaYaralanılan Kaynaklar
Ders KapsamındaYaralanılan Kaynaklar
1.
Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G. ve Hohenlohe, P. A.
2016. “Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics”, Nature Reviews Genetics, 17(2), 81.
2.
Biotechnology of Fruits and Nut Crops (Editor:R. E. Litz)(2005)
3.
Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants(Fruits and Nuts) (Editor:Chittaranjan Kole)(2007)
4.
Genomics-Assisted Crop Improvement, Volume 1(Editor: Rajeev K.
Varshney, Roberto Tuberosa) (2007)
5.
Model Plants and Crop Improvement(Editors: R. K. Varshey, R. M. D.
Koebner)(2007).
6.
Plant Molecular Breeding (Editor: H. John Newbury)(2003)
7.
