400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ
ISLAHINDA KULLANIMI
400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ
ISLAHINDA KULLANIMI
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
Hafta-1 Tarım Bitkileri, Biyoçeşitlilik, Transgenik Bitkiler Hafta-2 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA)
Hafta-3 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA)-UYGULAMA Hafta-4 PCR (Polimerase Chain Reaction)
Hafta-5 PCR (Polimerase Chain Reaction)-UYGULAMA Hafta-6 Kapiller Elektroforez
Hafta-7 Moleküler Markörler ve SSR (Simple Sequence Repeats) Hafta-8 Kapiller Elektroforez - UYGULAMA
Hafta-9 SNP Markırlar, Yeni Nesil Sekanslama Teknikleri ve SNP Haplotiplemesi Hafta-10 DNA Barkodlama
Hafta-11 Markıra Dayalı Seleksiyon (MAS) Hafta-12 Haritalama Yaklaşımları
Hafta-13 Dizi Analizi
Hafta-14 Dizi Analizi-UYGULAMA
Hafta 2:
Nükleik Asit izolasyonu (DNA) Hafta 2:
Nükleik Asit izolasyonu (DNA)
Doku: değişik dokulardan(nuclear ve organel DNA lar) Doku durumu: genç dokular
Doku hazırlığı: sıvı azot tercih edilerek çalışılmalı, dokunun doğru şekilde parçalanması
Çalışma koşulları:
Dnase bulaşık olmaması
+4C çalışma koşulları
DNA izolasyonu aşaması
•
İzolasyon buffer: genellikle pH:8(Tris-HCl vb)
•
Tuz(NaCl vb): Proteini-DNA dan uzaklaştırma
•
Deterjan(SDS, sarkosyl vb): hücre membranlarının gerçirgenliğini (çözünürlüğünü) artırmak
•
EDTA Mg iyonlarını çöktürür, (tutar)(Mg iyonları DNAse aktivitesini artırır)
•
Protein denaturantlar (phenol, kloroform vb)
•
Protein uzaklaştırıcılar: Fenol, kloroform veya protease (proteinase K vb)
•
Polysakkaritlerin uzaklaştırılması(CTAB)
DNA izolasyonu sonrası
•
DNA spektrofotometrik ve görsel olarak belirlenir(spec., nanodrop veya moleküler ağırlığı(MW) bilinen DNA lar kullanılır).
•
Spec. uygun seyreltmeler yapılır(DNA:Su =5:95, 2:98 gibi)
•
Hesaplamalarda
•
miktar (A260)
•
Spec. A260(ug/ml=ng/ul)
•
Spec. okumasıXSeyreltme faktörüX50
•
saflık (A260/280)
•
A260/280: 1.8-2.0
•
Saklama koşulları
•
Kısa süreli: -20 C
•
Uzun süreli –80 C
Protokol
•
Lefort, F., Lally, M., Thompson, D., Douglas, G.C. 1998. Morfolojical traits microsatellite fingerprinting and genetic relatedness of a stand of elite
oaks(Q. Robur L.) at Tuallynally, Ireland. Silvae Genetica 47, 5-6.
1. 100mg yaprak dokusuna, 1 ml DNA ekstraksiyon solusyonu* eklenir (örnek başına 10 µl 2-Merkaptoethanol içerir)
2. Örnekler 65 ˚C – 15 dk su banyosunda arası çalkalayarak bekletilir. Daha sonra oda koşullarına soğutulur.
3. Üzerine 0.7 ml kloroform/ isoamil alkol (24:1) eklenerek 20-25 defa sallanır. 30 dk buz üzerinde bekletilir.
4. 10 dk. 14.000 rpm de santrifüj edilir.
5. Üst sıvı (süpernatant) (~0.7 ml) yeni bir tüpe aktarılır.
6. Üzerine ~0.8 ml isopropanol eklenir.
7. 15-20dk. buz üzerinde bekletilir (Tercihen -20˚C de gece boyu bekletilebilir).
8. 3 dk 14.000 rpm de santrifüj edilir.
Protokol
9. Üst sıvı atılır.
10. Alt katı (pellete) üzerine 1 ml (70 %) ethanol eklenir ve 2 dk. 14.000 rpm de santrifüj edilir.
11. Ethanol uzaklaştırılarak pellet kurtulur ve 50-100 µl TE (pH 8) veya H
2O (nuclease free) da cözülür (pipetajla pellet oynatılır, gece boyu 4˚C de tutularak DNA 'nın çözülmesi sağlanır)
12. 100 µl DNA için 3 µl RNase eklenir. 37 ˚C de 20 dk bekletilir.
Son konsantrasyon 50 ml 50 mM TRIS pH 8.0
50 mM EDTA pH 8.0 0.4 M LiCl
1 % CTAB 2 % PVP
0.5 % TWEEN 20
2 ml 1 M TRIS pH 8.0 4 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 10 ml LiCl 4 M
1 g CTAB 2 g PVP
0.5 ml TWEEN 20
DNA ekstraksiyon solusyonu *
Ders KapsamındaYaralanılan Kaynaklar
Ders KapsamındaYaralanılan Kaynaklar
1.
Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G. ve Hohenlohe, P. A.
2016. “Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics”, Nature Reviews Genetics, 17(2), 81.
2.
Biotechnology of Fruits and Nut Crops (Editor:R. E. Litz)(2005)
3.
Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants(Fruits and Nuts) (Editor:Chittaranjan Kole)(2007)
4.
Genomics-Assisted Crop Improvement, Volume 1(Editor: Rajeev K.
Varshney, Roberto Tuberosa) (2007)
5.
Model Plants and Crop Improvement(Editors: R. K. Varshey, R. M. D.
Koebner)(2007).
6.
Plant Molecular Breeding (Editor: H. John Newbury)(2003)
7.
