400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu
HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA
HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9
HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış
HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım
HAFTA 11: Tüm Genom Dizileme Çalışmaları
HAFTA 11: Tüm Genom
Dizileme Çalışmaları
Tüm Genom Dizileme Tüm Genom Dizileme
• Model bitki Arabidopsis genom dizilemesi ile başlayan tüm genom dizileme (Whole Genome Sequencing= WGS) günümüzde çok sayıda bitki türünde uygulama bulmuştur.
• Arabidopsis dahil bitki genom dizileme “BAC by BAC” stratejisi ile başlatılmış (AGI Initiative), oluşturulan BAC klonları ile fiziksel haritalamalara göre her bir kromozom bölgesini temsil edecek (a minimal tiling path) çok kaliteli okumalarla sekanslamalar yapılmıştır. Oldukça zaman alan ve yüksek ekonomik maliyetlerle geliştirilen BAC yaklaşımıyla arabidopsisten sonra çeltik genomu dizilenmiştir.
• Kavak genom dizilemesi ise tüm genom shotgun (whole genome shotgun:
WGS) stratejesi ile yapılmıştır. Genomik DNA’nın rastgele kırılarak küçük parçalar halinde sekanslandığı ve dizilerin üst üst çakıştırıldığı (assemble) bu stratejide zaman ve ekonomik kayıplar olmamakla birlikte sekanslanmış parçaların (fragmentlerin) genom olarak birleştirilmesi statejinin dezavantajlarındandır. Kavaktan sonra WGS ile 2007 yılında dizilenen bir diğer tür ise üzümdür.
Tüm Genom Dizileme Tüm Genom Dizileme
• Üzümde yürütülen çalışmalarda homozigot (geriye melezlemiş Pinot noir çeşidi) ve heterozigot (şaraplık özellikleri üstün Pinot noir çeşidi) iki genotip dizilenmiştir.
• Sanger dizilemeye dayalı WGS uygulamalarına Yeni Nesil Dizileme (NGS) teknolojilerinin adaptasyonu genom dizileme çalışmalarında önemli derecede ilerlemeler sağlanmıştır.
• Zaman ve maliyet açısından avantajlar sağlayan NGS uygulamalarında sanger dizilemeye eklenen modifikasyonlarla (post sanger) daha küçük çok sayıda fragmentlerin pararalel dizilenmesi yapılarak daha düşük kalitede okumalarla birlikte birlikte geniş aralıklarda dizilemeler başlatılmıştır.
• İlk NGS teknolojisi, Pyrosequencing dayalı FLX 454 sistemi ile bakterilerde başlatılmış, daha sonra ise daha kompleks genomlarda sanger ile kombine edilerek veya tek başına uygulama bulmuştur.
Tüm Genom Dizileme Tüm Genom Dizileme
• Sentezleme sistemine dayanan İlk NGS uygulamalarından birisi ise Illumina tarafından geliştirilmiştir ki, bu yaklaşımda daha kısa okumalara karşın FLX 454’e göre daha büyük çaplı okumalar yapılabilmektedir.
• Illumina ve klasik sanger yöntemi kombine edilerek hıyar bitkisi dizilenmiş ve bu hibrit sekanslama sisteminin bitki genom dizilemelerin ekonomik olduğu belirlenmiştir.
• Kakao ve kavun genomunda BAC klonlarının sanger dizilemesi yapılırken, elma genomunda FLX 454 ve sanger dizileme kombine edilmiştir.
• Özellikle orta uzunluktaki (3-20 kbp) (çiftleştirilmiş uçlar) paired-end kütüphanelerinin kullanıma girmesi ile NGS ‘in kısa okuma uzunluğuna karşın Sanger’ın yerini aldığı görülmektedir.
Tüm Genom Dizileme Tüm Genom Dizileme
• Orman çileği NGS teknolojisi ile (454, Illumina ve SOLID platform’ların kombinasyonu ile) dizilenen ilk tür olmuştur.
• Son yıllarda Illumina platform NGS çalışmalarında en çok kullanılan platform haline gelmiş patates, muz, nohut, portakal, ve karpuz, patlıcan, biber vb ve hatta büyük genomlu türlerden ladin dizilenmiştir. Diğer taraftan genomu referans genom dizilemesine olanak sağlayan Pacbio dizileme teknolojileri günümüzde devreye girmiştir.
Tüm Genom Dizileme Tüm Genom Dizileme
• Kültür Bitkilerinde Yabani Türlerin Genom Dizilenmesi: Bitki kökenli genlerin modifikasyonu, türden türe aktarılması, yabaniden kültür formlarına transformasyonun her geçen gün ilgi odağı olmaktadır.
• Son yıllarda kültür türünün gen havuzunda bulunan yabani genlerinin belirlenmesine yönelik çalışmaların hedeflenmesi ise kültür bitkilerinin gen modifikasyonlarını kolaylaştıracağı gibi özellikle marker free transgenik yaklaşımlarla transformasyonların yapılması halinde dünya ve ülkemiz genelinde transgene teknolojilerini daha optimistik hale getirecektir.
• Yabanilerden genlerin (ORF: Open Reading Fragment ve Kontrol bölgelerinin) klonlanması, lokasyonlarının, ailelerinin vb. belirlenmesi ise genom düzeyinde yabani türlerin tüm verisinin ortaya çıkarılması ile mümkün olmaktadır.
• Bu bakıştan hareketle son 1-2 yılda referans genomu dizilenmiş bitki türlerinin, yabani tür/formlarının dizileri başlatılmış ve tarımsal anlamda önemli özellikleri kontrol eden genlerin yabani bitkilerde tespitine yönlenilmiştir
Tüm Genom Dizileme-Yöntem (İllumina dizileme örneği)
Tüm Genom Dizileme-Yöntem (İllumina dizileme örneği)
• DNA KALİTE ÖLÇÜMLERİ:
• DNA İzolasyonu: %5’lik jel elektroforezi: Jel görüntüleri temel alınarak yapısal bütünlüğünün koruduğu tespit edilmektedir.
• Nanodrop spektrofotometresi (Nanodrop 2000c):Nanodrop sonrasındaki çalışmalarda dsDNA’ların gerçek konsantrasyonunun tespiti için Florometre kullanılmaktadır.
• Numunelerin gerçek konsantrasyonları hesaplanarak, elde edilen DNA konsantrasyonu değerleri istenen seviyelerde (>50 ng/μl) olup, olmadığı kontrol edilmektedir.
Tüm Genom Dizileme-Yöntem Tüm Genom Dizileme-Yöntem
• KÜTÜPHANE HAZIRLAMA:
• Fragmentasyon: Öncelikle genomik DNA örnekleri aynı konsantrasyona gelecek şekilde normalize edilmektedir.
• Bu normalizasyon basamaklarında Qubit ölçümleri esas alınmaktadır. Genomik DNA’nın fragmentasyonu sonucunda 350bp ile 500bp uzunluk arasında DNA fragmanlarının oluşması beklenmektedir.
• Saflaştırma: Solüsyon içerisinde kalan çok küçük veya çok büyük DNA fragmanlarından ve enzim, tampon çözelti gibi kimyasallardan arındırmak amacıyla temizleme basamağı gerçekleştirilmektedir.
Tüm Genom Dizileme-Yöntem Tüm Genom Dizileme-Yöntem
• Bu basamakta kit tarafından sağlanan manyetik boncuklar kullanılmaktadır. Son solüsyon ile karıştırıldığında, DNA ile boncuklar bağlanmakta ve manyetik alan içerisinde çökelti oluşturmaktadır. Süpernatant’ın atılması ve takiben DNA’ın boncuklardan elüsyonu sonucunda saflaştırılmış DNA elde edilmektedir.
• Adaptör eklenmesi: Dizileme basamağı öncesinde her bir numunenin cihaz tarafından tanınmasını ve cihaz içinde yer alan çipe (flowcell) bağlanması için fragmente durumdaki DNA’ların uç kısımlarına adaptör denilen oligonükleotitlerin takılması gereklidir.
Bu oligonükleotitler, hem örneğe has barkod dizilerini içermekte hem de flowcell’de gömülü olarak bağlı bulunan oligonükleotitlere bağlanacak DNA dizilerini içermektedir.
Tüm Genom Dizileme-Yöntem Tüm Genom Dizileme-Yöntem
• Dizileme sırasında, tüm verilerden her bir numuneye ait verilerin ayrıştırılması (demultiplexing) bu barkod dizilerdeki farklılıklara göre gerçekleştirilir. Adaptör ekleme işlemlerinde, öncelikle fragmente durumdaki DNA’ların uç kısımlarının tamamlanması gerçekleştirilir.
• Bu tamamlanma işleminde Taq polimeraz kullanılmaktadır.
Tamamlanma sonrasında, ligaz enzimi kullanılarak adaptör dizileri, fragmente DNA’lara eklenir. Bu bağlanmayı gerçekleştiren fragmanları zenginleştirmek için PCR işlemi gerçekleştirilir.
• Bu işlemde, primerler adaptör bölgelere bağlanacak şekilde çoğaltma işlemi uygulanmaktadır. Bu işlemlerden sonra, ortamda kalan enzim ve diğer kontaminantları uzaklaştırmak için saflaştırma işlemi uygulanmaktadır.
Tüm Genom Dizileme-Yöntem Tüm Genom Dizileme-Yöntem
• Normalizasyon: Genotipler arasında da konsantrasyon açısından bir eşitlik olması, sonuçların karşılaştırılabilirliği açısından önemlidir.
DNA konsantrasyonlarının eşitlenmesi için Qubit florometresi kullanılmaktadır.
• Qubit ile ölçülen her bir numune ardından 1.80 pM olacak şekilde seyreltilmekte, ardından tüm örnekler birleştirilmektedir.
• Dizileme: Dizileme süreci, illumina yeni nesil dizileme platformlarından birisi üzerinden gerçekleştirilmektedir.
• DNA fragmanları öncelikle flowcell adı verilen çipler üzerine yerleştirilmekte, flowcell üzerinde oluşan fragman kümeleri, her bir döngüde 1 baz okunacak şekilde dizilenmektedir. İllumina tarafından geliştirilen “Sequencing-by-Synthesis” yöntemi ile her döngüde, DNA fragmanları 2 farklı boya ile işaretlenmiş 4 farklı dinükleotite maruz bırakılmaktadır.
Tüm Genom Dizileme-Yöntem Tüm Genom Dizileme-Yöntem
• Her bir döngüde, uygun dinükleotitin bağlanmasını takiben floresans kamera ile o kümenin görseli alınmaktadır. Her bir kümeden gelen görseller birleştirilmekte ve sonuçta ilgili kümelerin ışıma karakterlerinden nükleotit dizileri çıkarılmaktadır.
Biyoinformatik Analizler Biyoinformatik Analizler
• Fastq Oluşturulması ve Demultiplexing: dizileme platformu okuma verileri, *.bcl formatında oluşturulmaktadır. Bu verilerden Bcl2fastq v.2.1 (illumina) programı kullanılarak *.fastq dosyaları elde edilmektedir. fastq verileri, içerdiği index verilerine göre farklı örneklere ayrıştırılabilmektedir (Demultiplexing).
• Kalite Kontrol: Kalite kontrol işlemleri amaçlı FASTQC programı (www.bioinformatics.babraham.ac.uk) kullanılmaktadır.
• Okuma Filtreleri ve Trimming: Dizileme sürecinde, Fastq okuma verilerindeki düşük kalitedeki baz okumaları, sonraki analiz basamaklarında false positif sonuçlara neden olmaması için, okumalardan çıkarılmaktadır. Kalite filtreleri ve kesim işlemleri için Trimmomatic uygulaması (http://www.usadellab.org/cms/?
page=trimmomatic) kullanılmaktadır.
Biyoinformatik Analizler Biyoinformatik Analizler
• K-mer Analizi: k-mer dizilerinin tespiti için JELLYFISH adlı program kullanılmaktadır.
• De novo Assembly:Elde edilen okumaların birleştirilerek draft genom parçalarını (contig) oluşturulması için assembler olarak Platanus programı kullanılmaktadır.
Örnek Genom Dizileme Bulguları Örnek Genom Dizileme Bulguları
• DNA örneklerine ait dizileme ham sonuçlarına ait genel veriler
Örnek Filtre Toplam Baz Toplam Okuma
GC (%)
Q20(
%)
Q30 (%) Örnek1
Filtre Öncesi 165. 289.
503. 574
1. 094.
632. 474
36.77 95.84 90.78
Filtre Sonrası
131. 509.
928. 378
870. 926.
678
36.26 98.73 96.03
Örnek 2 Filtre Öncesi 156. 976.
873. 544
1. 039.
581. 944
36.89 96.02 91.06
Filtre Sonrası
126. 857.
989. 838
840. 119.
138
36.44 98.76 96.06
Örnek Genom Dizileme Bulguları Örnek Genom Dizileme Bulguları
• k-mer, dizi birleştirmesinde kullanılmakta olup, DNA dizilemesinden elde edilen dizide yer alan k uzunluğundaki bütün muhtemel alt dizileri ifade etmektedir.
• DNA örneklerine ait k-mer* dağılımları (*k-mer: k uzunluğundaki alt diziler)
Örnek K-mer Boyutu
Toplam Baz Toplam Okuma GC (%)
Örnek 1 17 117. 540. 725. 814 112 1. 049. 470. 766
21 114. 054. 018. 802 106 1. 075. 981. 309
25 110. 567. 449. 023 102 1. 083. 994. 598
Örnek 2 17 113. 382. 788. 271 152 745. 939. 397
21 110. 019. 401. 629 146 753. 557. 545
25 106. 656. 147. 244 142 751. 099. 628
Örnek Genom Dizileme Bulguları Örnek Genom Dizileme Bulguları
• N50 değeri özellikle genom birleştirme işleminde contig uzunluklarını refere etmekte ve birleştirme işleminin kalitesini tanımlamaktadır.
• Bu değer contig uzunluklarının ortalamasına benzer şekilde hesaplanmakta olup, hesaplamalarda daha uzun contiglere daha ön planda tutulmaktadır.
• Başka bir ifade ile N50 değeri genomun %50’sindeki en kısa dizi uzunluğunu ifade etmektedir.
Örnek Genom Dizileme Bulguları Örnek Genom Dizileme Bulguları
• DNA örneklerine ait örnek contig verileri
Örnek Contig Sayısı
Toplam Contig Uzunluğu
N50 En Uzun Contig
En Kısa Contig
Ortalama Contig Uzunluğu
Örnek1 2. 395.
410
1. 444. 263.
388
625 37. 921 300 602
Örnek 2 1. 762.
895
829. 240.
976
1.
296
76. 950 135 470
Örnek Genom Dizileme Bulguları Örnek Genom Dizileme Bulguları
• DNA dizileme sonucu tespit edilen contig’lerin uzunluklarının örnek dağılımı
Örnek Genom Dizileme Bulguları Örnek Genom Dizileme Bulguları
• DNA dizileme sonucunda elde edilen nükleotitlerin oranları
Örnek Adeni
n
Sayısı
Timin Sayısı
Guanin Sayısı
Sitozin Sayısı
N
Sayısı
GC İçeriği (%) Örnek 1 460.
564.
701
458. 315.
159
262. 485.
375
262. 898.
153
0 36.38
Örnek 2 264.
697.
602
261. 582.
256
151. 541.
801
151. 419.
317
0 36.53
Örnek Genom Dizileme Bulguları
Örnek Genom Dizileme Bulguları
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)
2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)
3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)
4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.
2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.
5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.
(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.
