400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu
HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA
HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9
HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış
HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım
HAFTA 5:Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real
Time PCR
HAFTA 5:Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real
Time PCR
Real Time PCR Real Time PCR
• PCR replikasyonun invitro ortamda gerçekleştiridiği bir yöntemdir.
• Real time PCR, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresans sinyalin ölçülmesi ile kısa sürede, kantitatif sonuç veren bir PCR yöntemidir.
• Ticari olarak geliştirilmiş üç tipi bulunmaktadır.
• Bunlar LightCycler (Roche), Tagman (PE Biosystem) ve iCycler (BIO- RAD)’dır.
Real Time PCR Real Time PCR
• Her kuyucuğa öncelikle florasan ışık gönderilir ve geri gelen ışıma toplanır.
• PCR reaksiyonuna florasan problarik, (dizi spesifik , çift sarmal yapıyı tanıyan boyalar) konur ve böylece online şekilde döngü izlenebilir.
Real Time PCR Real Time PCR
• PCR’da esneklik sağlar
• Hızlıdır. Kısa sürede çoklu sonuç alınabilir.
• Doğruluk tekrarı mümkündür
• Çoklu hedefin aynı anda analizine olanak sağlar.
• Her türlü laboratuarda çalışılmaya olanak sağlar.
Real Time PCR Real Time PCR
• SYBER Green
• Hibridizasyon problar
• Hidroliz problar
SYBER Green SYBER Green
• SYBER green çift zincir DNA’nın minör grubuna bağlanır.
• SYBER green melting körv analizine olanak sağlar.
• Gen ekpresyonu analizlerinde total RNA izole edilir ve çift zincirli cDNA’ya çevrilir ve kantitatif olarak miktar tayini yapılması sağlanır.
Real Time PCR Real Time PCR
• Bunun için öncelikle bilinen cDNA konsantrasyonlarına karşı Ct (cycle point treshold) değerlerinin olduğu standart eğri oluşturulmalıdır.
• Daha sonra bilinmeyen örneğin Ct değeri grafiğe yerleştirilerek konsantrasyon belirlenir. Buna mutlak kuantikasyon denir.
• Sınırı spesifik olmayıp yalnızca çift zincire bağlanmasıdır.
Hibridizasyon Propları Hibridizasyon Propları
• 3’ ucu (530 dalga boyu) florasan işaretlidir, 5’ ucunda (640 dalga boyu) ise başka bir prop bağlıdır. 3’ ucu normalde aldığı enerjiyi geri salar.
• Oysa iki prop bir arada iken (maksimum iki baz uzaklıkta) 3’
ucundaki probun saldığı enerjiyi 5’ ucundaki prop alır ve 640 dalga boyunda ışıma verir. Işıma anneling basamağında alınır.
• Buna FRET (florasans rezonans enerji transferi) denir.
• SNP analizine olanak sağlar.
Hidroliz Propları Hidroliz Propları
• Hidroliz proları çalışmaları esnasında parçalandıkları için tekrar kullanılamazlar. Dizi spesifik problardır. Quenter( söndürücü) ve reporter (haberci) olmak üzere iki prop vardır. Işımanın olabilmesi için iki probun bir arada olmaması gerekir.
• Uzama başlayıp Quenter (söndürücü) parçalandığında ancak reporter (haberci) prop ışıma verebilir.
• Yani florosan ışıma PCR’ın elongasyon basamağında alınabilir.
Işımanın şiddeti PCR ürünü ile doğru orantılıdır.
• Melting Curve analizi yapılamaz.
Real-Time PCR Real-Time PCR
• Total veya poliA RNA üzerinden revers transkriptaz enzimi aracılığı ile (random hekzamer yada oligo dt) cDNA sentezi yapılır.
• Gen spesifik ekzon primerleri ile PCR yapılır.
• Yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir.
Real-Time PCR Real-Time PCR
• Kantitatif tayin: SYBER green –hidroliz-hibridizayon
• Melting körv: SYBER green hibridizayon amaç: PCR ürünü özğüllüğü ve SNP analizleridir.
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)
2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)
3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)
4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.
2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.
5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.
(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.
