400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu
HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA
HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9
HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış
HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım
HAFTA 1:Bitki Genom Yapısı-I
HAFTA 1:Bitki Genom Yapısı-I
Bitki Genomu Bitki Genomu
• Nüklear DNA
• Mitokondriyal DNA
• Kloroplast DNA
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Bitki nüklear genomu (DNA) çekirdek içinde yer almaktadır.
• 1990’lardan beri küçük genomlu bitkiler detaylı olarak çalışılmakta, DNA sekanslamaları gerçekleştirilmektedir.
• Günümüzde Arabidopsis, prinç gibi model bitkilere ek olarak mısır, soya fasulyesi, limon, şeker pancarı, üzüm, arpa, patates, domates, kavak vb gibi bitkilerinde genom sekanslamaları tamamlanmıştır.
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Bu güne kadar Angiosperm, Gymnosperm (coniferler), tohumsuz bitkiler (yosun, ciğerotu gibi) ve yeşil alglerle yapılan bir çok çalışmada bitki nüklear genom komposizyonun benzer olduğunu görülmektedir.
• Her bitki hücresi nüklear genoma ilave ve nüklear genomla ilişkili mitokondri ve kloroplast DNA içermektedir.
• Sekanslanması tamamlanan pirinç nüklear genomu, 12 kromozomda bulunan 450 milyon baz çifti (Mbp) içermekte ve yaklaşık 38.000 protein kodlanmaktadır. Bununla birlikte genomda birçok tekrar motiflerinin bulunduğu bildirilmiştir.
• Sekanslanması tam olarak tamamlanan diğer bir bitki; arabidopsis ise toplam 5 kromozomunda (157Mbp) 31.000 gen taşımaktadır.
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Bitki DNA’ sının Kimyasal ve Fiziksel Kompozisyonu:
Her çift zincirli DNA molekülü 4 adet deoksinükleotidten (Adenin, Timin, Guanin, Sitozin- A,T,G,C) oluşmaktadır.Çift zincideki karşılıklı eşleşmelerden dolayı Adenin Timinle (A=T) , Guaninde Sitozinle (G=C) eşit sayıdadır.
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• G+C /A+T oranı yada GC oranı genomda karakteristik özellik konumundadır.
• Bu oran tipik olarak Arabidopsis’de %36 pirinçte ise %44 oranındadır. Genel olarak ekzonda bulunan bitki genleri GC içeriği bakımından daha zengin olmasına rağmen intronlarda ise bu içerik daha düşüktür.
Bitkilerde Genom Paketlenmesi; Kromatin ve Kromozomlar:
• Bitkilerde kromozom büyüklüğü türler içinde değişkenlik gösterirken genellikle 20Mbp’ dan az, ve 900Mbp’ dan daha fazla olarak değişim göstermektedir.
• DNA molekülü 7 ile 300mm uzunluğunda değişmektedir. Nüklear DNA histon olarak bilinen nüklear proteinler ile ilişki halindedir.
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Histon proteinleri artı yüklü aminoasitlerce zengin olan lizin ve arjinini fazla miktarda içermelerinden dolayı DNA’daki eksi yüklü fosfat gruplarına bağlanmaları kolaylaşmaktadır.
• İçerdikleri bazik amino asitlerin oranına göre 5 değişik gruba ayrılırlar:
H1, H2A, H2B, H3 ve H4.
• Histonlar arasında türlere ve dokulara göre en fazla değişikliği H1 histon proteinleri gösterir. H3 ve H4 ise evrimde en iyi korunmuş histonlardır.
• H2A, H2B, H3 ve H4 histonlarının her birinin kromatindeki miktarları DNA’nın yaklaşık iki katıdır, H1 miktarı ise bunların yarısı kadardır.
• Kromozomal paketlenmede en alt birim olan nükleozomlar ise DNA ipliğinin ve histon proteinlerine sarılmasıyla oluşmaktadır.
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Histon olmayan proteinler; Çoğunlukla bazik özellikte olmayan, boyut ve işlevleri bakımından değişik çeşitte bir çok proteini içeren bir grup olup, kromozom yapısına katılan histonlar dışındaki tüm proteinler bu gruba dahildir.
• Histon olmayan proteinlerin bir kısmı direkt kromatinin oluşumuna katılan yapısal proteinlerdir.
• Bunların dışında DNA’nın replikasyonunda ve gen anlatımında görev alan enzimler de bu gruba dahildir.
• Histon olmayan proteinler türlere, bireylere ve hatta bireyin doku ve hücre tipine göre büyük değişiklik gösterebilirmektedir.
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Paketlenme; Kromatin organizasyonunda ilk aşama nükleozom oluşumudur. Nükleozom ikişer adet H2A, H2B, H3 ve H4 histon ve bir adette H1 histon proteininden oluşan 200 baz çifti uzunluğunda DNA’nın paketlendiği bir yapıdır.
• DNA’nın 145 baz çiftlik kısmı sekiz proteinden oluşan iç bölge etrafında yaklaşık 1,75 bir dönüm yapar. Nükleozomlar H1 proteinleri yardımıyla,11 nm’lik ipliksi yapılar oluşturur. Bu sırada DNA serbest haline göre yaklaşık 5-10 kat yoğunlaşmıştır.
• İkinci katlanma olarak bu 11nm’lik iplikçiklerin yeniden katlanmalar yapar ve her dönümde yaklaşık 6 nükleozom yer alacak şekilde oluşan 30nm çapındaki kromatin ipliklerini oluşturmaktadır.
• Bu yapı H1 histonların kendi aralarındaki etkileşimi ile sabit durumda kalır. Bu aşamada DNA yapısı en az 6 kat daha yoğunlaşmıştır (solenoid yapı).
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• 30nm çapındaki kromatin iplikleri daha sonra ileri katlanmalar yaparak ilmek domainlerini oluşturmaktadırlar.
• Telomerler kromozom uçlarında lokalize olmaktadırlar.
• Telomerler kromozomları parçalanmaktan ve istenmeyen birleşmelerden korumaktadırlar.
• Kromozom uçlarının replikasyonunda görev alırlar.
• Telomerler G zengin tekrarlı diziler içerirler. Bitkilerde (TTTAGGG)n tekrarlı diziler içermektedir. Bu tekrar dizileri Telomeraz enzimi ile kromozom uçlarına eklenmektedir.
Bitki Genom İçerikleri ve Birbiri İle İlişkileri
Bitki Genom İçerikleri ve Birbiri İle
İlişkileri
Bitki Genomu- Nüklear DNA Bitki Genomu- Nüklear DNA
• Temel olarak genleri kodlayan ekzon ve kodlanmayan diziler olan intronlardan oluşmaktadır. Bunun yanında düzenleyici diziler, düşük kopya dizileri ve tekrar dizileri bulunmaktadır.
• Bitki genomunda özellikle tekrar dizileri bitki genom ve fonksiyonlarının anlaşılmasında büyük önem taşımaktadır.
• Mikrosatellitler-Simple Sequence Repeats (SSRs): Simple Sequence Repeats (SSR) veya mikrosatellit 2-6 baz uzunluğunda kısa tekrar dizileri olup, ((GA)n, (CA)n,(AT)n, (ATA)n, (CTT)n ve (GATA)n gibi motifleri içeren) yüksek ökaryotlarda genoma özgünlük göstermektedir.
• Evrimsel süreçte büyük ölçüde korundukları için yüksek polimorfik özelliğe sahip olan SSR’ lar özellikle bitki tanımlama ve diğer genomik çalışmalarda önemli avantajlar sağlamaktadır
Bitki Genomik DNA Bitki Genomik DNA
• Çekirdek SSR (nuclear SSR=nSSR) ve Kloroplast SSR (chloroplast SSR =cpSSR)’lara ek olarak bitki genom projeleri çerçevesinde oluşturulan EST (Express Sequence Tags) verilerinin transkripsiyona giren ve girmeyen bölgelerden (UTR=Untranslated Region) tespit edilen EST kökenli, son yıllarda yeni nesil dizileme teknolojileri ile elde edilen SSR’lar bitkilere ait geniş SSR veri tabanları oluşturulmaktadır.
• Transpozon elementler: Genomda bulunan dağınık DNA dizilerinin hareketli DNA dizileri olarak bilinen transposable elementlerden köken almaktadır. Hücre genomunda transpozisyon olarak adlandırılan bir süreçte hareket ederler. Bu dizilerin hareketleri ile çeşitli mutasyon ve DNA miktar değişimleri gözlemlenmektedir (pirinçte genomun %30 oranında transpozon bulunmaktadır).
Bitki Genomik DNA Bitki Genomik DNA
• Sınıf 1 Transpozonlar; İlk defa maya ve böcek genomlarında bulunan bu sınıf transpozonlar genel olarak retrotranspozonları içermektedirler. Retrotransposonlar kendilerini kopyalayıp sonra bu kopyalarını genomda çeşitli yerlere yerleştirirler.
• Retrotranspozonlar önce transkripsiyon yolu ile kendilerini bir RNA molekülü olarak kopyalarlar, sonra bu RNA (çoğu zaman transpozon tarafından kodlanan) bir ters transkriptaz tarafından tekrar DNA'ya dönüştürülmekte ve genoma geri yerleştirilmektedir.
Bitki Genomik DNA Bitki Genomik DNA
• Retrotransposonlar uzun uç tekrar dizilerine (Long Terminal Sequence; LTR) sahip olup olmadıklarına göre iki gruba ayrılırlar: LTR'li retrotranspozonlar LTR dizilerinde promotörler ve retrotranspozisyon için gerekli olan en az iki enzimin genleri bulunmaktadır.
• LTR'siz retrotranspozonlar da promotör içermekte ve RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonları gerçekleşmektedir.
• Sınıf 2 Transpozonlar; DNA kopyaları olarak hareket ederler ve bitkilerde en çok Ac/Ds, En/Spm and Mu gibi transpozonları ve Mariner superailesine ait sınıf 2 transpozonlar yer almaktadır.
• Bunlara ilave olarak; Mariner transpozonlarından meydana gelen kısa diziler genomda yoğun olarak bulunurlar ve bunlara miniature inverted-repeat transposable elements-MITES denilmektedir.
Bitkilerde DNA Varyasyonu Bitkilerde DNA Varyasyonu
• Bitkilerde Nüklear DNA içerikleri bir gamet içerisindeki çekirdek miktarı olarak bilinmektedir (1C value). Nüklear DNA içerikleri ;
• 1C çekirdek içerisindeki DNA kütlesi (pikogram)
• 1C çekirdek içerisindeki DNA’da bulunan baz çifti sayısı (megabaz) olmak üzere 2 farklı biçimde açıklanmaktadır. Bu iki açıklama birbiri ile ilişkilidir; ~1pg=1000Mbp.
• Bitkilerde 1C değerleri geniş çeşitlilik göstermektedir.
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)
2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)
3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)
4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.
2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.
5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.
(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.
