400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu
HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA
HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9
HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış
HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım
HAFTA 10: Bitkilerde Ters Genetik (miRNA)
HAFTA 10: Bitkilerde Ters
Genetik (miRNA)
RNAi yaprak gelişim etkisi
1. RNAi (RNA interference) (Gene Sliencing = Gen susturma)
Kodlanmayan RNA Tanımlanması Kodlanmayan RNA Tanımlanması
• Küçük kodlanmayan RNA’lar hücre ölümünün tanımlanmasında ve hücre gelişiminde kritik düzenleyiciler olarak oluşmaktadırlar. Bu RNA’lar 18-30 nükleotit uzunluğunda olup, genomik DNA tarafından transkribe olmaktadırlar. Kodlanmayan RNA’ lar protein üretimine katılmamaktadırlar. Birçok önemli süreçte (hücre farklılaşması gibi) yer alan iki sınıf ncRNA (kodlanmayan RNA) tanımlanmaktadır.
Kodlanmayan RNA Tanımlanması Kodlanmayan RNA Tanımlanması
• Bunlar microRNA’lar (miRNA) ve small RNA (siRNA)’lardır. Bu RNA’lar birçok organizmada gen ekspresyonunda post- transkripsiyonel düzenleyiciler olarak görev yapmaktadır. Olgun miRNA ve siRNA’lar genlerin genellikle UTR’de bulunan komplementer dizileri bağlarlar ve translasyon düzenlenmesi amaçlı hedef mRNA’ ların degredasyonunu tetiklemektedirler.
Kodlanmayan RNA Tanımlanması Kodlanmayan RNA Tanımlanması
• Yeni nesil sekanslama teknolojilerinin ncRNA araştırmalarına büyük etkisi bulunmaktadır. Mikroarray uygulamaları da ncRNA araştırmalarında kullanılmaktadır ancak mikroarray teknolojisi sadece bilinen miRNA ve siRNA’ların tanımlanmasına olanak sağlamaktadır.
• Farklı türlerde yüksek miktarlardaki ncRNA ayrımından dolayı, yeni ncRNA genlerinin istatistiksel tanımlanmasında bazı sınırlamalar oluşmaktadır. Kısa dizi sekanslama teknolojileri yeni miRNA ve siRNA tanımlanmasında yüksek etkinlik göstermektedir. Roche 454 teknolojisi ile bugüne kadar birçok türde kodlanmayan RNA’lar karakterize edilmiş durumdadır (Ör; insan embiryo kök hücrelerinde 104 yeni ve 334 bilinen miRNA tanımlanmıştır.
MikroRNA-miRNA MikroRNA-miRNA
• MikroRNA’lar (miRNA), 18-22 nükleotid uzunluğunda, post- transkripsiyonel seviyede gen ekspresyonunu düzenleyen, kodlanmayan RNA molekülleridir.
• Pri-miRNA yapısı (Mavi-kırmızı bölge mature miRNA-miRNA*
dupleksi)
MikroRNA-miRNA MikroRNA-miRNA
• miRNA’lar, hedef mRNA ya komplementerlik esasına göre bağlanır.
Bir miRNA birden fazla mRNA’yı hedef alabilmektedir.
• miRNA hedef mRNA ile tam veya tama yakın komplementer ise hedef mRNA’yı keserek parçalar, kısmi komplementer olması durumunda ise hedef genin translasyonunu baskılayarak etki göstermektedir.
• miRNA’larintergenik veya intronik olarak sınıflandırılabilir. İntergenik miRNA’lar bağımsız transkripsiyon birimine sahiptir ve kendi promotorları vardır.
• İntronik miRNA’lar ise kendilerinin host genleri ile aynı promotoru paylaşmaktadır.
Biyosentezi Biyosentezi
• miRNA geni RNA polimeraz II tarafından pri-miRNA (5' cap ve poly- A kuyruklu) olarak transkribe edilmektedir. Drosha (RNase) tarafından 60-70 nt uzunlukta, stem-loop yapıda ve 3’ overhang olacak şekilde uzun pre-miRNA haline getirilmektedir. Pre-miRNA, exportin5 tarafından sitoplazmaya taşınmaktadır.
• Dicer (RNase) tarafından ~22 nt uzunluğunda olgun miRNA- miRNA* dubleksine dönüştürülmektedir. Dicer bu işlem sırasında TRBP, PACT ve Argonat proteinleri ile etkileşim halindedir ve bu şekilde RISC (RNA-induced silencing complex) kompleksi oluşmaktadır.
Biyosentezi Biyosentezi
• RISC kompleksi içinde miRNA dubleksinin bir zinciri (passengermiRNA) çıkartılarak, hedef mRNA’ nın komplementeri olan tek zincirli miRNA (guide miRNA) kompleks içinde kalmaktadır.
miRNA’nın 5’ ucunda 7-8 bazdan oluşan “seed” dizisi mRNAnın 3’
UTR bölgesi ile kısmen komplementerdir.
• Sonuçta mRNA’nındegrade olması veya translasyonun baskılanması yoluyla post-transkripsiyonel olarak gen susturulmaktadır.
RISC Kompleksi RISC Kompleksi
• RISC kompleksi Argonat (AGO) protein ailesinin üyelerini içerir.
AGO proteinleri bağlandıkları miRNA’yakomplementer olan mRNA dizisine karşı direkt olarak endonükleaz etkiye sahiptir. AGO proteinleri kısmen guide zincir seçiminden ve passenger zincirin parçalanmasından sorumludur.
• Guide zincir AGO tarafından 5’ ucun stabilitesi dikkate alınarak seçilmektedir.
• Böylece aktif miRNA meydana gelir. Aktif RISC kompleksi içindeki birleşmeden sonra, miRNA hedef mRNA’nın 3’ UTR bölgesindeki komplementer bölgeye bağlanarak düzenleyici etkisini göstermekte ve translasyonu baskılamaktadır.
miRNA Fonksiyonları miRNA Fonksiyonları
• miRNA'yabağlı düzenleme, hastalık etyolojisindeve tedavi araştırmalarında kullanılmakta olup, miRNA’ya dayalı terapötikler için klinik öncesi ve klinik denemelere başlanmıştır.
• Bitkilerde, miRNA'lar biyotik (bakteriyel, viral) ve abiyotik(kuraklık, tuz vb.) strese yanıt dahil olmak üzere, bitki gelişimi ve hücre çoğalması gibi çeşitli biyolojik işlemlerde rol alır.
• Bitki stres ile karşılaştığında hücreler homeostasilerini düzenleyerek ve değişen yeni koşullara adapte olarak yanıt verirler. Bu stres yanıtında miRNA aracılı gen düzenlenmesi önemli rol oynamaktadır.
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)
2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)
3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)
4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.
2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.
5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.
(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.
