400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu
HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA
HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9
HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış
HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım
HAFTA 3: RNA İzolasyonu
HAFTA 3: RNA İzolasyonu
RNA izolasyonu başlangıcı
• Yöntem: Çok ve saf RNA veren yöntemler seçilmelidir.
• Doku: değişik dokulardan
• Doku durumu: çok genç dokular tercih edilmelidir
• Doku hazırlığı: örnek toplama aşamasından hemen sonra sıvı azotla muamele edilmelidir, sıvı azotla çalışılmalı, dokunun doğru şekilde parçalanması.
4
RNA izolasyonu başlangıcı
• Çalışma koşulları:
– Çalışma ortamlarına, kullanılacak solusyonlara vb. Rnase uzaklaştırıcılarının uygulaması, sterilizasyon
– Her aşamada +4C çalışma koşulları
5
RNA izolasyonu aşaması
• RNase parçalayıcı etkisinden dolayı hızlı izole edilmesi gerekir.
• RNase inhibitörleri olarak Fenol, guanidine thiocyanate, aurintricarboxylic acid vb. kullanılır.
• Zor cözünen pelletler bilinmeyen maddelerle kontaminasyonu gösterir.
• Jelatinimsi pelletler polisakkarit göstergesidir
• Kırmızımsı pelletler fenoloik birleşikler göstergesidir.
RNA izolasyonu sonrası
• RNA spektrofotometrik, denatüre jel, bioanalyzer vb. yöntemlerle belirlenir.
6
ug RNA/g örnek
Spec.
ölçümü: SU
Spec. okumasıXSeyreltme faktörüX40
7
Spec.
ölçümü: SU
1.8-2.0
Küçükse protein kontaminasyonu
8
Spec.
ölçümü:
10mM Tris- HCl pH:7.5
2.0-2.5 Küçükse
polisakkarit ve polifenol
kontaminasyon u
9
Kaliteli RNA 2 veya daha fazla ribozomal rRNA bantı verir.
Jelin yeterince koşturulması durumunda ek iki bant daha görülebilir
18 S 16S 25S
23s
Kaliteli RNA 2 veya daha fazla ribozomal rRNA bantı verir.
Jelin yeterince koşturulması durumunda ek iki bant daha görülebilir
18 S 16S 25S
23s
• Saklama koşulları: Her zaman -80 C
• Çözülen RNA tekrar dondurulup kullanılmaz
10
RNA izolasyonu -TRIZOL protokolü
1. Örnekler sıvı azotda ezilir.
2. 2 ml lik tüpe 1 ml trizol eklenir.
3. Üzerine 300-500 mg örnek eklenir(1ml pipet ucu kullan)
4. Elle tüp kuvvetli bir şekilde sallanarak karışım sağlanır, vortekslenir ve örnekler oda sıcaklığında 10 dk bekletilir.
5. Üzerine 250 µl kloroform eklenir, karıştırılır.
6. Oda sıcaklığında 10 dk bekletilir.
7. 14.000 rpm de 40C de 10 dk. santrifüj edilir ve üst sıvı yeni tüpe aktarılır.
8. Üzerine 250 µl 1.2M NaCl, 250 µl 0.8 M Na-citrate ve 250 µl isopraponal eklenir.10 dk.
oda koşullarında (tercihen -200C de 10 saat) bekletilir.
9. 14.000 rpm de 40C de 10 dk.santrifüj edilir, üst sıvı atılır(pellet bu aşamada tüp dibinde görülmelidir).
10. Pellet %70 EtOH ile yıkanır ve dikkatlice kurutulur.
11. 20-50 µl RNAase free su ile muamele edilmiş suda çözülür.
11
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)
2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)
3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)
4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.
2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.
5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.
(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222
