400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim

(1)

400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim

Prof. Dr. Ali ERGÜL

Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü

http://biotek.ankara.edu.tr/

(2)

HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu

HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA

HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA

HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA

HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9

HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış

HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım

(3)

HAFTA 12: Bitki Genom Projelerine Genel Bakış HAFTA 12: Bitki Genom

Projelerine Genel Bakış

(4)

Arabidopsis Genomu Arabidopsis Genomu

• Bitkilerdeki ilk genom dizileme çalışmalarında model bitki olan Arabidopsis thaliana’nın kullanılması kararlaştırılmıştır. Çiçekli bitkilere göre daha küçük genoma sahip olmaları, tohumdan-tohuma (seed-to- seed) olan döngülerinin kısa olması (6 hafta), bir bitkiden binlerce tohumun elde edilmesi, kültürünün uygun olması ve Agrobacterium ile transformasyonu avantajları arasında belirtilmiştir.

• 5 kromozom içeren Arabidopsis genomu birçok konsortiyum tarafından dizilenmiştir.

• 120 kb’lık insert içeren 2 BAC kütüphanesi, toplamda 23.000 klon (18x) ile dizilemeye başlanmış, YAC vektörleri (düşük oranda kimerik yapı) ile fiziksel harita, genetik harita yaklaşık 800 markır içermekte ve EST database ile büyütülmüştür. Proje sonucunda EST databaseinde 90.000 giriş yapılmıştır.

• 42.000 BAC sonu/uçları dizilenmiş, 21.000’ den fazla BAC’ta, FPC programı kullanılarak Hind III parmakizi çalışılmıştır.

(5)

Arabidopsis Genomu Arabidopsis Genomu

• Dizilerin birleştirilme ve BAC’ların anotasyon çalışmaları yapılmıştır.

Her grup tarafından anotasyon sonuçları doğrulanmıştır (MIPS websitesi).

• Arabidopsis genomunun, 25.000’den fazla gen içerdiği açıklanmıştır.

• Küçük genoma sahip bitkilerin yüksek derecede dublikasyon içerebileceği (kromozomun %63’ü segmental kromozom dublikasyonu içermekte) belirlenmiştir.

• Bitkiye spesifik genlerin ve gen ailelerinin, yüksek sayıda membran taşıyıcılarının tanımlanmasında, Kloroplast, mitokondri genomları ile Arabidopsis genomu arasındaki kompleks ilişkinin tanımlanmasında yararlanılmaktadır.

(6)

Pirinç Genomu Pirinç Genomu

• İlk bitki genomu dizileme çalışmasının dikotiledon bitki ile gerçekleştirilmiş olması nedeni ile ikinci olarak monokotiledon bir bitkinin genom dizilemesinin yapılması uygun görülmüştür.

• Dünyada tahıllar içerisinde geniş kültüre alınan tahıl pirinç olup, genom büyüklüğü sadece 430Mb’dır. Bu özelliği pirinç genomunu mısır ve buğday gibi tahıllar için kompakt model haline getirmektedir.

• Pirinç genomu dizileme çalışması IRGSP (International Rice Genome Sequencing Program) Japonya liderliğinde başlamış ve bu gruba 10 farklı ülke katılmıştır.

• 12 kromozom IRGSP grubu ülkelerine dağıtılıp ayrıca çalışılmıştır.

• Dizileme çalışmalarında BAC kütüphaneleri (25 genoma eşdeğer), YAC/PAC kütüphaneleri oluşturulmuştur.

(7)

Pirinç Genomu Pirinç Genomu

• Dizileme stratejisi Arabidopsis’teki gibi 97.000 BAC’ın BAC sonlanma uçlarının dizilenmesi ve Hind III parmakizine dayanmaktadır.

• Monsanto tarafından 2000 yılında parçalı (partial) dizileme sonuçları açıklanırken, tüm dizileme çalışması 2005 yılının başlarında tamamlanmıştır.

(8)

Mısır Genomu Mısır Genomu

• USA tarafından gerçekleştirilen mısır genomu dizilenme çalışmasında:

• Genom oldukça büyük (2700-32000 Mb) bulunmuş olup, tekrar dizi sayısı (genomun %80-%85) çok yüksektir.

• Mısır genomu en yüksek retrotranspozon (genomun %65-%70’i) içeriğine sahiptir.

• 3 BAC kütüphanesi, 3 farklı restriksiyon endonükleaz ile oluşturulan toplamda 400.000 klon (26X), 4800 markır ile genetik harita ve EST kütüphanesine 568.000 veri girişi yapılmıştır.

(9)

Yonca (Medicago Truncatula ) Genomu

• Yoncayla yakından bağı olan bir baklagil olup baklagillerde model organizmadır. İnsan ve hayvan beslenmesinde önemli olmasının yanı sıra azot fiksasyonundan sorumlu simbiyozis ile ilişkili genlerin araştırmalarında ekolojik öneme sahiptir.

• Ayrıca tetraploid olan yonca yaprağının (Medicago sativa) diploid atasıdır.

• Medicago truncatula genomu yaklaşık 500 Mb olup 8 kromozom içermektedir. Medicago truncatula genomu, kültürü en geniş yapılan baklagil soya ile karşılaştırıldığında soya genomu oldukça büyüktür (>1000 Mb ).

(10)

Yonca (Medicago Truncatula ) Genomu

• Medicago truncatula genomu dizileme çalışmasında;

• 3 BAC kütüphanesi (23x)

• 495 markır ile genetik harita oluşturulmuş,

• 164,500 EST belirlenmiştir.

• Medicago truncatula genomu 500-550 Mb olarak dizilenmiştir.

Genomunun (500 Mb) yarısından fazlası heterokromatin yapıda olduğu, büyük bloklar ile ayrılarak sentromerlerin her yanında bulunduğu, ökromotin bölgelerin ise daha çok kromozomların kollarında lokalize olduğu, diamino phenylindole (DAPI) floresan yoğunluğu ile belirlenmiştir.

• Hetero ve ökromotin bölgelerin lokalizasyonunda FISH hibridizasyon tekniği kullanılırken, dizilemede BAC by BAC stratejisi kullanılmıştır.

(11)

Kavak Genomu Kavak Genomu

• İlk ağaç genomu dizileme çalışmaları uluslararası (Amerika, Kanada, Belçika) işbirliği tarafından 2002 yılında kavakta gerçekleştirilmiştir.

• Genomu WGS stratejisi ile dizilenmiştir.

• Populus trichocarpa genomu 484 Mb büyüklüğünde olup 19 kromozom seti içermektedir.

• Fiziksel harita BAC’ların parmak izi (BAC fingerprinting) stratejisi ile oluşturulmuştur.

• Gen sayısı yaklaşık 32.000-50.000 olarak tahmin edilmektedir..

(12)

Domates Genomu Domates Genomu

• Domates genomu dizilemesi10 ülkeden (Amerika, Çin, Fransa, Hindistan, İtalya, Japonya, Kore, Hollanda, İspanya ve İngiltere) oluşan uluslararası grup tarafından tamamlanmıştır.

• Genom büyüklüğü 950 Mb olup 12 kromozomda lokalize olmuştur.

• Genomda ökromotin bölge büyüklüğü 220 Mb olarak belirlenmiştir.

• Ökromatin bölgelerinin dizileme stratejisi ‘BAC by BAC’ olup baklagil model organizması L. japonicum’ daki şekilde gerçekleştirilmiştir 3 BAC kütüphanesi (31x) oluşturulmuştur.

• Genetik harita 1825 markır ve BAC-FISH metodu ile lokalizasyonları belirlenmiştir

• Anotasyon çalışmaları 162.000 domates EST’si ve 77 (32’si domatese ait) Solanaceae cDNA kütüphanesi ile tamamlanmıştır.

(13)

Üzüm Genomu Üzüm Genomu

• Proje kapsamında üzüm çeşidi olarak Pinot Noir kullanılmıştır. Pinot Noir üzüm çeşidi en yoğun olarak Fransa’ da yetiştirilmektedir.

Ayrıca, Isviçre, Italya'nin daglik kesimleri ve bazı Doğu Avrupa ülkelerinde rastlanmaktadır. Pinot Noir in tümüyle homozigotluğa yakın (yaklaşık %93) olması seçilmesinde önemli bir etkendir.

• Proje kapsamında vektör olarak BAC (Bakteri Yapay Kromozomu) kullanılmış ve tüm kesilen genom parçalarının kesin klonlanmasını garanti altına almak için belirli bir klon sayısı hesaplanmıştır.

(14)

• Klonlanmış fragmentler DNA parçalarının hemen hemen rastgele sıralanmasıdır bu nedenle kütüphane içinde yerleştirilen bir çok DNA bölgesi bir çok farklı klonda bulunmuştur.

• Klonların uçlarının dizilenmesi Sanger–zincir sonlandırma metoduna göre yapılmıştır. Dizileme sonucu sekanslar birbiriyle kesişecek biçimde analiz edilmiştir. Super-kontigler de kendi aralarında birleştirilerek tüm genomun dizisinin çıkarılmasına çalışılmıştır.

• Proje kapsamında 400’ ün üzerinde çeşitli moleküler markırlar kullanılmıştır. Bu sayede genler ve genlerin yerleri ile ilgili çalışmalar ve gen ailelerinin taranması hız kazanmıştır.

(15)

• Üzüm genom projesi sonuçlarına genel olarak bakıldığında;

toplamda 19 kromozomda (yaklaşık 470.000.000bp) 29.500 gen bulunmuştur. Bu genlerden 21.900 kadarının fonksiyonu günümüzde bilinmektedir.

• Üzüm genomunun büyüklüğü diğer projesi bitirilen genom büyükleri ile karşılaştırıldığında pirinç ve kavak bitkisine göre az bir genom büyüklüğüne sahiptir.

(16)

• Proje kapsamında, üzümde 2004 Transkripsiyon Faktörü geni tanımlanmıştır.Bu Transkripsiyon Faktörü genlerinin büyüklüğü sekansı yapılan diğer bitkilerde tanımlanan Transkripsiyon Faktörü genleri tüm genoma oranlandığında;

• Üzüm genomu %6.7

• Arabidopsis genomu %6,

• Pirinç genomu %4.8

• Kavak genomu %6 olarak belirlenmiştir.

• Bulunan 2004 Transkripsiyon Faktörü geni kendi aralarında benzerliklerine göre gruplandırılğında tüm genom kapsamında üzüm için 62 gen ailesi bulunmuştur. Bu sayı, Arabidopsis genomunda 64, Pirinç genomunda 62 ve Kavak genomunda 63 olarak belirlenmiştir.

• Proje kapsamında tekrarlayan 90.483 segment bulunmuştur. Bu bölgeler farklılıklarına göre 136 çeşit olarak gruplandırılmıştır.

(17)

• Üzüm genomundaki transpozom yoğunluğunun diğer çalışılan bitkilere göre daha fazla olduğu bu nedenle DNA ve kromozom düzeyindeki mutasyonlara Üzüm genomunun daha açık olduğu saptanmıştır. En çok bulunan transpozomlar Copia LINE, Mutator, CACTA, hAT olarak belirlenmiştir.

• Ek olarak; miRNAs, tRNAs, snRNAs, rRNAs, snoRNAs genleri tanımlanmıştır. Ayrıca birçok hastalık direnç genleri tanımlanmış ve üzüm kloroplast DNA’ sının da dizisi çıkarılmıştır.

(18)

Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar

1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)

2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)

3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)

4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.

2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.

5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.

(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.