400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu
HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA
HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA
HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9
HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış
HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım
HAFTA 8: Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri:
Mikroarray-RNA Dizileme HAFTA 8: Bitkilerde Gen
İfadesi ve Analizleri:
Mikroarray-RNA Dizileme
Transkriptom Analizleri Transkriptom Analizleri
Sekans Temelli Yöntemler;
EST kütüphanelerinden Sekanslama
•Yüksek işlem gücüne sahip değil
•Pahalı
• Kuantitatif değil
Dizi Temelli Yöntemler;
•Yüksek İşlem Hacmi
•Pahalı
•İzoformlar ayırt edilemez.
RNA-Seq (RNA-Sekanslama)
DNA
mRNA
protein
cDNA (ESTs) 200 - 700bp
uzunluğunda dizi
EST (Ekspress Sequence Tags)
(Mikroarray analizlerinde kullanılan gen dizileri)
5
EST (Ekspress Sequence Tags) dizilerinin belirlenmesi
EST (Ekspress Sequence Tags) dizilerinin belirlenmesi
a) Genomik DNA kalıbı
b) Kalıp RNA
c) mRNA d) Parçalı mRNA
e) cDNA kütüphanesi f) 5’ EST
g) EST koleksiyonu
h) EST klastırı
Transkripsiyon
AAAAAA
AAAAAA AAAAAA
AAAAAA AAAAAA
Kesim Kısmen veya parçalı kesim
Ters transkripsiyon
cDNA sonu sekanslama
3’ EST
6
1-Kuraklık 2- Soğuk 3- Tuz 4- Kontrol
1 2 3 4 Transformasyon
Plasmid üzerinde EST bölgesinin çoğaltılması
EST dizisinin çıkartılması
XL10-Gold®
Ultracompetent hücre
7
Normalize edilmiş cDNA kütüphalerinin oluşturulması
cDNA kütüphanesi
8
MegaBLAST
CAP3 9
EST bioinformatik analizi
EST sayıları ve Veri Bankaları EST sayıları ve Veri Bankaları
• NCBI (dbEST)-Unigene
• TIGR vb
10
DNA çip (mikroarray) teknolojisi (mikroarray = transcriptome)
DNA çip (mikroarray) teknolojisi (mikroarray = transcriptome)
Doku ve cDNA mikroarrayleri
Oligonükleotid mikroarrayleri(Cam slayt)
Oligonükleotid mikroarrayleri (Affymetrix Genechip)
11
GeneChip (array) Dizaynı GeneChip (array) Dizaynı
Gen Dizisi
Çoklu oligo probları
PM MM
5´ 3´
AffymetrixAffymetrix
Probe
Perfect Match Mis Match Probe Pair
12
http://www.affymetrix.com/index.affx http://www.affymetrix.com/index.affx
• Turunçgil (Citrus genome array)
• Domates (Tomato genome array)
• Üzüm (Grape genome array)-16.000 gen bölgesi
• Kavak (Poplar genome array)
• Arabidopsis genome array
• Arpa (Barley genome array)
• Buğday (Wheat genome array)
• Mısır (Maize genome array)
• Pamuk (Cotton genome array)
• Yonca (Medicago genome array)
• Prinç (Rice genome array)
13
EST sonucu-2 EST sonucu-1
Affymetrix
microarray üretimi
14
(Transkriptome)
Genlerin ekspresyonlarına toplu bakış, gen klonlama
Gen klonlama
Mikroarray Affymetrix Gene Çip Akış Şeması
Mikroarray Affymetrix Gene Çip Akış Şeması
Tarama
Tarayıcı
Analiz
Yazılım Hibridizasyon
Hybridization Fırını
Yıkama boyamave
Yıkama İstasyonu RN
A
15
BB BB
BB BB
cDNAcDNA Total RNA
Total RNA
AAAAAAAA AAAAAAAA
AAAAAAAA
Biotin
Biotin işaretli işaretli cRNAcRNA
Yıkama
Yıkama & & BoyamaBoyama HibridizasyonHibridizasyon 1616 saat saat
GeneChip Ekspresyon Uygulama GeneChip Ekspresyon Uygulama
BB
BB BB BB BB
BB BB BB
BB BB
BB BB
Parçalanmış
Parçalanmış ccRNARNA
Hibridizasyon Hibridizasyon kokteyli
kokteyli
Affymetrix Affymetrix
Tarama Tarama
16
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar
1. Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.- F.Briat)
2. Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa)
3. Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold)
4. Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B.
2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635.
5. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V.
(2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.
