SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTNER MEYVELERİNDEN HAREKETLE STANDARDİZE KURU EKSTRE HAZIRLAMA
YÖNTEMLERİ GELİŞTİRİLMESİ
Mahmoud ABU ASAKER
FARMAKOGNOZİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Murat KARTAL
2011 ANKARA
SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTNER MEYVELERİNDEN HAREKETLE STANDARDİZE KURU EKSTRE HAZIRLAMA
YÖNTEMLERİ GELİŞTİRİLMESİ
Mahmoud ABU ASAKER
FARMAKOGNOZİ ANABİLİM DALI
DANIŞMAN Murat KARTAL
Bu tez çerçevesinde TÜBİTAK- Bilim İnsanı Destekleme Daire Başkanlığından (BİDEB) Burs alınmıştır
2011 - ANKARA
Farmakognozi Doktora Programı
çerçevesinde yürütülmüş bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir
Tez Savunma Tarihi: 23/02/2011
Prof. Dr. Gülçin SALTAN Ankara Üniversitesi
Jüri Başkanı
Prof. Dr. Murat KARTAL Prof. Dr. İlkay ORHAN Ankara Üniversitesi Gazi Üniversitesi
Doç. Dr. Levent ALTUN Doç. Dr. Şebnem HARPUT Ankara Üniversitesi Hacettepe Üniversitesi
Onay ve Kabul ii
İçindekiler iii
Önsöz viii
Simgeler ve Kısaltmalar x
Şekiller xv
Çizelgeler xvi
1. GİRİŞ 1
1.1. Botanik Özellikler 3
1.1.1. Bitkinin Sistematikteki Yeri 3
1.1.2. Asteraceae (Compositae) Familyası 3
1.1.3. Silybum Adans. Cinsinin Genel Morfolojik Özellikleri 4
1.1.4. Silybum Türleri 4
1.1.4.1 Silybum marianum (L.) Gaertner Tür Özellikleri 5
1.1.4.2 Silybum marianum (L.) Gaertner Türünün Dünyada Yayılışı 5 1.1.4.3. Silybum marianum (L.) Gaertner Türünün Türkiye’de Dağılımı 5
1.2. Genel Bilgiler 10
1.2.1. Silybum marianum (L.) Gaertner Etki ve Kullanışları 10
1.2.1.1. Bitkinin Geleneksel Kullanımı 10
1.2.1.2. Literatüre Dayalı Kullanım 11
1.2.2. Silybum marianum (L.) Gaertner Üzerinde Yapılan Çalışmalar 12
1.2.2.1. Biyolojik Çalışmalar 12
1.2.2.1.1. İn vitro Çalışmalar 12
1.2.2.1.2. İn vivo Çalışmalar 24
1.2.2.1.3. Klinik Çalışmalar 39
1.2.2.2. Kimyasal Çalışmalar 49
1.2.2.2.1. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisinin Kimyasal Bileşimi 49
1.2.2.2.1.1. Flavonoitler 52
1.2.2.2.1.2. Lignanlar 53
1.2.2.2.1.3. Flavonolignanlar 53
1.2.2.2.1.4. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisinin Sabit Yağı 54 1.2.2.2.1.4.1. Silybum marianum Meyvelerinden Yağ Elde Edilmesi 55
1.2.2.2.1.4.2. Konjuge Yağ Asitleri 57
1.2.2.2.1.4.3. Silybum marianum Yağında Bulunan Konjuge
Yağ Asitlerin Özellikleri 58
1.2.2.2.1.4.4. Serbest KonjugeLinoleik Asidin Dezavantajları 58
1.2.2.2.1.4.5. Yağın Etki ve Kullanışları 58
1.2.2.2.1.4.6. Yağın Preparatları 59
1.2.2.2.2. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisinden İzole
Edilen Bileşikler 63
1.2.2.2.2.1. Silybum marianum Bitkisinden İzole Edilen
Dihidroflavonollar 63
1.2.2.2.2.2. Silybum marianum Bitkisinden İzole Edilen Flavonollar 67 1.2.2.2.2.3. Silybum marianum Bitkisinden İzole Edilen Flavanonlar 68 1.2.2.2.2.4. Silybum marianum Bitkisinden İzole Edilen Flavon Glikoziti 70 1.2.2.2.2.5. Silybum marianum Bitkisinden İzole Edilen Flavonol Glikozit 71 1.2.2.2.3. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisi Üzerinde Yapılan
1.2.2.2.3.1. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisi Üzerinde Yapılan
Ekstraksiyon Çalışmaları 72 1.2.2.2.3.2. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisi Üzerinde Yapılan
İzolasyon Çalışmaları 76 1.2.2.2.3.3. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisi Üzerinde Yapılan
Analizler 78 1.2.2.2.3.3.1. Avrupa Farmakopesi Monografındaki S. marianum
Meyvelerinin Üzerinde Yapılan Analizler 79
1.2.2.2.3.3.2 Avrupa Farmakopesi Monografındaki S. marianum
Standardize Edilmiş Kuru Ekstresinin Üzerinde Yapılan Analizler 82 1.2.2.2.3.3.3. Silimarin Üzerinde Yapılan YBSK-DAD ve Kütle
Spektrometresi Analizleri 85
1.2.2.2.3.3.4. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisi Üzerinde Yapılan İnce
Tabaka Kromatografisi Analiz Çalışmaları 100 1.2.3. Silybum marianum (L.) Gaertner ve İçerdiği Silimarin’in Biyolojik ve
Farmakolojik Etkileri 101
1.2.3.1. Sindirim Sistemi Şikayatlerindeki Etkisi 102
1.2.3.2. Karaciğer Üzerinde Rejeneratif Etki Mekanizması 104 1.2.3.3 Antienflamatuvar ve Antialerjik Etki Mekanizması 107
1.2.3.4. Antioksidan Etki Mekanizması 107 1.2.3.5. Böbrek Üzerinde Etki Mekanizması 109 1.2.3.6. Antikanser Etki Mekanizması 110 1.2.3.7. Nöroprotektif ve Nörotropik Etki Mekanizması 112
1.2.3.8. Kardiyopulmoner Sistem Üzerinde Etki Mekanizması 113
1.2.3.9. Cilt Üzerinde Etki Mekanizması 114 1.2.3.10. Silimarin’in Genel Etki Mekanizması 116
1.2.3.11. Terapötik Endikasyon 117
1.2.3.12. Toksisite ve Yan Etkiler 118
1.2.4. Farmakokinetik Özellikler 119
1.2.4.1. Emilim 120
1.2.4.2. Dağılım 121
1.2.4.3. Metabolizma 122
1.2.4.4. Eliminasyon 122
1.2.5. Silimarin- İlaç Etkileşimi 124
1.2.6 Standardizasyon 126
1.2.6.1. Tanım 126 1.2.6.2. Bitkisel Drog, Bitkisel Drog Preparatlarının Standardizasyonu
İçin Kullanılan Bileşikler 127 1.2.6.2.1. Terapötik Etkisi Bilinen Bileşikler 127
1.2.6.2.2. Terapötik Etkiyi Artıran Bileşikler 127
1.2.6.2.3. İşaretleyici Bileşikler 127
1.2.7. Ekstraksiyon 128
1.2.8. Ekstre 128
1.2.8.1. Ekstrelerin Sınıflandırılması 129 1.2.8.1.1. Fiziksel Hallerine Göre Ekstrelerin Sınıflandırılması 129
1.2.8.1.1.1. Sıvı Ekstreler 129
1.2.8.1.1.2. Yumuşak Ekstreler 129
1.2.8.1.1.3. Kuru Ekstreler 130
1.2.8.1.1.3.1. Kuru Ekstre Elde Etme Yöntemleri 130
1.2.8.1.2. Bitkisel Ekstrelerin İçerdiği Bileşiklerin Bilinen Etkilerine
Göre Sınıflandırılması 135
1.2.8.1.2.1. Standardize Ekstreler 135
1.2.8.1.2.2. Miktarı Ayarlanmış Ekstreler 136
1.2.8.1.2.3. Diğer Ekstreler 136
2. GEREÇ VE YÖNTEM 137
2.1. Bitkisel Materyal 137
2.2. Yöntem 137
2.2.1. Konya Örneğinin Meyvelerinde Kurutmada Kayıp
Miktarı Tayini 137
2.2.2. Konya Örneğinin Meyvelerinde Toplam Kül Miktar Tayini 138 2.2.3. Konya Örneğinin Meyvelerinde İnce Tabaka
Kromatografisi Analizi 138
2.2.4. Ekstraksiyon Çalışmaları 139 2.2.4.1. Farklı Yörelerden Toplanan Silybum marianum (L.) Gaertner
Ekstraksiyon Çalışmaları 139 2.2.4.2. Konya Örneğinin Farklı Kısımlarının Ekstraksiyon Çalışmaları 139
2.2.4.3. Standardize Kuru Ekstrelerin Elde Edilmesinde Kullanılan
Çözücü ve Çözücü Sistemleri ile Yapılan Bitki Ekstraksiyon Çalışmaları 140 2.2.4.4. İn vitro Çözünürlük ve Çözünme Hızı Çalışmalarında
Kullanılan Etanollü Ekstrenin Hazırlanması 140
2.2.5. Mini Spray Dryer (Püskürterek Kurutucu) Çalışmaları 141
2.2.5.1. Büchi Mini Spray Dryer 141
2.2.5.2. Mini Spray Dryer Aplikasyon Çalışmaları 141
2.2.5.2.1. Etil asetatlı Ekstre 142
2.2.5.2.2. Etanollü Ekstre 142
2.2.5.2.3. Asetonlu Ekstre 143
2.2.5.2.4. Asetonitrilli Ekstre 143
2.2.5.2.5. Metanollü Ekstre 144
2.2.5.2.6. Bitkinin Meyvesi Petrol Eteri ile Muamele Edildikten
Sonra Hazırlanan Sulu Ekstre 144
2.2.5.2.7. Bitkinin Meyvesi Petrol Eteri ile Muamele Edilmeden
Hazırlanan Sulu Ekstre 145
2.2.5.3. Mini Spray Dryer Parametrelerinin Belirlenmesi 145
2.2.5.3.1. Etil asetatlı Ekstre 145
2.2.5.3.2. Etanollü Ekstre 146
2.2.5.3.3. Asetonlu Ekstre 146
2.2.5.3.4. Asetonitrilli Ekstre 146
2.2.5.3.5. Metanollü Ekstre 147
2.2.5.3.6. Petrol Eteri ile Muamele Edilmeden Hazırlanan Sulu Ekstre 147 2.2.5.4. Spray Dryer Kullanılarak Standardize Silimarin Kuru
Ekstresinin Elde Edilmesi 147 2.2.5.5. In vitro Çözünürlük ve Çözünme Hızı Çalışmalarında
Kullanılacak Standardize Kuru Ekstrenin Mini Spray Dryer ile Elde
Edilmesi 150 2.2.6. YüksekBasınçlı Sıvı Kromatografisi (YBSK) Çalışmaları 150
2.2.6.1. YüksekBasınçlı Sıvı Kromatografisi Sistemi 150 2.2.6.2. Literatürlere Dayalı Silimarin Analizlerinde Kullanılan Bazı
2.2.6.3. Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisinin Flavonolignanlarının
(Silimarin) Üzerinde Avrupa Farmakopesi’ndeki YBSK Analiz Yöntemi 152 2.2.6.3.1. Farklı Yörelerden Toplanan Silybum marianum (L.) Gaertner
Meyvelerinde Silimarin’in YBSK Analizleri 155 2.2.6.3.2. Konya Örneğinin Farklı Kısımlarında Silimarin’in YBSK Analizleri 155 2.2.6.3.3. Silybum marianum (L.) Gaertner Meyvelerinden Hareketle
Hazırlanan Standardize Silimarin Kuru Ekstrelerin Avrupa
Farmakopesi’nin Hesaplamaları kullanılarak Geliştirilen Yeni YBSK
Yöntemine Göre Analizleri 156
2.2.6.4. Yeni YüksekBasınçlı Sıvı Kromatografisi Yönteminin Geliştirme
Çalışmaları 157 2.2.6.5. Geliştirilen Yeni Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi Yönteminin
Validasyonu 160 2.2.6.5.1 Silibin Kalibrasyon Eğrisinin Çizilmesi, Doğru Denkleminin
Hesaplanması ve Geliştirilen yeni YBSK Yönteminin Validasyonu 161
2.2.6.5.1.1. Doğrusallık 161 2.2.6.5.1.2. Teşhis Limiti ve Miktar Tayini Limitlerinin Saptanması 161
2.2.6.5.1.3. Yöntemin Uygunluğu 162
2.2.6.5.1.4. Kesinlik 162
2.2.6.5.1.5. Doğruluk 163 2.2.7. In vitro Çözünürlük ve Çözünme Hızı Çalışmaları 163
2.2.7.1. Çözünürlük Çalışmaları 163
2.2.7.2. Çözünme Hızı Çalışmaları 164
2.2.7.3. In vitro Çözünürlük ve Çözünme Hızı Çalışmalarındaki Numuneler İçin
Geliştirilen YBSK ile Analizleri 165
2.2.8. Sabit Yağ Üzerinde Yapılan Çalışmalar 165
2.2.8.1. Sabit Yağın Elde Edilmesi 165
2.2.8.2. Sabit Yağın Metillenmesi 165
2.2.8.3. Sabit Yağın Gaz Kromatografisi- Kütle Spektrofotometresi
Analizleri 166
3. BULGULAR 168
3.1. Konya Örneğinin Meyvelerinde Kurutmada Kayıp Tayini Çalışmalarına
Ait Bulgular 168
3.2. Konya Örneğinin Meyvelerinde Kül Miktar Tayini Çalışmalarına Ait
Bulgular 168 3.3. Konya Örneğinin Meyvelerinde İnce Tabaka Kromatografisi Çalışmasına
Ait Bulgular 169 3.4. Mini Spray Dryer (Püskürterek Kurutma) Çalışmalarına Ait Bulgular 170 3.4.1. Mini Spray Dryer’in Aplikasyon Çalışmalarına Ait Bulgular 170 3.4.2. Mini Spray Dryer’in Parametrelerinin Belirlenmesine Ait Bulgular 174 3.4.3. Ayarlanan Spray Dryer Yöntemi ile Standardize Silimarin Kuru
Ekstrelerinin Elde Edilmesine Ait Bulgular 177
3.5. YüksekBasınçlı Sıvı Kromatografisi (YBSK) Çalışmalarına Ait Bulgular 178 3.5.1. Literatürlere Dayalı Silimarin Analizlerinde Kullanılan Bazı Yüksek
3.5.2. Farklı Yörelerden Toplanan Silybum marianum (L.) Gaertner Meyvelerinde
Silimarin’in YBSK Analizlerine Ait Bulgular 181
3.5.2.1. Konya Örneği (Kültür materyali) 181
3.5.2.2. Denizli Örneği 183 3.5.2.3. Balıkesir- Edremit Örneği 185
3.5.3. Konya Örneğinin Farklı Kısımlarının Ekstraksiyon Çalışmalarına
Ait Bulgular 187
3.5.3.1. Olgunlaşmamış Bitkinin Çiçeği 188
3.5.3.2. Olgunlaşmamış Bitkinin Meyvesi 188
3.5.3.3. Bitkinin Herbası 189
3.5.3.3. Bitkinin Kökü 190
3.5.4. Silybum marianum (L.) Gaertner Meyvelerinden Hareketle Hazırlanan Standardize Silimarin Kuru Ekstrelerinin Avrupa Farmakopesi Hesaplamaları kullanılarak Geliştirilen Yeni YBSK Yöntemine Göre Analizlerine Ait Bulgular
190 3.6. Geliştirilen Yeni YBSK Yönteminin Validasyonuna
Ait Bulgular 200
3.6.1. Silibin’e Ait Kalibrasyon Eğrisi ve Doğru Denklemi 200
3.6.2. Doğrusallık 200
3.6.3. Teşhis Limiti ve Miktar Tayini Limitleri 201
3.6.4.Yöntemin Uygunluğu 201
3.6.5. Kesinlik 202
3.6.6. Doğruluk 203 3.7. Çözünürlük ve Çözünme Hızı Çalışmalarına Ait Bulgular 203
3.7.1. Çözünürlük Çalışmalarına Ait Bulgular 203
3.7.2.Çözünme Hızı Çalışmalarına Ait Bulgular 204
3.8. Sabit Yağın Gaz Kromatografisi- Kütle Spektrofotometresi Analiz Sonuçları 207
4. TARTIŞMA 209
5. SONUÇ VE ÖNERİLER 216
ÖZET 219
SUMMARY 220
KAYNAKLAR 221
ÖZGEÇMİŞ 229
Bu tez çalışmasında Konya’da kültürü yapılan, tıbbi ve ekonomik açıdan büyük öneme sahip, Silybum marianum (L.) Gaertner bitkisi, Türk ilaç sanayiinde değerlendirilmesi ve insan sağlığı için kullanılmak üzere standardize kuru ekstrelerin hazırlama yöntemleri araştırılmıştır.
Tez konumun seçilmesinde, çalışmalarımın yönlendirilmesinde her türlü yardım ve desteğini gördüğüm Hocam Prof. Dr. Murat KARTAL’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Çalısmalarım süresince her türlü anlayış, ilgi ve yardımlarını gördüğüm Farmakognozi Anabilim Dalı Başkanımız Prof. Dr. Gülçin SALTAN’a ayrıca teşekkür ederim.
Çalışmalarım sırasında benden yardımlarını ve değerli bilgilerini esirgemeyen değerli hocalarım, Prof. Dr. Engin ŞARER, Prof. Dr. Belma KONUKLUGİL, Doç. Dr. Mehmet Levent ALTUN, Doç. Dr. Alev TOSUN ve Doç. Dr. Betül SEVER YILMAZ’a teşekkürlerimi sunarım.
Çözünme hızı çalışmalarında bana yolu gösteren değerli bilgilerini bana aktaran, aynı zamanda yardımlarını esirgemeyen değerli Hocalarım Prof. Dr. Nilüfer YÜKSEL ve Doç.Dr.
Ayşegül KARATAŞ’a teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmalarımda kullandığım bitki materyalinin kültürünü gerçekleştiren, Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Öğretim üyesi Doç. Dr. Yüksel KAN ve ekibine teşekkürlerimi sunarım.
Özellikle GK-KS analizleri sürecinde yardımlarını benden esirgemeyen kardeşim Uzm. Ecz.
Ali Rifat GÜLPINAR’a teşekkürlerimi sunarım.
Botanik kısmında değerli bilgilerini benimle paylaşan Sayın Gülderen YILMAZ’a teşekkür ederim.
Yardım ve anlayışlarını bedenden esirgemeyen, onlarla güzel anlar geçirdiğim ve ciddi dostluklar kurduğum araştırma görevli arkadaşlarımı (Dr. Ecz. Alper GÖKBULUT, Dr.Ecz.
Sinem ASLAN ERDEM, Dr. Ecz. Özlem BAHADIR) ve ismini sayamadığım tüm arkadaşlarımı teşekkür eder başarı dolu hayat diliyorum.
İş hayatımda kendisinden oldukça yararlı bilgi ve deneyim kazandığım, tez çalışmalarımın nedeniyle kullandığım izinler konusunda hep anlayış gösteren iş yerimin genel koordinatörü Uzm. Dr. Sami EREN’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
En kötü zamanlarımda ve halen benim zor şartlarımda ve benim kaprislerimi tahammül eden, karşılıksız sabır ve fedakarlık gösteren bitanecik eşim Ecz. Heba ABU ASAKER’i teşekkür
geçirmemizi Allah’tan dilerim.
Son olarak Filistin’de olan ve yaklaşık 6 yıldır göremediğim ailemi beni koşulsuz desteklediğinden dolayı teşekkürlerimi ve özlemlerimi gönderiyorum.
Rahmetli annemi özlem ve sevgiyle anıyorum.
6OHDA 6-hidroksidopamin 5NFAA 3-(5-Nitro-2-furil) akrilik asit
AA Allil alkol
α Alfa
a/a Ağırlık/ağırlık
AAS Askorbik asit
AChE Asetilkolinesteraz
AFTIR After Flowing Through Immobilized Receptor (Sabitlenmiş Reseptörden Geçiş Sonrası)
a/h Ağırlık/Hacim
AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (Kazanılmış immün-yetmezlik sendromu)
ALP Alkaline Phosphatase
ALT Alanin aminotransferaz
ALKP Alkaline Phosphatase
AMP Adenosine Monophosphate
AP-1 Aktivatör Protein-1
APAP Asetaminofen
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
AST Aspartat aminotransferaz
ATC Asetiltiyokolin iyodür atm atmosfer
ATP Adenosine Triphosphate
β Beta
B(α)P Benzo α Pirene
BDL Bile Duct Ligation
BEAS-2B Dönüştülmüş İnsan Bronşiyal Hücre Dizisi
C Karbon
ºC Celcius (santigrat)
cAMP Cyclo Adenosine Monophosphate
CAT Chloramphenicol acetytransferase
CCl4 Karbon tetraklorür
CD Conjugated Dien
CDK Siklin-bağımlı kinaz
CHCl3 Kloroform
CI/R Cerebral Ischemia/Reperfusion CLA Conjugated Linoleik Acid CLP Cecal Ligation and Perforation
cm Santimetre
Cmax Bir ilacın kanda ulaştığı en yüksek plazma konsantrasyonu
CO2 Karbondioksit
COLO320 Kolon kanser hücre serisi
ConA Concanavalin A
COX Cyclooxigenase
CREB cAMP Response Element-Binding CTP Phosphocholine cytidylyltransferase
D-Gal D- galaktoz
DAD Diode Array Detector
dk Dakika
DMBA-TPA Dimetilbenz[α]antrasen-12-O-tetradekanoil-forbol-13-asetat DMN Dimetilnitrozamin
DNA Deoksiribonükleik asit
DPPH 2,2-Difenil-1-pikril hidrazil
DSM Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DTNB 5,5-Ditiyobis (2-nitrobenzoik asit)
E2 Estradiol EAA Eğri Altında Alan
EC50 Half Maximal Effective Concentration ED50 Median Effective Dose
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ERK Extracellular Signal-RegulatedKinase
ESDN End Stage Diabetic Nephropathy ESI Electron Spray Ionization
ESI-MS-MS Electron Spray Ionization by Tandem Mass Spektrometry EtOH Etanol
eV Elektron Volt
Fe Demir FEB Fonasyon Eşik Basıncı FSH Folikül stimüle edici hormon
γ Gama
g Gram
GGT Gama Glutamil Transferaz
GGTP Gamma Glutamil Transpeptidaz
GLC Gaz Liquid Chromatography
GOT Glutamik Oksaloasetik Transaminaz
GPX Glutathione Peroxidase
GR Glutathione Reductase
GSH Glutathione
GSSG Glutathione disulfide
GST Glutathione-S-Transferase H2O2 Hidrojen peroksit
h/h Hacim/Hacim
H3PO4 Fosforik asit
HCV Hepatit C Virüsü
HDL High Gansity Lipoprotein HeLa Serviks kanser hücresi
HepG2 Hepatosellüler karsinoma
HIV Human Immunodeficiency Virus (Bağışıklık Sisteminin Çökmesine Neden Olan Virüs)
HOO Hidroksilli radikaller
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HPLC-DAD-MS High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Dedector- Mass Spectrometry
HPTLC High Pressure Thin Layer Chromatography
IC50 The half maximal inhibitory concentration (in vitro testlerde)
IFN İnterferon
IFN-γ İnterferon gama
IgA İmmünoglobülin A
IgE İmmünoglobülin E
IgM İmmünoglobülin M
IL-1 İnterlökin-1
IL-2 İnterlökin-2
IL-4 İnterlökin-4
IL-6 İnterlökin-6
IL-10 İnterlökin-10 IL-12 İnterlökin-12
i.m. İntramüsküler
iNOS İndüklenebilir Nitrik Oksit Sentaz i.p. İntraperitonal
ISTD Internal Standard
İTK İnce Tabaka Kromatografi
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
i.v. İntravenöz
k' Kapasite faktörü
kg Kilogram
kV Gerilim birimi
KS Kütle Spektrometresi
LC Liquid Chromatography
LDL Low Dansity Lipoprotein
LH Luteinizing Hormone
LLC-PK1 Renal epitelyal hücresi LOD Limit of Determination LOQ Limit of Quantitation
LPO Lipit Peroksidasyonu
LPS Lipopolisakkarit
µg Mikrogram
µl Mikrolitre
m2 Metrekare
MA Molekül Ağırlığı
MAPK Mitojen Aktiflenmiş Protein Kinaz MDA Malondialdehit MMP-2 Matrix metallopeptidase-2 MMP-9 Matrix metallopeptidase-9 MCF-7 Meme kanser hücresi
MeOH Metanol
mg Miligram
ml Mililitre
m Mikrometre
M Mikromolar
mm Milimetre
MIA PaCa-2 Pankreatik kanser hücre serisi MIC Minimum Inhibitory Concentration MIP Makrofaj İnhibitör Protein
mRNA Messenger RNA
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid
nm Nanometre
NAC N-asetilsistein
NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NMR Nükleer Manyetik Rezonans
NOS Nitrik oksit sentaz
NO Nitrik oksit
NSAE Non-Steroidal Anti-Enlamafuvar NTF/NFKB Nükleer Transkripsiyon Faktör
PAPK Mitogen-Activated Protein Kinases PARP Poli ADP-Riboz Polimeraz
PBMC Periferal Kan Mononüklear Hücreleri PC-3 Prostat adenokarsinoma hücresi
PE Petrol eteri
PegIFN/RBV Pegile edilmiş interferon/ribavirin
pH Power of Hydrogen
PMA Phobol 12-Myristate 13-Acetate
PMKH Periferal mononükleer insan kan hücreleri PMN Peritonal Mürin Makrofaj
PGE2 Prostaglandin E2
PSA Prostat Spesifik Antijen
PTH Paratiroid Hormonu
PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
OA Oleik Asit
OCD Obsessive–Compulsive Disorder
OHDA Hidroksidopamin
OVX Ovariectomized
R Rezolusyon
RNA Ribo Nükleik Asit
RI Retansiyon İndisi
RPLC Reverse Phase Liquid Chromatography ROS Reaktif Oksijen Türleri
RSD Relative Standard Deviation
RV Rinovirüs
SAPK/JNK1/2 Stres ile aktive edilmiş protein kinaz/jun NH2-terminal kinaz
SBLN Serum Bilurubin
s.c. Subkütan
SD Standard Deviation
SGOT Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase SGPT Serum Glutamic Pyruvic Transaminase sIL-2R IL-2 reseptörü
SK-KS Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi SM+APAP Silybum marianum ile asetaminofen SNC Substantia Nigra pars Compacta
SOD Süperoksit Dismutaz
SPV Silibin-fosfatidilkolin-E vitamini kombinasyonu
SRM Selected Reaction Monitoring
STAT Sinyal taşıyıcı ve transkripsyon aktivatörü
T Pik asimetresi
TAG Triacil Gliserol
TBARS Tiyobarbitürik asit reaktif maddeler
THP-1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Dizisi T-hücresi Timus Hücresi
Tmax Bir ilacın en yüksek kan konsantrasyonuna ulaşması için geçen süre TCC Transition Cell Carcinoma
TCDC Taurokenodeoksikolat
TNBS Trinitrobenzensülfonik asit
TNF Tümör Nekroze Edici Faktör TOF-MS Time-of-Flight Mass Spectrometry
UDCA Ursodeoksikolik asit
UDP Uridine Diphosphate
UGT UDP- Glukuronosil Transferaz u-PA Urokinaz Plazminojen Aktivatör
UPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid Chromatography with coupled MS detector.
USP United States Pharmacopeia (Amerikan Farmakopesi)
UVA Ultraviyole A
UVB Ultraviyole B
UV Ultraviyole
UW University of Wisconsin
VLDL Very Low Dansity Lipoprotein
VLDL-TAG Very Low Dansity Lipoprotein-Triacil Gliserol YBSK Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi
Şekil 1.1 Silibin’in etki mekanizmasını gösteren şema 105
Şekil 1.2. Büchi-Mini Spray Dryer B-290 131
Şekil 1.3. Spray dryer kısımlarının şematik çizimi 132
Şekil 3.1. Silybum marianum (L.) Gaertner meyvesinin İTK çalışması 170 Şekil 3.2. Literatüre dayalı birinci yönteme ait silimarin kromatogramı 178
Şekil 3.3. Literatüre dayalı ikinci yönteme ait silimarin kromatogramı 179
Şekil 3.4. Literatüre dayalı ikinci yönteme ait silibin kromatogramı 179
Şekil 3.5. Literatüre dayalı üçüncü yönteme ait silimarin kromatogramı 180
Şekil 3.6. Literatüre dayalı dördüncü yönteme ait silimarin kromatogramı 180
Şekil 3.7. Literatüre dayalı dördüncü yönteme ait silibin A ve silibin B kromatogramı 181
Şekil 3.8. Konya Örneğinin meyvelerine ait silimarin kromatogramı 183
Şekil 3.9. Denizli Örneğinin meyvelerinde silimarin kromatogramı 185
Şekil 3.10. Balıkesir Örneğinin meyvelerinde silimarin tayini 187
Şekil 3.11. S. marianum (L.) Gaertner olgunlaşmamış çiçeğinin içerdiği silimarin kromatogramı 188
Şekil 3.12. S. marianum (L.) Gaertner olgunlaşmamış meyvesinin içerdiği silimarin kromatogramı 189
Şekil 3.13. S. marianum (L.) Gaertner bitkisinin olgunlaşmamış meyvesinin içerdiği silimarin kromatogramı 189
Şekil 3.14. S. marianum (L.) Gaertner herbasının içerdiği silimarin kromatogramı 190
Şekil 3.15. Geliştirilen yeni YBSK yöntemi ile elde edilen silimarin’in kromatogramı 191
Şekil 3.16. Silibin’e ait kalibrasyon eğrisi 200
Şekil 3.17. Yöntem uygunluğu tespitinde kullanılan silimarin’in kromatogramı 201
Şekil 3.18. Standardize silimarin kuru ekstresinin farklı ortamlardaki zamana karşı % salınan miktarını gösteren grafik 207
Şekil 3.19. S.marianum’un sabit yağında bulunan yağ asitlerin GC kromatogramı; (1) palmitik asit, (2) stearik asit, (3) oleik asit, (4) linoleik asit, (5) araşidonik asit 208
Çizilge 1.1. Avrupa Farmakopesine göre silibin ile taksifolin’in İTK’da 79
verdikleri renk
Çizelge 1.2. Avrupa Farmakopesinde silimarin analizi için kullanılan
HPLC gradient sistemi 81
Çizilge 1.3. Avrupa Farmakopesine göre silibin ile taksifolin’in İTK’da
verdikleri renk 83
Çizelge 1.4. Avrupa Farmakopesinde silimarin analizi için kullanılan
HPLC gradient sistemi 84
Çizelge 1.5. Silimarin analizi için literatüre dayalı kullanılan HPLC gradient
sistemi 86 Çizelge 1.6. Silimarin analizi için literatüre dayalı kullanılan YBSK gradient
sistemi 87 Çizelge 1.7. Silimarin analizi için literatüre dayalı kullanılan LC-MS gradient
sistemi 89 Çizelge 1.8. Almanya’dan Legalon kapsülleri ve Çin’den
Yiganling tabletlerinde silimarin tayini için literatürde kullanılan
gradient sistemi 94
Çizelge 1.9. İnsan plazmasında toplam (serbest ve bağlanmış olan) ve serbest silibin diastereomerlerinin YBSK analizi için literatürde
kullanılan gradient sistemi 95
Çizelge 1.10. Piyasada bulunan çeşitli standardize silimarin ekstrelerinin
analizi için literatürde kullanılan LC-MS gradient sistemi 96 Çizelge 1.11. Bitki tentürlerinde silimarin analizi için
literatürde kullanılan HPLC gradient sistemi 98
Çizelge 1.12. Silimarin analizi için literatürde kullanılan UPLC-MS/MS
gradient sistemi 99
Çizelge 2.1. Etil asetatlı ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan
denemeler 142 Çizelge 2.2. Etanollü ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan
denemeler 142 Çizelge 2.3. Asetonlu ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan
denemeler 143 Çizelge 2.4. Asetonitrilli ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan
denemeler 143
Çizelge 2.5. Metanollü ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan
denemeler 144 Çizelge2.6. Petrol eteri ile muamele edildikten sonraki hazırlanan
sulu ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan denemeler 144 Çizelge 2.7. Petrol eteri ile muamele edilmeden hazırlanan
sulu ekstre üzerinde Spray Dryer ile yapılan denemeler 145 Çizelge 2.8. Etil asetatlı ekstre üzerinde Spray Dryer parametrelerinin
belirlenmesi 145 Çizelge 2.9.Etanollü ekstre üzerinde Spray Dryer parametrelerinin belirlenmesi 146
Çizelge 2.10. Asetonlu ekstre üzerinde Spray Dryer parametrelerinin
belirlenmesi 146
belirlenmesi 146 Çizelge 2.12. Metanollü ekstre üzerinde Spray Dryer parametrelerinin
belirlenmesi 147 Çizelge 2.13. Petrol eteri ile muamele edilmeden hazırlanan sulu
ekstre üzerinde Spray Dryer parametrelerinin belirlenmesi 147 Çizelge 2.14. Standardize ekstre elde edilmesinde, Spray Dryer’e
uygulanmış çözücü ve çözücü sistemleri ile hazırlanan bitki ekstreleri 148 Çizelge 2.15. Silimarin analizinde uygulanan ikinci YBSK yönteminin
gradient sistemi 151
Çizelge 2.16. Silimarin analizinde uygulanan üçüncü YBSK yönteminin
gradient sistemi 152
Çizelge 2.17. Silimarin analizinde uygulanan dördüncü YBSK yönteminin
gradient sistemi 152
Çizelge 2.18. Silimarin analizinde belirlenen YBSK
Avrupa Farmakopesi yönteminin gradient sistemi 153 Çizelge 2.19. Yeni YBSK yönteminin geliştirme çalışmalarında
1. denemenin gradient sistemi 158
Çizelge 2.20. Yeni YBSK yönteminin geliştirme çalışmalarında
2. denemenin gradient sistemi 158
Çizelge 2.21. Yeni YBSK yönteminin geliştirme çalışmalarında
3. denemenin gradient sistemi 158
Çizelge 2.22. Yeni YBSK yönteminin geliştirme çalışmalarında
4. denemenin gradient sistemi 159
Çizelge 2.23. Yeni YBSK yönteminin geliştirme çalışmalarında
5. denemenin gradient sistemi 159
Çizelge 2.24. Silimarin analizinde kullanılan yeni geliştirilen
YBSK yönteminin gradient sistemi 160
Çizelge 3.1. S. marianum meyvesinde kurutmada kayıp tayini 168 Çizelge 3.2. S. marianum meyvesinde kül miktar tayini 168 Çizelge 3.3. Spray Dryer aplikasyon çalışmalarına ait bulgular 171 Çizelge 3.4. Spray Dryer parametrelerinin belirlenmesine ait bulgular 175 Çizelge 3.5. Ayarlanan Spray Dryer yöntemi ile elde edilen
silimarin standardize kuru ekstrelerin verimleri 177 Çizelge 3.6. Konya Örneğinin meyvelerinde silimarin tayini 182 Çizelge 3.7. Denizli Örneğinin meyvelerinde silimarin tayini 184 Çizelge 3.8. Balıkesir Örneğinin meyvelerinde silimarin tayini 186 Çizelge 3.9. Elde edilen standardize kuru ekstrelerin yüzde silimarin içerikleri 192 Çizelge 3.10. 40 g meyveden hareketle elde edilen elde edilen verime göre
ekstrelerdeki silimarin miktarı 199 Çizelge 3.11. Silibin’e ait kalibrasyon çözeltileri ve okunan alanlar 200 Çizelge 3.12. Geliştirilen yöntemin doğrusallığı, teşhis limiti ve miktar tayin limiti 201 Çizelge 3.13. Geliştirilen yöntemin silimarin sistem performans parametreleri 202 Çizelge 3.14. Geliştirilen yöntemin miktar tayin limitindeki kesinlik 202 Çizelge 3.15. Geliştirilen yöntemin doğruluk değerleri 203 Çizelge 3.16. Farklı pH ortamlarında silimarin’in çözünürlüğüne ait bulgular 204 Çizelge 3.17. Farklı ortamlarda yürütülen çözünme hızı çalışmasında
silimarin’in zamana karşı miktar tayini 205
Çizelge 3.18. Silybum marianum (L) Gaertner bitkisinin meyvelerinden elde
edilen sabit yağın içerdiği yağ asitleri ve % oranları 207
1. GİRİŞ
Silybum marianum (L.) Gaertner bitkisinin gövdesi 30-100 cm yükseklikte, Papatyagiller (Asteraceae) familyasına bağlı otsu bir bitkidir. Bitki doğal olarak Akdeniz bölgesinde yetişmekte, aynı zamanda yaygın bir şekilde Avrupa kıtasının birçok kesiminde, Kuzey ve Güney Amerika ve yabani olarak Avustralya’da yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Ülkemizin ise batı, kuzey ve güney bölgelerinde yaygındır. Yol ve tarla kenarları ile boş tarlalarda yetişmektedir. Bitkinin geniş dikenli yaprakları üzerinde, süte benzeyen iri beyaz lekeler bulunur, bu nedenle İngilizce’de “süt dikeni” anlamında “Milk thistle”
olarak adlandırılır (Başer, 2008; Baytop, 1999; Demirezer ve ark., 2007; WHO Monographs, 1999).
Bir inanışa göre Hz. İsa’yı emziren Hz. Meryem’in sütü, bitkinin yaprağına damlamış ve bitkideki beyaz lekeler ile damarlar oluşmuştur. Bu nedenle bitki
“Meryem dikeni” olarak da anılır (Başer, 2008).
Silybum marianum (L.) Gaertner İngilizce olarak “Milk thistle”, Latince olarak,
“Carduus marianus L.”, “Silybi mariae fructus”, “Cardui mariae fructus”, Almanca olarak “Meriendistelfüchte”, “Marienkörner”, Fransızca olarak
“Chardon Marie”, İtalyanca olarak “Carduo Mariano” ve Danimarkaca olarak
“Marietidsel” olarak bilinmektedir. Yaygın olarak “Marian thistle, wild artichoke, variegated thsitle, St. Mary’s thistle, Christ’s crown, holy thistle, Venus thistle, heal thistle, wand of God’s grace” isimleriyle de bilinmektedir (Tenney, 1995 ; Baytop, 1999).
Türkiye’de ise Akkız, devedikeni, deve kengeri, kengel, kıbbun, Meryemana dikeni, sütlü kengel, şevkülmeryem, uslu kenger” isimleri ile bilinmektedir (Baytop, 1999; Demirezer ve ark., 2007).
Silybum marianum (L.) Gaertner bitkisinin kullanışı yaklaşık 2000 yıl öncesine kadar dayanır. MS 1. yüzyılda Anadolu’da yaşamış olan hekim Dioscorides bitkinin köklerini kusturucu olarak önermiş, yapraklarını haşlayarak hazırladığı dekoksiyonları yılan sokmasında kullanmıştır. Bitkinin kullanışları Almanya’da 19. yüzyılın ortalarında canlanırken 1930 yılında modern uygulamalarda yeniden kullanılmaya başlanmıştır (Tenney, 1995; Başer, 2008). Eskiden beri bitkinin meyveleri kolagog, dispepsi, iştah açıcı olarak, sarılık ve mide rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılmıştır. 1597 yılında herbalist Gerarde; melankoli (karaciğer ile ilgili) hastalığı için Silybum marianum (L.) Gaertner bitkisi iyi bir tedavi ajanı olduğunu söylemiştir. 1650 yılında Culpeper bitkinin dalak ve karaciğerin obstrüksiyonunu engelleyebildiğini yazmıştır. 1755 yılında ise Von Haller bitkiyi çeşitli karaciğer rahatsızlıklarında kullandığına dair kayda almıştır. Avrupa’lı hekimler bitkiyi Materia Medica kayıtlarına almışlardır (Tenney, 1995).
Silybum marianum (L.) Gaertner meyvelerinden elde edilen aktif bileşik flavonolignan karışımı olan silimarin’dir. Bu karışım silidiyanin, silikristin ve major olan silibinin adlı bileşenlerden oluşmaktadır (Tenney, 1995). Klinik çalışmalar, silimarin’in karaciğeri alkol, asetaminofen, karbon tetraklorür (CCL4) ve Amanita mantarından doğabilecek toksik maddelerden koruduğunu göstermiştir (Tenney, 1995; Başer, 2008; Heinrich ve ark., 2004).
Silimarin ve silibin in vitro olarak antioksidan ve antihepatotoksik etkili olduğu, silibin antienflamatuvar etki gösterdiğine dair dünya sağlık örgütünün (WHO) monograflarında yer almaktadır. Aynı monografta; Klinik Farmakoloji kapsamında standardize edilmiş silimarin preparatlarının alkol, organik bileşikler, ilaç ve toksinlerin neden olduğu hepatit, akut ve kronik hepatit tedavisinde etkili olduğuna dair bilgiler yer almaktadır (WHO Monographs, 2002).
1.1. Botanik Özellikler
1.1.1. Bitkinin Sistematikteki Yeri (Davis, 1975; Tanker ve ark., 2004)
Bölüm : Spermatophyta Altbölüm : Angiospermae Sınıf : Dicotyledones Altsınıf : Asteridea Takım :Asterales Familya : Asteraceae Altfamilya : Asteroideae Cins : Silybum Adans.
Tür : Silybum marianum (L.) Gaertner
1.1.2. Asteraceae Familyası
Yeryüzünde 1000’e yakın cins ve 20000 kadar tür ile temsil edilen, çiçekli bitkilerin en zengin familyasıdır. Ülkemizde 130 kadar cins, 1100’den fazla türü yetişir. Bitkileri bir, iki veya çok yıllıktır. Bitkilerin çoğu otsudur, çalı veya ağaç formunda olanların sayısı azdır; Yapraklar alternan veya oppozit dizilmiş ya da hepsi tabandadır. Çiçek durumu kapitulumdur; tabanında braktelerden meydana gelmiş bir involukrum bulunur. Durumdaki çiçekler ya erdişi veya tek eşeyli, aktinomorf veya zigomorftur. Çiçeklerde kaliks ya papus ya halka veya pul biçimindedir ya da yoktur. Korolla 5 petalli, simpetal, tüp biçiminde veya dil şeklinde uzamıştır. Stamen 5 tane ve singeneziktir. Ovaryum alt durumlu, iki karpelden meydana gelmiş tek ovüllü; meyve tipi akendir, tepsinde bazen bir papus bazen kaliks artığı bulunur, Familya bitkilerinin çoğu Asteraceae tipi salgı tüyü ve örtü tüyleri taşır (Tanker ve ark., 2004; Davis, 1975).
1.1.3. Silybum Adans. Cinsinin Genel Morfolojik Özellikleri
İki yıllık, basit yada seyrek dallanmış kanatsız gövdeye sahiptir. Taban yaprakları rozet şeklindedir. Yaprakları dikenlidir. Kapitulum tek, homogam (kapitulumdaki çiçekler aynı eşeyli), disk şeklindedir. İnvolukrum küremsidir. Filleri (brakte) çok sıralı ve kenarları dikenli, reseptakulum düz, yapısı yoğun tüylü. Çiçekler pembeden mor renge değişen renkler arasındadır. Korolla derin ve 5 lobludur.
Filamentler glandular, monadelftir. Akenler az çok basık, obovat, düz düzeyli, genellikle tepede bir zarla sarılmış konik çıkıntı halindedir. Hillum genellikle bazaldır. Papus çok sıralı dıştaki tüyler skabrit, içtekiler kılcallı ve kısa olup, hepsinin tabanda düşücü halkası vardır (Davis, 1975).
1.1.4. Silybum Türleri
Silybum atriplicifolium Fisch.
Silybum cernuum Ledeb.
Silybum eburneum Coss. & Durieu
Silybum eburneum Coss. & Durieu subsp. hispanicus (Wk.) Malag.
Silybum × gonzaloi Cantó, Sánchez Mata & Rivas Mart.
Silybum hispanicum Loscos & Pardo
Silybum intermedium Willk.
Silybum leucanthum Jord. & Fourr.
Silybum maculatum Moench
Silybum mariae Gray
Silybum marianum (L.) Gaertn.
Silybum pygmaeum Cass.
Silybum squarrosum Tausch (http://www.ipni.org)
1.1.4.1. Silybum marianum (L.) Gaertner Tür Özellikleri
Bitki 30-100 cm boylarındadır. Gövde boyuna yollu, ince uzun yumuşak tüylü, seyrek. Yapraklar tüysüz, soluk yeşil renklidir, damar boyunca beyaz benekli lekeler taşımaktadır, belirgin dentat dikenlidir. Bazal yapraklar derin triangular, loblu, obovat, saplı, 9-26 x 5-12 cm boyundadır. Üstteki yapraklar basit, ovat lanseolat. İnvolukrum 2,5-4 x 2-4 cm boyutlarındadır, filleriler yatık dikensi ovat, tabanda çok dik olarak genişlemiş ovat-subulat eklidir, dıştaki filleriler kıvrılmış içtekiler diktir, en içtekiler lanseolat ve ekli değildir. Kahverengimsi akenler siyah çizgilidir ve 7 x 3 mm boyundadır. Dış papus tüyleri yaklaşık 15 mm’dır.
Çiçeklenme 4-5. aylardadır (Davis, 1975).
1.1.4.2. Silybum marianum (L.) Gaertner Türünün Dünyada Yayılışı
Bitki doğal olarak Akdeniz bölgesinde; Irak, İran ve Afganistan’ın doğu ve güney kesimlerinde yetişmektedir. Yaygın bir şekilde Avrupa kıtasının hemen hemen her yerinde, Kuzey ve Güney Amerika ve Avustralya’da yaygın bir şekilde bulunmaktadır (Davis, 1975; Başer, 2008; Baytop, 1999; Demirezer ve ark., 2007; Brown, 2001; WHO Monographs, 2002).
1.1.4.3. Silybum marianum (L.) Gaertner Türünün Türkiye’de Dağılımı
Bitki, Akdeniz ve Karadeniz bölgelerinde yaygın bir türdür. Yol ve tarla kenarları ve boş tarlalarda 1-600 m yükseklikte yetişir (Baytop, 1999; Davis, 1975).
Türkiye Florasına göre bitki Türkiye’nin çeşitli bölgelerinde yetişmektedir;
A2(E) İstanbul: Büyük Çekmece, A2(A) Kocaeli: Pendik, A5 Samsun: Çetirli Pınar Köyü (Bafra) 100 m, B1 İzmir: Bergama, B2 Manisa: Salihli, C1 İzmir:
Efes, C2 Denizli: Pamukkale, 400 m, C5 Adana: 8 km Adana’dan Karataş’a yönünde, C6 Hatay: 8 km Belen’den Antakya’ya yönünde 600 m (Davis, 1975).
Silybum marianum (L.) Gaertner bitkisi
Silybum marianum (L.) Gaertner Yaprağı
Silybum marianum (L.) Gaertner açılmamış Çiçeği
Silybum marianum (L.) Gaertner Meyvesi
Silybum marianum (L.) Gaertner Çiçeği
Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisinin Kültür Çalışmasından Görünüm- Konya
Silybum marianum (L.) Gaertner Bitkisinin Kültür Çalışmasından Görünüm- Konya
1.2. Genel Bilgiler
1.2.1. Silybum marianum (L.) Gaertner Etki ve Kullanışları
1.2.1.1. Bitkinin Geleneksel Kullanımı
Silybum marianum bitkisi Avrupa geleneksel tıbbında uzun bir tarihe sahiptir.
Yüzyıllar önce Romalılar, bu bitkinin meyveleri ve köklerini hasta karaciğerin onarma ve yenilenmesi amacıyla kullanmışlardır. Antik Romalı tarihçi ve yazar Pliny the Elder, huzursuzluk şikayetlerinden kaçınmak amacıyla Milk thistle suyu ile bal karıştırıldığına dair kayıt tutmuştur. Dioscorides ise Milk thistle bitkisinin yılan ısırıklarında koruyucu bir etkiye sahip olduğundan dolayı oldukça olumlu görüş aktarmıştır. Silybum cinsi Güney Avrupa ve Avrasya’da doğal olarak yetişmektedir.
Tarihsel olarak bitki, safra akışını stimüle ettiğinden dolayı kolagog olarak kullanılmıştır. Sarılık, dispepsi, iştah azalması ve diğer mide rahatsızlıkların da tarihsel kullanımları arasındadır. Bitki, karın zarı iltihabı, öksürük, varisli damarlar ve uterin tıkanıklığı gibi durumlarda homeopatik de kullanılmıştır (Tenney, 1995 ).
1597 yılında herbalist Gerarde, karaciğer ilişkili melankoli hastalığının en iyi tedavilerinden bir tanesi olarak Milk thistle bitkisinin olduğunu söylemiştir. 1650 yılında Culpeper, Milk Thistle bitkisinin karaciğer ve dalakta oluşan hasarı hafifletebildiğini yazmıştır.1755 yılında Von Haller bitkinin değişik karaciğer hastalıklarında kullandığını kaydetmiştir. Avrupalı hekimler Materia Medica’ya bu bitkiyi dahil etmişlerdir. 18. yy da bir süre bitki çok kullanılmasa bile, 1848 yılında Johannes Gottfried Rademacher karaciğer ve dalak problemlerinde tıbbi kullanımının tekrar gündeme getirmiştir. 20. yüzyılın başlarında Milk Thistle kadın hastalıkları, kolon rahatsızlıkları, karaciğer şikayetleri ve safra taşlarında tavsiye ediliyordu. Son yıllarda Milk Thistle bitkisinin karaciğer toniği ve sindirim sisteminin rahatlatıcı etkilerinden dolayı birincil kullanımları olmuştur. Emziren kadınların süt üretiminin stimüle edilmesi hususunda bu bitki geleneksel tonik olarak kullanılmıştır. Alman
herbalistler rutin bir şekilde Milk Thistle bitkisini sarılık, mantar zehirlenmesi ve karaciğerin diğer hastalıklarının tedavilerinde kullanmışlardır. 1954 yılından itibaren Milk Thistle bitkisinin flavonoitler içerdiği bilimadamları tarafından bilinmekteydi.
1960 yılına gelmeden silimarin keşfedilmiştir ve silimarin “yeni sınıf kimyasal bileşik” olarak kabul edilirken terapötik özellikleri ile bilim camiasını etkilemeyi başarmıştır (Tenney, 1995).
Türkiye’de halk arasında bal ile karıştırılan tozu veya meyvelerden hazırlanan % 5’lik dekoksiyonu karaciğer hastalıklarına karşı ve safra arttırıcı olarak kullanılmaktadır. Bitkinin toprak üstü kısımları; diüretik, tonik, ateş düşürücü, romatizma ağrılarını azaltıcı ve yatıştırıcı olarak, meyveleri ise; karaciğer hücrelerinin yenileyicisi, süt salgısının arttırıcı etkisinden dolayı kullanılmaktadır (Baytop, 1999; Demirezer ve ark., 2007).
1.2.1.2. Literatüre Dayalı Kullanım
Tıbbi amaçla karaciğer ve mesane hastalıkları, sarılık, hepatit, karaciğer yağlanması, kronik dejeneratif karaciğer rahatsızlıkları, hepatit sonrasında görülen karaciğer fonksiyon bozuklukları ile alkol ve doku zehirleri gibi metabolik toksinlerin neden olduğu karaciğer hasarlarının önlenmesi ve tedavisi için kullanılır, aynı zamanda siroz, bazı kimyasallar ve Amanita phalloides mantarının neden olduğu zehirlenmeler ve kemoterapinin yan etkilerinin en aza indirilmesi için kullanılmaktadır. Drog, Komisyon E kayıtlarına göre; hazımsızlık şikayetlerinde, formülasyonları halinde toksik karaciğer hasarı ile kronik iltihaplı karaciğer hastalıklarının destekleyici tedavisinde ve hepatik sirozda dahilen kullanılmaktadır (Brown, 2001; Gruendwald, 2004; WHO Monographs, 2002).
Milk thistle ve Dandelion (Taraxacum); Milk thistle, proantisiyanidinler ve biyoflavonoitler; Meryemana dikeni, zerdaçal (Curcuma), Artichoke (Cynara) ve Schisandra ile farklı kombinasyonlarının; siroz, hepatit, karaciğer hastalıkları, sedef hastalığı, safra taşı, sarılık ve böbrek rahatsızlıkları gibi durumlarda birincil kullanışları teşkil ederken alkolizm, kemoterapi olarak, kronik yorgunluk, mide
ekşimesi, hipoglisemi, hazımsızlık, obezite, zehirlenme, varis, yağlanma gibi durumlarda sekonder kullanılışları teşkil etmektedir (Tenney, 1995).
1.2.2. Silybum marianum (L.) Gaertner Üzerinde Yapılan Çalışmalar
1.2.2.1. Biyolojik Çalışmalar
1.2.2.1.1. In vitro Çalışmalar
1- Hepatoprotektif etki
Silimarin ve metaboliti silibinin-glukuronit’in sıçan karaciğer UDP- glukuronosiltransferaz (UGT) üzerinde inhibe edici etkisi araştırılmıştır. UGT enzimi, glukuronik asidin endojen bileşiklere (bilirubin ve steroidal hormonlar) ve ekzojen bileşiklere (gıda ilavesi, ilaçlar ve çevresel kirler) konjugasyonunu katalize eden enzimlerin ana familyasını teşkil eden bir enzim sistemidir. Bu etki sıçan hepatik mikrozomlarında değerlendirilmiştir. Çalışmanın sonucunda; silimarin veya silibinin uygulanmasıyla, silibinin-glukuronit tarafından meydana gelen süreçteki UGT1A izozimlerinde konjuge olan substratların glukuronidasyonunun azaldığı gözlenmiştir (Andrea ve ark., 2005).
İzole edilmiş hepatositlerin süspansiyonu kullanılarak tert-butil hidroperoksit (t- BuOH) ve allil alkolün (AA) neden oldukları lipit peroksidasyonu, redüklenmiş glutatyon tüketimi ve hücre hayatı üzerindeki silimarin ve silibin’in hepatoprotektif etkileri incelenmiştir. AA veya t-BuOH’ın ilavesinden önce hücrelere, silimarin ve silibin ile 30 dakika boyunca ön inkübasyon yapılmıştır. İnkübasyon işleminden 1-2 saat sonra örnekler alınmıştır. 0,2 mM AA inkübasyonundan 2 saat sonraki sonuçlanabilecek hücrenin ölümü 0,01 mM silimarin tarafından önlenmiştir.
Silimarin, AA’nin neden olduğu lipit peroksidasyonunu %90 oranında azaltırken silibin ise buna göre daha az etki göstermiştir. Pro-oksidan toksinleri olan t-BuOH ve
allil alkol nedenli toksik etkilerin önlenmesinde silimarin, silibine göre in vitro olarak daha etkili olduğu gözlenmiştir (Miguez ve ark., 1994).
Farghali ve arkadaşları silimarin’in hepatositlerin üzerinde koruyuculuk etkisini araştırmışlardır. Bu amaç için erkek Wistar sıçanların izole edilmiş hepatositleri kullanılmıştır. İzole edilen hücreler silimarin ile muamele edildikten 30 dakika sonra 1 Mm tert-butil hidroperoksit (TBH) ve 100 mM D-galaktoz (D-Gal) ilave edilerek 4 saat boyunca inkübasyona bırakılmıştır. Silimarin laktat dehidrogenazın oluşumunu azaltmışken oksijenin tüketimini arttırmıştır, TBH ile muamele edilen hepatositlerdeki lipit peroksidazın (malondialdehit, MDA) oluşumunu azaltmış ve ortamdaki ürenin sentezini arttırmıştır. TBH uygulanması hepatositlerdeki Cai2+ ‘in miktarını arttırarak 600 nM değerine çıkartmıştır, silimarin uygulandığında TBH’ın neden olduğu Cai2+ ‘in yükselmesini düşürerek 300 nM değerlerine kadar çekmiştir.
D-Gal ile hasar görmüş hücrelerde silimarin laktat dehidrogenazın oluşumuna veya ürenin sentezine etkisiz olduğu saptanmıştır. Silimarin’in hepatoprotektif etkisi lipit peroksidasyonun inhibe olması ve hepatosit Cai2+ ‘in modülasyonunun sonucu gerçekleştiği anlaşılmıştır (Farghali ve ark., 2000).
Basiglio ve ark. (2009) karaciğer hücrelerini etkileyen plazma membran stabilitesi üzerindeki silimarin ve silibin’in etkilerini in vitro olarak araştırmışlardır. Silimarin (Silibin’de 500 µM konsantrasyonu) izole edilmiş plazma membranı ve sıçan hepatositlerindeki TX-100 (Triton X-100) ve taurokenodeoksikolatın (TCDC) neden oldukları plazma-membranın parçalanmasını belirgin bir şekilde önlemiştir. Yüksek konsantrasyonlarda stabilize edici özellikleri olmasına rağmen 500 µM silibin her iki sistemde deterjan konsantrasyonlardaki TX-100’ün neden olduğu plazma membran parçalanmasını şiddetlendirerek karaciğer hücre erimesine neden olmuştur. Aynı şekilde silibin taurokenodeoksikolatın (TCDC) neden olduğu plazma-membran parçalanması üzerinde düşük bir stabilize edici etki göstermiştir. Yapılan çalışmanın sonucunda; membran stabilitesi üzerinde silimarin ve silibin’in farklı etki gösterdiği;
silimarin uygun stabilize edici etki gösterirken silibin ise karaciğer hücresel erimesini şiddetlendirdiği veya sadece minimum stabilize edici etki gösterdiği tespit edilmiştir.
Bundan dolayı karaciğer hastalıkların tedavisinde kullanılabilecek tıbbi
formülasyonlarda ham silibin veya silimarin tüm ekstresinin yer almalarının avantaj ve dezavantajlarının göz önüne bulundurularak kulanılması gerekmektedir.
Ligeret ve ark. (2008) yaptıkları bir çalışmada silibin’in antioksidan ve antienflamatuvar özelliklerinden dolayı karaciğer transplantasyon sürecinde oluşabilecek yara ve hasarın üzerindeki koruyuculğunu değerlendirmişlerdir. Bu çalışmada sıçandan izole edilen karaciğer 24 saat boyunca 4 OC’de University of Wisconsin (UW) çözeltisinde saklanmıştır (kontrol). UW çözeltisine etanolde çözülmüş 100 µM silibin ilave edilmiştir. Karaciğer yine 37 OC 1 saat boyunca %20 eritrosit ilaveli Krebs-Henseleit çözeltisinde bekletilmiştir. Soğukta saklama ve ılık ortamda bekletme işlemi; kontrol grubu ile karşılaştırıldığında lipit peroksidasyonu ve süperoksit anyon jenerasyonu ilerlerken azalmış olan glutatyon, mitokondriyal ATP içeriği ve solunum kontrol oranı azalmıştır. Saklama işlemi sonucunda silibin ilavesi ile soğukta saklama ve ılıkta bekletmenin etkiledikleri parametrelerinin düzeldiği gözlenmiştir. Silibin ATP ve solunum kontrol %39 ve %16 oranlarında artmasını teşvik etmişken oksidatif stres değerlerini azaltmıştır. Bu çalışma; silibin soğukta saklama ve ılıkta bekletmenin neden olduğu karaciğer hasarı ve yarasının güçlü bir şekilde önleme potansiyeline sahip olduğunu göstermiş, ve bu etki oksidatif stres baskılama ve mitokondriyal fonksiyonlarının iyileştirme özelliklerinden kaynaklandığı düşünülmüştür.
In vitro olarak fare hepatositleri üzerinde yapılan bir çalışmada, silimarin ve silibin’in asetaminofen (parasetamol), amitriptilin, karbon tetraklorür, etanol, eritromisin estolat, galaktozamin, nortriptilin ve tert-butil hidroperoksit’in neden oldukları karaciğer toksisitesini inhibe ettiği gözlenmiştir. Domuz karaciğeri üzerinde yapılan başka bir çalışmada ise silibin’in, nonparankimal karaciğer hücrelerindeki iskemik hasarı azaltırken karaciğer hücrelerindeki post-iskemik fonksiyonu düzelttiği tespit edilmiştir (WHO Monographs, 2002).
In vitro olarak fare hepatositlerinde AA’nın neden olduğu toksisite, ilişkili lipit peroksidasyonu ve glutatyonun azaltması gibi etkileri 0,1 ve 1,0 m mol/l konsantrasyonlarda silimarin ve silibin sırasıyla verildiğinde baskılanmıştır. Silibin
makromoleküler biyosentezi in vitro ve in vivo olarak stimüle etmiştir. Başka bir çalışmada silibin’in fare karaciğerindeki ribozomal RNA’nın sentezini in vitro olarak
%20 oranında arttırdığı gözlenmiştir (WHO Monographs, 2002).
İzole edilmiş insan hepatositlerinde, AA, karbon tetraklorür, D-Gal ve parasetamol’ün neden oldukları sitotoksisitenin üzerindeki silimarin ve flavonolignanlarının etkileri in vitro olarak araştırılmıştır. Hepatosit hücreleri, 4 saat boyunca süren inkübasyon zamanı ile 0,2 mM AA ve 5 mM karbon tetraklorür, 48 saat süren inkübasyon zamanı ile 20 mM D-Gal ve 20 mM parasetamol’e maruz bırakılmıştır. Flavonolignanlar ile muamele edilen hücreler ile kontrol hücreleri arasında 4 saatlik inkübasyon süresinde büyük bir fark oluşmadığı gözlenmiştir.
İnsan hepatosit hücrelerine 24 ve 48 saat boyunca inkübasyon süresince 50 µM’dan az konsantrasyonlarda silibin, izosilibin, silidianin ve silikristin’in uygulanması;
laktat dehidrogenaz’ın salgılanması, protein içeriği veya albümin sekrasyonu üzerinde bir etki oluşmadığı gözlenmiştir. Kontrol hücreleri ile kıyaslandığında, 50 µM silimarin ve 100 µM silidianin; laktat dehidrogenaz’ın aktivitesini düşürmüştür.
100 µM silibin ve izosilibinin inkübasyonunun sonucunda, toplam protein içeriği ve albümin sekresyonun azalmasıyla birlikte hücrenin ayrılması gerçekleşmiştir (Dvořák ve ark., 2003).
Test edilen maddelerin tümü; AA ve karbon tetraklorür’ün neden olduğu laktat dehidrogenaz’ın salgılanması ve protein içeriğine bağlı olan hasara karşı, doza bağlı olarak sitoprotektif aktivite göstermiştir. Bu kapsamda en iyi koruma etkisini silidianin ve silikristin gösterirken silimarin daha az, silibin ve izosilibin ise çok az etki göstermiştir. 24 saat inkübasyon zamanı ile birlikte parasetamol’ün uygulanması, albümin sekrasyonunun azalmasına neden olmuş ve indüklenmiş glutatyon (GSH) içeriğini azaltırken kontrol grubu ile kıyaslandığında laktat dehidrogenaz’ın salgılanması üzerinde belirgin bir farklılık göstermemiştir. 48 saatlik inkübasyon süresinden sonra albümin ve GSH seviyelerinde düşüş artmışken ortamdaki laktat dehidrogenaz’ın aktivitesi yükselmiştir. Parasetamol’ün neden olduğu hasara karşı test edilen maddelerin tarafından belirgin bir şekilde koruma sağlandığı gözlenmemiştir. 50 ve 100 µM konsantrasyonlardaki silibin ve izosilibin hücrelere
koruma sağlamıştır. Albümin salgılanması; silidianin, silikristin ve daha az derecede silimarin ve silibin tarafından 50 µM konsantrasyonların altında onarılmıştır. Aynı zamanda toksinlerin etkileri 100 µM konsantrasyonlarda silimarin, silibin ve izosilibin tarafından inhibe edilmiştir (Dvořák ve ark., 2003).
Yapılan bir çalışmada hepatit C virüsünün (HCV) neden olduğu karaciğer hasarında bağışıklık fonksiyonu potansiyel etkisinin üzerindeki silimarin’in in vitro olarak etkisi olup olmadığı araştırılmıştır. Standardize silimarin preparatının (MK001) kullanıldığı ve kullanılmadığı durumlarda nonspesifik ve antijenik stimülasyona karşı HCV ile infekte olan ve infekte olmayan gönüllülerden taze izole edilmiş periferal kan mononüklear hücreleri (PBMC) ve T hücrelerinin tepkileri in vitro olarak test edilmiştir. PBMC’de oluşan minimal MK001 toksisitesi 5 ile 40 μg/ml konsantrasyonların arasında tayin edilmiştir. MK001 doza bağlı olarak proliferasyon, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, interferon (IFN)-γ ve interlökin (IL)-2’nin sekresyonunu anti CD-3’ün stimüle ettiği PBMC yoluyla inhibe etmiştir. Silimarin T hücrelerin proliferasyonu ve proinflamatuvar sitokin sekresyonunun inhibe etme etkisi, önceden kanıtlanmış antiviral etkileri ile birlikte, HCV enfeksiyon sürecinde klinik yararı sağlayan muhtemel bu etki mekanizmaları önerilmektedir (Morishima ve ark., 2010).
2- Antioksidan etki
Silimarin ve silibin insan platelet ve fibrioblastları, sıçan karaciğer ve mitokondrileri gibi çeşitli model sistemlerde hidroksi anyonları, fenoksi radikalleri ve hipoklöröz asit gibi serbest oksijen radikalleriyle etkileşerek ve enzimatik veya enzimatik olmayan yollarla üretilen serbest inorganik radikalleri kullanarak in vitro antioksidan aktivite göstermiştir. İzole edilmiş sıçan Kupffer hücrelerinin silibin (IC50 80 μmol/l) ile tedavisinden sonra, süperoksit anyon radikalleri ve nitrik oksit üretimini inhibe edilmiştir. Hem silimarin’in hem de silibin’in insan kırmızı kan hücrelerinin mitokondriyal ve mikrozomal örneklerinde lipit peroksidasyon sonucu oluşan serbest radikalleri inhibe ettikleri gözlenmiştir (WHO Monographs, 2002).
In vitro olarak yapılan başka bir çalışma ise; silibin, silidianin ve silikristin’in fosfodiesteraza bağlı siklik AMP’yi inhibe ettiklerini göstermiştir. Aynı zamanda in vitro olarak silibin, sıçan karaciğerinin membranındaki fosfolipit sentezi ve bozulmayı inhibe etmişken, etanol ile muamele edilen sıçanlarda fosfolipit metabolizmasındaki değişikliği düzeltmiştir (WHO Monographs, 2002).
Ultraviyole ışınlarının, cilt kanserinin indüksiyonunda önemli rol oynayan immün sistem baskılaması ve oksidatif strese neden olduğu çok iyi bilinmektedir. Daha önce fare derisinin üzerinde yapılan in vivo çalışmalarda, silimarin’in topikal uygulanmasıyla birlikte fotokarsinojenezis’in engellendiği gözlenmiştir, bu engelleyici etkisinin mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Bu mekanizmanın aydınlatılabilmesi için, immün testi, analitik testler ve ELISA testleri kullanılmıştır.
In vitro olarak yapılan bu çalışmada fare derisinde ultraviyole ışınlarının neden olduğu immünite baskılanma ve oksidatif stres (Bu gibi faktörler, cilt kanserinin oluşumuna büyük rol oynamaktadır) üzerinde silimarin’in etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada C3H/HeN fare türünün derisi, Mj/cm2 dozlarda UVB’e 90 maruz bırakıldıktan sonra 1 mg silimarin/cm2 deri alanına uygulanmıştır. Kontakt hipersensitivitenin UVB indüklü baskılanması silimarin tarafından inhibe edilmiştir;
infiltre lökositler, özellikle CD11b+ hücrelerin ve miyaloperoksidazın aktivitesinin (%50-71) inhibe olması ile bağlı olduğu gözlenmiştir. Silimarin’in etkisinin;
UVB’nin neden olduğu immünosupresif sitokin interlökin-10’u üreten hücrelerinin üretiminin önemli derecede azaltmasıyla kendisini göstermiştir. Silimarin’in topikal uygulanması; UVB’nin neden olduğu H2O2 üretici hücrelerinin sayısında ve uyarılabilir nitrik oksit sentaz’ın önemli derecede azaltarak H2O2’ninüretimini %58- 65 oranında ve nitrik oksit üretimini %65-68 oranında düşürmüştür. Bu çalışma; fare derisine silimarin’in topikal uygulamasının, UV ışınlarının neden olduğu kontakt hipersensitivite ve oksidatif stresin baskılanmasına neden olan UV‘nin indüksiyonundan sorumlu olan enflamatuvar lökositlerin infiltrasyonunu önlediğini göstermiştir. UV’nin immünite tepkileri ve oksidatif stresin indüklü baskılanması, cildi erken yaşlanma (photoaging) ve fotokarsinogenezi kapsayan değişik hastalıklara duyarlı hale getirmektedir. Sonuç olarak, farelerdeki fotokarsinogenezisin silimarin tarafından önlenmesinin, UVB’nin immünite tepkileri
ve oksidatif stresin indüklü baskılanmasının önlenmesi ile ilişkili olduğu anlaşılmıştır. Hayvan modelinde elde edilen esas veriler, insan sisteminde benzer çalışmaların yapılması ve silimarin’in UV ışınlarının neden olduğu erken yaşlanma ve fotokarsinogenezisi kapsayan cilt hastalıklarına karşı yararlanılabilecek etkili bir kemopreventif ajan olabileceğini tespit etmek için bir yol göstermiştir (Katiyar, 2002).
Kiruthiga ve arkadaşları, insanın hemolize eritrositlerindeki karsinojenik potansiyelli bir madde olan benzo (α) pirene [B(α)P] karşı silimarinin antioksidan ve protektif özelliklerini in vitro olarak değerlendirmişlerdir. Hemolize eritrositlerin, taşıyıcı (vehicle) kontrollü grup (grup1), B(α)P ile inkübe edilmiş grup (grup2) ve B(α)P silimarin ile birlikte inkübe edilmiş grup (grup3) şeklinde üç grubun üzerinde antioksidan enzimleri (süperoksit dismutaz; SOD, katalaz; CAT, glutatyon peroksidaz; GPx, glutatyon redüktaz; GR ve glutatyon-S-transferaz; GST), lipit peroksidasyonu (LPO) ve MDA izlenerek silimarin’in protektif etkisi araştırılmıştır.
B(α)P ile inkübe edilen hemolize eritrositlerde antioksidan enzimlerin spesifik aktivitelerinde belirgin bir şekilde azalma tespit edilmişken MDA seviyelerinde yükselme gözlenmiştir. Silimarin’in protektif etkisi, antioksidan enzimlerin işlevinde yükselme ve MDA’nın seviyelerinde düşme gibi sonuçlarla izah edilmiştir. Hemolize eritrositlerin 45 dakika süreyle B(α)P ile inkübe edilmesiyle (grup2) oluşan 3- hidroksi benzo (α)piren (3-OH-B(α)P) metaboliti yüksek oranda tespit edilmiştir.
Grup 3’te olduğu gibi; silimarin’in eklenmesinden sonra reaktif metaboliti olan 3- OH-B(α)P rastlanmaması, silimarin’in protektif etkisinden kayanaklandığı düşünülmektedir. Grup 2’deki 3-OH-B(α)P’nin oluşumu, reaktif oksijen türlerinin (O2- ve H2O2) oluşumuna imkan tanımaktadır. Elde edilen sonuçlar, silimarin’in çevresel etkenlerin neden oldukları oksidatif hasarlara karşı belirgin bir şekilde serbest radikal süpürücü ve protektif aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir (Kiruthiga ve ark., 2007).
3- Sitotoksik etki
Yüksek derecede metastatik özelliğe sahip olan A549 (insan akciğer kanseri) hücreleri farklı konsantrasyonlarda (100 µM’a kadar) silibin ile muamele edildiğinde, silibin’in bu hücrelerin yayılmasını önlediği gözlenmiştir. Silibin’in prostat kanseri hücrelerinde telomeraz aktivitesini inhibe ettiği ve kansere karşı koruyucu potansiyeli olduğu da gösterilmiştir (Demirezer ve ark., 2007).
Bir çalışmada baikalein (5,6,7-trihidroksiflavon), silimarin ve kombinasyonları insan hepatoma HepG2 hücrelerin üzerinde in vitro olarak sinerjik etkileri araştırılmıştır.
Bu çalışmada HepG2 (hepatosellüler karsinoma) ve Chang karaciğer (non-tümör karaciğer hücresi) olmak üzere iki adet insan karaciğer hücresi kullanılmıştır. 6,75 µg/ml baikalein veya 100 µg/ml silimarintek olarak uygulandıklarında belirgin bir şekilde HepG2 büyümesinin engellendiği tespit edilmiştir. Baikalein 6,75, 13,5, 27 µg/ml dozlarda tek başına uygulandığında ilk 24 saatte sırasıyla %93,42, 71,11 ve 63,70 oranlarında hücrelerin azaldığı ve 48 saat sonra sırasıyla %85,21, 57,67 ve 38,36 oranlarında azaldığı gözlenmiştir. 100 µg/ml silimarin yalnız olarak uygulandığında 24 saatta hücrelerin % 73,24 ve 48 saattan sonra % 58,36 oranında azaldığı gözlenmiştir. Baikalein silimarin ile kombinasyon halinde uygulandığında ilk 24 saatte katkısal bir etki, 48 saatte ise sinerjik bir etki sağlandığı gözlenmiştir. 48 saatte 6,75 µg/ml baikalein uygulanmasından sonra hücrelerin % 85,62 oranında ve 25, 50 ve 100 µg/ml dozlarda silimarin eklendiğinde; sırasıyla % 49,67, % 38,56 ve
% 19,61 oranlarda hücrelerin azaldığı gözlenmiştir. Buna karşın tüm uygulamaların Chang karaciğer hücreler üzerinde çok az veya etkisiz olduğu gözlenmiştir. Bu çalışma baikalein ile silimarin kombinasyonunun normal hücrelere zarar vermeden etkin bir şekilde tümör hücrelerini yok ettiğini göstermiştir (Chen ve ark., 2009).
Li ve arkadaşları böbrek karsinoma hücreleri üzerindeki silibin’in inhibitör etki araştırmışlardır. Bu çalışmada insan böbrek karsinoma hücresi (Caki-1 hücresi) kullanılmıştır. Doz ve zamana bağlı olarak silibin Caki-1 hücresinin büyümesini inhibe ettiği gözlenmiştir. Silibin 50, 100 ve 200 µM dozlarda verilmesinden 24 saat sonra (serum: P<0,05) %2-18, (serumsuz: P<0,005) %4-39 ve 48 saat sonra (serum:
P<0,05) %2-20, (serumsuz: P<0,005) %20-45 oranlarında hücrenin büyümesini inhibe ettiği gözlenmiştir. 200 µM dozdaki silibin 24 saat, 100 µM dozdaki silibin 48 saat sonra serumsuz olarak Caki-1 hücre büyüme inhibisyonunu daha çok güçlü bir şekilde sağlanmıştır ve hücre ölümünden dolayı hücre sayısında azalma gözlenmiştir.
Silibin 50, 100 ve 200 µM dozlarda verilmesinden 24 ve 48 saat sonra apoptotik hücre topluluğunun canlı konumundan belirgin bir şekilde erken ilerlemiş ve hücreleri ölü konumuna çevirmiştir. Caki-1 hücresindeki apoptoziz’in doz ve zamana bağlı olarak silibin tarafından belirgin bir şekilde bastırıldığı gözlenmiştir. Silibin 50, 100 ve 200 µM dozlarda verilmesinden 24 saat sonra kontrol hücreleri (0 µM silibin) ile karşılaştırldığında; erken aşamadaki apoptotik hücrelerin %4,1, %9,4 ve %19,6 oranlarda, ilerlemiş apoptotik hücrelerin %5,2, %9,7 ve %13,5 oranlarda azaldığı gözlenmiştir. Silibin 50, 100 ve 200 µM dozlarda verilmesinden 24 saat sonra kontrol hücreleri (0 µM silibin) ile karşılaştırldığında; erken aşamadaki apoptotik hücrelerin %8,8, %13,9 ve %23,5 oranlarda, ilerlemiş apoptotik hücrelerin %11,5,
%17,4 ve %27,1 oranlarda azaldığı gözlenmiştir. Silibin ERK ½ (extracellular signal-regulated kinase) aktivitesini belirgin bir şekilde inhibe etmiştir, 100 µM dozdaki silibin, fosforilasyonu inhibe etmesine karşın fosfo-p38 ve fosfo-JNK’in (c- Jun N-terminal kinase) aktivitelerini belirgin bir şekilde inhibe etmemiştir. Caki-1 hücresinin büyüme inhibisyonunun ERK ½ sinyal yolağının inhibe etmesiyle sağlandığı düşünülmektedir. Bu düşünceyi teyit etmek amacıyla silibin ERK ½ sinyal yolağının oluşumundaki etkenlerin üzerindeki inhibe edici etkileri araştırılmıştır. Bu oluşumun bir etkeni olan cAMP response element-binding (CREB) ERK ½ ‘in fosforilasyonun yoluyla aktive edilen bir hedef gendir. 100 µM dozdaki silibin’in şiddetli bir şekilde CREB’i azalttığı, 200 µM dozdaki silibin’in ise tümüne yakın bir seviyede inhibe ettiği gözlenmiştir. Silibin’in 200 µM dozda verilmesinden 24 ve 48 saat sonra kaspaz-9 güçlü bir şeklide aktive olmuştur. Kaspaz dizisindeki en son aşama; PARP’in (Poli ADP-riboz polimeraz) bülünmesiyle sonuçlanan kaspaz- 3’ün aktivasyonudur. Silibin’in 200 µM dozda verilmesinden 24 ve 48 saat sonra kaspaz-3’ün güçlü bir şekilde aktive edilmesi ve PARP’in parçalanmasıyla sonuçlanmıştır. Sonuç olarak silibin EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ve ERK aktivitelerini, bir apoptozis inhibitör proteini ve hücre düzeyinde apoptozis'i düzenleyen survivin ekspresyonu, p53’ün ekspresyonun ilerlemesi ve kaspaz
dizisinin oluşumunu inhibe ederek renal kanser karsinoma Caki-1 hücrelerin çoğlamasını etkin bir şekilde inhibe ettiği gözlenmiştir (Li ve ark., 2008).
Başka bir çalışmada silimarin, silibin ve bazı kanser türlerinde kullanılan talidomitin’in kolon kanser LoVo hücrelerinde antianjiyogenez etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmada materyal olarak in vitro ortamda modifiye edilmiş endotel tabakası (EA.hy 926) ve kolon kanser (LoVo) hücre çizgisi kültürü kullanılmıştır. Sitotoksisite denemelerinde 41,8 µg/ml silimarin, 0,22 mM silibin ve 0,088 mM talidomit EA.hy 929 hücrelerin, diğer yandan 16,1 µg/ml silimarin, 0,12 mM silibin ve 0,099 mM LoVo hücrelerin büyümesinin %20 oranında (IC20) inhibisyonu sağlanmıştır. Bu üç bileşiğin (silimarin, silibin ve talidomit) denenen konsantrasyonlarında göçüş ve farklılaşma değerlerine bağlı olarak inhibisyon gerçekleşmiştir. EA.hy 926 hücrelerinin LoVo hücrelerine doğru IC50 kemotaksis göçüşlerinin engellenmesi, 1,15 µg/ml silimarin, 0,66 µM silibin ve 1,98 µM
talidomit tarafından gerçekleşmiştir.Farklılaşma ölçümünde ise silimarin, silibin ve talidomit in vitro kapilar oluşumunu %50 oranında ve sırasıyla 1,25 µg/ml, 2,6 µM, 6,3 µM konsantrasyonlarda inhibe etmiştir. Yapılan analizlerde vasküler endotel büyüme faktörü LoVo hücrelerin aracılığı ile gizlenebilmektedir. Silimarin, silibin ve talidomit sırasıyla 6,52 µg/ml, 6,6 µM, 131,7 µM konsantrasyonlarda bu gizlenmeyi
%50 oranında azaltmıştır (Yang ve ark., 2003).
Yaptıkları bir çalışmada, Momeny ve arkadaşları silibin’in insan hepatosit karsinoma HepG-2 hücrelerin büyümesi üzerinde inhibe etkisini araştırmışlardır. Yapılan denemelerin sonucunda konsantrasyona bağlı olarak silibin’in HepG-2 hücrelerinin çoğalmasını etkin bir biçimde inhibe ettiği tespit edilmiştir. 25, 50 ve 75 µM silibin uygulanmasından sonra hücrelerin sırasıyla %8,6, %14,1 ve %21,06 oranlarında, HepG-2 hücreleri tarafından üretilen NO sırasıyla %16, %17 ve %23 oranlarında üretimi azaldığı ve ERK ½ fosforilasyonun sırasıyla %6, %18 ve %45 oranlarında azaldığı gözlenmiştir. Diğer yandan HepG-2 hücresindeki MMP-2 ve MMP-9’un (Matrix metallopeptidase 2 ve 9) aktivitelerin üzerinde silibin’in inhibe edici etkisi araştırılmıştır. 72 saat sonra silibin ile muamele edilen hücrelerdeki MMP-2 aktivitesinin önemli derecede azaldığı gözlenmiştir. Doza bağlı olarak silibin belirgin
