Mutasyon Analiz Teknikleri I
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Hafta IX
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
HA (Heteroduplex Analysis)
CEHA/CE-SSCP (Capillary Electrophoresis HA)
TGCE (Temperature Gradient Capillary Electrophoresis
DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici (Formaldehitli)
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici (Üreli)
Kapiller Elektroforez (CE)
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici
ELEKTROFOREZ
Elektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre yürür.
Denatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha ziyade konformasyonlarına bağlı olarak yürür.
Denatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil yapı oluşturamayacakları için moleküler ağırlıklarına göre yürürler.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici olmayan (Native)
Büyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA gibi) %0.8-1 arası jel hazırlanmalıdır.
PCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası) %2’lik jele ihtiyaç vardır.
RFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10-20 bç farklı fragmentleri ayırmak için NuSieve benzeri agaroz türevleri ile rezolüsyon arttırılabilir.
Metaphor agaroz ile 3-4 bç farkı ayırmak mümkündür.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris Asetik asit EDTA) ile hazırlanır.
DNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile kesilmiş genomik DNA’yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur.
Kısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
TBE 5X veya 10X konsantrasyonda hazırlanıp 1X konsantrasyonda kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti oluşturur.
TAE 50X konsantrasyonda hazırlanabilir.
TAE’nin hazırlama maliyeti TBE’ye göre daha düşüktür.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde kullanılır. Özellikle Northern blot analizi yapılacaksa jeli bu şekilde hazırlamak şarttır. Ancak yalnızca RNA’nın varlığına/yokluğuna ve bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz hazırlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde jelin RNaz’sız ortama uygun şekilde hazırlanması gerekmektedir.
ELEKTROFOREZ
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum Persülfat (APS) aracılığıyla TEMED’in katalizörlüğünde çapraz bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir.
APS her defasında taze hazırlanmalıdır.
ELEKTROFOREZ
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Akrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir.
Akrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir.
Akrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan porların çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler; 19:1/29:1/39:1 gibi
MDE (Mutation Detection Enhancement) Jel
ELEKTROFOREZ
Kapiller Elektroforez
Donmayan akrilamid bazlı özel polimerler kullanılır.
Bu polimerlerin nativ veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur.
ELEKTROFOREZ
PCR temelli mutasyon analiz tekniklerinde amaç olası dizi değişimlerinin analiz edilen DNA fragmentinin konformasyonuna olan etkisinin tespit edilmesidir.
PCR TEMELLİ MUTASYON
ANALİZ YÖNTEMLERİ
PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
SSCP/HA
PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
CE-HA CE-SSCP
H01 well H01 16May2002 Run01 0
0 3000 10000 20000
G01 well G01 16May2002 Run01 0
0 3000 10000 20000
F01 well F01 16May2002 Run01 0
0 3000 10000 20000 30000 40000 50000 60000
