Mutasyon Analiz Teknikleri I
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Hafta X
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
DHPLC
Transgenomic/
WAVE
http://www.transgenomic.com/flash/DHPLCFlash2.asp
DHPLC
http://insertion.stanford.edu/melt.html
BRCA ex1
CAATAGGTAGCGATTCTGACCTTCGTACAGCAATTACTGTGATGCAATAA GCCGCAACTGGAAGAGTAGAGGCTAGAGGGCAGGCACTTTATGGCAAACT CAGGTAGAATTCTTCCTCTTCCGTCTCTTTCCTTTTACGTCATCCGGGGG CAGACTGGGTGGCCAATCCAGAGCCCCGAGAGACGCTTGGCTCTTTCTGT CCCTCCCATCCTCTGATTGTACCTTGATTTCGTATTCTGAGAGGCTGCTG CTTAGCGGTAGCCCCTTGGTTTCCGTGGCAACGGAAAAGCGCGGGAATTA CAGATAAATTAAAACTGCGACTGCGCGGCGTGAGCTCGCTGAGACTTCCT GGACGGGGGACAGGCTGTGGGGTTTCTCAGATAACTGGGCCCCTGCGCTC AGGAGGCCTTCACCCTCTGCTCTGGGTAAAGGTAGTAGAGTCCCGGGAAA GGGACAGGGGGCCCAAGTGATGCTCTGGGGTACTGGCGTGGGAGAGTGGA TTTCCGAAGCTGACAGATGGGTATTCTTTGACGGGGGGTAGGGGCGGAAC CTGAGAGGCGTAAGGCGTTGTGAACCCTGGGGAGGGGGGCAGTTTGTAGG TCGCGAGGGAAGCGCTGAGGATCAGGAAGGGGGCACTGAGTGTCCGTGGG GGAATCCTCGTGATAGGAACTGGAATATGCCTTGAGGGGGACACTATGTC TTTAAAAACGTCGGCTGGTCATGAGGTCAGGAGTTCCAGACCAGCCTGAC CAACGTGGTGAAACTCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCG TGGTGCCGCTCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTAGAAC C
with 851 base pairs
Melting temperature of entire strand: 61.25°
Temperature = 55° Celsius: 1-3,
Temperature = 56° Celsius: 4-5,
Temperature = 57° Celsius: 777-789, Temperature = 58° Celsius: 6-6,776-776,790-791, Temperature = 59° Celsius: 7-48,302-312,773-775,792-792, Temperature = 60° Celsius: 49-138,297-301,313-314,771-772, Temperature = 61° Celsius: 139-296,315-316,654-770,793-851 Temperature = 62° Celsius: 317-653, This sequence should be run at all of the following temperatures to ensure detection of all polymorphisms.
Recommended temperature: 62°
Recommended temperature: 56°
DHPLC
CBP Exon 6
A. Rothan’dan
DHPLC
A. Rothan’dan
DHPLC
A. Rothan’dan
DHPLC
Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002;306:63-73.
DHPLC
DHPLC
DHPLC = denaturing high-performance liquid chromatography.
Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002;306:63-73.
Karıştırma testi DHPLC
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
P300/EXON16 4239G->T
E1014X
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
CBP/EXON31.1 -1
5371-8INSA
Karıştırma testi DHPLC
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
0
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
0
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Time (Minutes)3 4 5 6
2 1
0
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
DHPLC HDAC2 EXON1 Karıştırma
HDAC2 143InsCAG
DHPLC HDAC2 EXON12 Karıştırma
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Time (Minutes)
6 5
4 3
2 1
Absorbance (mV)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
HDAC2 1573DelA
HCT15
SSCP
HSUV39H2 -11InsA (?)
Kapiller Elektroforez
Genel Primerlerle
işaretleme
P300 4239G>T (E1014X)
A02 well A02 15May2002 Run01 0
2400 2500 2600 2700 2800
0 10000 20000 30000 40000 50000
G03 well G03 15May2002 Run01 0
2400 2500 2600 2700 2800
100000 20000 30000 40000 50000 60000
P300 4239G>T (E1014X )
CBP IVS21-4del22
F03 well F03 15May2002 Run01 0
3000 4000 5000
0 1000 2000 3000 4000
E03 well E03 15May2002 Run01 0
3000 4000 5000
0 10000 20000 30000 40000
D03 well D03 15May2002 Run01 0
3000 4000 5000
0 10000
C03 well C03 15May2002 Run01 0
3000 4000 5000
0 1000 2000 3000 4000
CBP IVS21-4del22
CBP IVS31-7InsA
H01 well H01 16May2002 Run01 0
0 3000 10000 20000
G01 well G01 16May2002 Run01 0
0 3000 10000 20000
F01 well F01 16May2002 Run01 0
0 3000 10000 20000 30000 40000 50000 60000
CBP IVS31-7InsA
Temperature Gradient Capillary ElectrophoresisTGCE
http://www.spectrumedix.com/7144_9155163437/blank/browse .asp?a=383&BMDRN=2000&BCOB=0&c=53494
Mutasyon Analiz Teknikleri III
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Hafta IX
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
Bir sonraki aşama….
1. SSCP, HA, DHPLC, TGCE benzeri bir teknikle saptadığınız ve incelediğiniz DNA fragmentinde konformasyonel değişime neden olan dizi değişiminin ne olduğunu ortaya çıkarmak,
2. İncelediğiniz DNA fragmentini bir indirekt yöntemle analiz etmeden doğrudan dizi bazında değerlendirmek,
3. Klonlamak üzere hazırladığınız DNA fragmentine klonlama öncesi aşamalarda (PCR) hatalı bir baz girip girmediğinden emin olmak için
Bir sonraki aşama DNA dizi analizidir.
DNA DİZİ ANALİZİ
PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
MUTASYONU ÖNCEDEN BİLİYOR VE
YENİ BİR ÖRNEK GRUBUNDA VARLIĞINI
SORGULAMAK İSTİYORSANIZ
RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism)
ASA (Allele Specific Amplification)
Primer Extension
PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
RFLP
AGATCT
Yabanıl Tip Allel
Mutant allel
TCTAGA
AGAGCT TCTCGA
RE kesim bölgesi
RE bölgesi kaybolmuş
PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
ASA
Primer Extension :
Bağlanma:
Primere bir nt eklenmesi
Uzama: Saptama:
Floresans
