PAKLİTAKSEL'İN NİOZOM FORMÜLASYONLARININ HAZIRLANMASI, İN VİTRO VE İN VİVO
OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ
Zerrin SEZGİN BAYINDIR
FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Nilüfer YÜKSEL
2010- ANKARA
PAKLİTAKSEL'İN NİOZOM FORMÜLASYONLARININ HAZIRLANMASI, İN VİTRO VE İN VİVO
OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ
Zerrin SEZGİN BAYINDIR
FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Nilüfer YÜKSEL
Bu tez, TÜBİTAK tarafından 107S248 Proje numarası ile desteklenmiştir.
2010- ANKARA
İÇİNDEKİLER
Kabul ve onay ii
İçindekiler iii
Önsöz viii
Simgeler ve kısaltmalar x
Şekiller xii
Çizelgeler xvi
1. GİRİŞ 1
1.1.Veziküler Sistemler 4
1.2. Lipozomların Tanımı ve Genel Özellikleri 4
1.3. Niozomların Tanımı ve Genel Özellikleri 5
1.3.1. Niozom Hazırlama Yöntemleri 9
1.3.1.1. Niozomlara Yüklenemeyen Etkin Maddeyi Uzaklaştırma Yöntemleri 13 1.3.1.2. Niozomlarda Partikül Büyüklüğü Küçültme Yöntemleri 15
1.3.2. Niozom Oluşumuna Etki Eden Faktörler 15
1.3.3. Niozomların Karakterizasyonu 22
1.3.3.1. Niozomlara Etkin Madde Yükleme Etkinliği Tayini 22 1.3.3.2. Niozomların Partikül Büyüklüğü ve Dağılımının Tayini 23
1.3.3.3. Niozomlarda Zeta Potansiyel Tayini 23
1.3.3.4. Niozomların Stabilitesi 24
1.3.3.5. Niozomlardan Etkin Madde Çıkışının İncelenmesi 28
1.3.3.6. Niozomların Toksisitesinin İncelenmesi 28
1.3.4. Modifiye Niozom Sistemleri 29
1.3.5. Niozomların Farmasötik Alanda Kullanımları 31
1.3.5.1. Niozomların Oral Yolla Uygulanması 31
1.3.5.2. Niozomların Parenteral Uygulamaları 37
1.3.5.3. Niozomların Topikal Yolla Uygulanması 40
1.3.5.4. Niozomların Oküler Uygulamaları 44
1.3.5.5. Niozomların Vajinal Uygulamaları 45
1.3.5.6. Niozomlar ile Yapılan Diğer Çalışmalar 45
1.4. Paklitaksel Hakkında Genel Bilgiler 46
1.4.1. Paklitaksel’in Elde Edilmesi 46
1.4.2. Paklitaksel’in Kimyasal Yapısı 47
1.4.3. Paklitaksel’in Fizikokimyasal Özellikleri 48
1.4.4. Paklitaksel’in Stabilitesi 49
1.4.5. Paklitaksel’in Etki Mekanizması 49
1.4.6. Paklitaksel’in Farmakokinetik Özellikleri 51
1.4.7. Paklitaksel’in Miktar Tayini Yöntemleri 52
1.4.8. Paklitaksel’in Piyasa Preparatları ve Piyasa Preparatlarına Ait Sorunlar 52 1.4.9. Paklitaksel’in Oral Biyoyararlanımını Artırmaya Yönelik Çalışmalar 56
2. GEREÇ VE YÖNTEM 60
2.1. Kullanılan Aletler ve Kimyasal Maddeler 60
2.1.1. Kullanılan Aletler ve Malzemeler 60
2.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler 61
2.1.3.Çalışmalarda Kullanılan Ortamların Bileşimi 62
2.1.4. Çalışmalarda Kullanılan Maddelerin Molekül Ağırlıkları 63
2.2. Paklitaksel Üzerinde Yapılan Çalışmalar 66
2.2.1. Paklitaksel’in X-Işını Toz Kırınımı ( XRPD) Analizi 66 2.2.2. Paklitaksel’in Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile Analizi 66 2.2.3. PCT’nin Metanol Ortamında Ultra Viole (UV) Analizi 66 2.2.4. Paklitaksel’in Metanol Ortamında Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi
(HPLC) ile Analizi 66
2.2.5. Paklitaksel’in PBS-Tw (pH 7,4) Ortamında HPLC ile Analizi 67 2.2.6. Paklitaksel’in SGF-Tw (pH 1,2) İçinde HPLC ile Analizi 68 2.2.7. Paklitaksel’in Plazma ve Doku Numunelerindeki Miktar Tayinini
Yapmak Amacıyla HPLC ile Analizi 68
2.2.8. Analitik Yöntemlerin Validasyonu 69
2.3. Önformülasyon Çalışmaları 76
2.4. Farklı Sürfaktanlar Kullanılarak Etkin Madde Yüklü Niozom Formüllerinin
Hazırlanması ve Karakterizasyonu 77
2.4.1. Etkin Madde Yükleme Etkinliği Tayini 77
2.4.2. Niozomların Partikül Büyüklükleri ve Dağılımlarının İncelenmesi 78
2.4.3. Niozomların Zeta Potansiyellerinin Tayini 78
2.4.4. Niozomların Görüntülenmesi 80
2.4.5. Niozomlardan Etkin Madde Çıkış Tayini 80
2.4.6. Nizomlara Yüklü Etkin Maddenin ve Niozom Formülasyonlarının
Stabilitesinin Tayini 81
2.4.6.1. Serbest ve Niozomlara Yüklü Paklitaksel’in Sindirim Enzimleri
Varlığındaki Stabilitesinin İncelenmesi 81
2.4.7. F1 Formülasyonunun Üretiminin Tekrarlanabilirliğinin Tayini 81
2.4.8. F1 Formülasyonunun Sterilizasyonu 82
2.5. Farklı Span 40, Disetil Fosfat (DCP) ve Kolesterol Miktarları Kullanılarak
Niozom Formülasyonlarının Geliştirilmesi 82
2.5.1. F1S1-F1S9 Niozomlarının Karakterizasyonu 84
2.5.2. Niozomlarda Partikül Büyüklüğü Küçültme Çalışmaları 84 2.6. Etkin Madde Yüklü P6 Niozomlarının Biyoadhezif Polimerlerle
Kaplanması ve Hazırlanan Formülasyonların Karakterizasyonu 85 2.6.1. Niozomların Safra Tuzu Çözeltisindeki Stabilitesinin İncelenmesi 86
2.7. Sonuç Formülasyonların Belirlenmesi 87
2.8. Sonuç Formülasyonlar Üzerinde Yapılan Çalışmalar 87 2.8.1.Sonuç Formülasyonlarda Etkin Madde Çıkışının İncelenmesi 87 2.8.2. Sonuç Formüllerin Geçirimli Elektron Mikroskobu (Transmission
Electron Microscope-TEM) Kullanılarak Görüntülenmesi 88 2.8.3. Sonuç Formüllerde Etkin Madde-Yardımcı Madde Etkileşiminin
İncelenmesi 88
2.8.3.1. X-Işını Toz Kırınımı ( XRPD) Analizi 88
2.8.3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) Analizi 89
2.8.4. Ölçek Büyütme (Scale Up) Çalışması 89
2.8.5. Stabilite Tayini 90
2.8.6. Formülasyonların İn Vivo Etkinliklerinin İncelenmesi 90
2.8.6.1. Formülasyonların Oral Yolla Verilişi 93
2.8.6.2. Formülasyonların İntravenöz Yolla Verilişi 93
2.8.6.3. Doku Dağılım Çalışması 96
3. BULGULAR 97
3.1. Paklitaksel Üzerinde Yapılan Çalışmalara Ait Bulgular 97 3.1.1. Paklitaksel’in X-Işını Toz Kırınımı (XRPD) Analizi 97 3.1.2. Paklitaksel’in Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile Analizi 98 3.1.3. Paklitaksel’in Metanol Ortamında Ultra Viole (UV) Analizi 98 3.1.4. Paklitaksel’in Metanol Ortamında Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi
(HPLC) ile Analizi 99
3.1.5. Paklitaksel’in PBS-Tw (pH 7,4) Ortamında HPLC ile Analizi 100 3.1.6. Paklitaksel’in SGF-Tw (pH 1,2) İçinde HPLC ile Analizi 101 3.1.7. Paklitaksel’in Plazma ve Doku Numunelerindeki Miktar Tayinini
Yapmak Amacıyla HPLC ile Analizi 103
3.1.8. Analitik Yöntemlerin Validasyonu 104
3.2. Önformülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular 115
3.3. Farklı Sürfaktanlar Kullanılarak Etkin Madde Yüklü Niozom Formüllerinin Hazırlanması ve Karakterizasyonu Çalışmalarına Ait Bulgular 116
3.3.1. Etkin Madde Yükleme Etkinliği Tayini 116
3.3.2. Niozomların Partikül Büyüklükleri ve Dağılımlarının İncelenmesi 117
3.3.3. Niozomların Zeta Potansiyellerinin Tayini 120
3.3.4. Niozomların Görüntülenmesi 121
3.3.5. Niozomlardan Etkin Madde Çıkış Tayini 122
3.3.6.1. Paklitaksel’in ve Niozom Formülasyonlarının Sindirim Enzimlerindeki
Stabilitesinin İncelenmesi 123
3.3.7. F1 Formülasyonunun Üretiminin Tekrarlanabilirliğinin Tayini 124
3.3.8. F1 Formülasyonunun Sterilizasyonu 125
3.4. Etkin Madde Yüklü Span 40 Niozomlarının Hazırlanışı Üzerine Disetil Fosfat, Span 40 ve Kolesterol’ün Farklı Miktarlarının Etkisinin
İncelenmesi 126
3.4.1. F1S1-F1S9 Niozomlarının Karakterizasyonu 126
3.4.2 Niozomlarda Partikül Büyüklüğü Küçültme Çalışmaları 130 3.5. Etkin Madde Yüklü P6 Niozomlarının Biyoadhezif Polimerlerle
Kaplanması ve Hazırlanan Formüllerin Karakterizasyonu 132 3.5.1. Kaplanmış ve Kaplanmamış Niozomların Safra Tuzu Çözeltisindeki
Stabilitesinin İncelenmesi 134
3.6. Sonuç Formülasyonlar Üzerinde Yapılan Çalışmalara Ait Bulgular 136
3.6.1. Etkin Madde Çıkış Tayini 136
3.6.2. Geçirimli Elektron Mikroskobu (Transmission Electron Microscope-
TEM) Kullanılarak Niozomların Görüntülenmesi 136
3.6.3. Sonuç Formüllerde Etkin Madde-Yardımcı Madde Etkileşiminin
İncelenmesi 138
3.6.3.1. X-Işını Toz Kırınımı (XRPD) Analizi 138
3.6.3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) Analizi 140
3.6.4. Ölçek Büyütme (Scale Up) Çalışması 142
3.6.5. Seçilen Formüllerin Stabilitesinin İncelenmesi 145 3.6.6. Formülasyonların İn Vivo Olarak İncelenmesi 147
3.6.6.1. Formülasyonların Oral Yolla Verilişi 147
3.6.6.2. Formülasyonların İntravenöz Yolla Verilişi 149
3.6.6.3. Doku Dağılım Çalışması 150
4. TARTIŞMA 152
4.1. Paklitaksel Üzerinde Yapılan Çalışmalara İlişkin Bulguların
Değerlendirilmesi 152
4.2. Önformülasyon Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 154 4.3. Farklı Sürfaktanlar Kullanılarak Etkin Madde Yüklü Niozom Formüllerinin
Hazırlanması ve Karakterizasyonu Çalışmalarına İlişkin Bulguların
Değerlendirilmesi 155
4.3.1. Etkin Madde Yükleme Etkinliğinin Değerlendirilmesi 155 4.3.2. Niozomların Partikül Büyüklük Dağılımları ve Zeta Potansiyelleri 156 4.3.3. Niozomlardan Etkin Madde Çıkışının Değerlendirilmesi 158 4.3.4. Paklitaksel’in ve Niozom Formülasyonlarının Sindirim Enzimlerinin
Varlığındaki Stabilitesinin Değerlendirilmesi 159
4.3.5. F1 Formülasyonunun Üretiminin Tekrarlanabilirliğinin Değerlendirilmesi 160 4.3.6. F1 Formülasyonunun Sterilizasyonuna İlişkin Bulguların
Değerlendirilmesi 161
4.4. Etkin Madde Yüklü Span 40 Niozomlarının Hazırlanışı Üzerine Disetil Fosfat, Span 40 ve Kolesterol’ün Farklı Miktarlarının Etkisinin
İncelenmesine İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 161 4.5. F1S8 Formülasyonu ile Hazırlanan Niozomlarda Partikül Büyüklüğü
Küçültme Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 163 4.6. Etkin Madde Yüklü P6 Niozomlarının Biyoadhezif Polimerlerle
Kaplanması ve Hazırlanan Formüllerin Karakterizasyonu Çalışmalarına
İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 163
4.7. P6 ve K1 Formülasyonları ile Hazırlanan Niozomlar Üzerinde Yapılan
Çalışmalara İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 165
4.7.1. Etkin Madde Çıkışının Değerlendirilmesi 165
4.7.2. Formüllerin Geçirimli Elektron Mikroskobu (Transmission Electron
Microscope-TEM) ile Alınan Görüntülerin Değerlendirilmesi 165 4.7.3. Sonuç Formüllerde Etkin Madde-Yardımcı Madde Etkileşiminin
İncelenmesi 166
4.7.3.1. X-Işını Toz Kırınımı ( XRPD) Analizi ile Elde Edilen Bulguların
Değerlendirilmesi 166
4.7.3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (Dsc) Yöntemi ile Elde Edilen
Bulguların Değerlendirilmesi 167
4.7.4. Ölçek Büyütme (Scale Up) Çalışmasının Değerlendirilmesi 168 4.7.5. Stabilite Çalışmaları Sonucunda Elde Edilen Bulguların
Değerlendirilmesi 169
4.7.6. Formülasyonların İn Vivo Etkinliklerinin Değerlendirilmesi 169
5. SONUÇ VE ÖNERİLER 175
ÖZET 178
SUMMARY 179
KAYNAKLAR 180
ÖZGEÇMİŞ 198
ÖNSÖZ
Bu tez çalışmasında son yıllarda en sık görülen ölüm sebepleri arasında ilk sıralarda yer alan kanser tedavisinde kullanılan ve büyük bir pazar payı olan, ancak formülasyonundan kaynaklı ciddi yan etkilere sahip bir antikanser etkin madde olan Paklitaksel’in niozom formülasyonları hazırlanmıştır. Hazırlanan formülasyonların intravenöz uygulama için piyasa preparatından daha üstün özelliklerde olduğu gösterilmiştir. Oral uygulama için ise formuller gelecek vaat etmektedir.
Doktora ve yükseklisans eğitimim boyunca her yönden büyük ilgisini ve yardımlarını gördüğüm, her türlü zorluğu aşmamda bana güç veren, Sayın Hocam Prof. Dr. Nilüfer YÜKSEL’e, tez çalışmamda gösterdiği bilimsel katkılarından ve emeklerinden dolayı sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Doktora tez çalışmamı 107S248 no’lu araştırma projesi kapsamında maddi açıdan destekleyen TUBİTAK Araştırma Destek Programları Başkanlığı’na teşekkürü bir borç bilirim.
Çalışma süreci boyunca sağladıkları destek ve ilgilerinden dolayı Farmasötik Teknoloji Bölüm Başkanımız Sayın Prof. Dr. Nurten ÖZDEMİR’e ve Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Prof. Dr. Asuman BOZKIR’a ve öğrenimim boyunca bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi saygıdeğer hocalarım Prof. Dr. Kandemir CANEFE’ye, Prof. Dr. Nilüfer TARIMCI’ya, Doç. Dr. Ayşegül KARATAŞ’a, Yrd.
Doç. Dr. Canan HASÇİÇEK’e, Yrd. Doç. Dr. Müge KILIÇARSLAN’a, Yrd. Doç.
Dr. Tansel ÇOMOĞLU’na ve Dr. Ecz. Tangül ŞEN’e, teşekkürlerimi sunarım.
Doktora tez izleme komitemde yer alan kıymetli öğretim üyeleri Sayın Prof. Dr.
Tamer BAYKARA’ya ve Sayın Prof. Dr. Nevin ÇELEBİ’ye çalışmalarım boyunca verdikleri bilimsel destekler, öneriler için teşekkür ederim.
HPLC çalışmalarımda bilimsel deneyimlerinden ve bilgilerinden sıkça yararlandığım Analitik Kimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Prof. Dr. Sibel ÖZKAN ve Araştırma Görevlisi Dr. Ecz. Murat PALABIYIK’a teşekkür ederim.
İn vivo deneylerin yapılmasında Farmakoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarında sağladığı imkanlar ve sıcak ilgisinden dolayı, Sayın Prof Dr. Melih ALTAN’a, deneysel çalışmalarım sırasında gösterdiği destek ve motivasyondan dolayı Sayın Doç. Dr. Arzu ONAY- BEŞİKCİ’ye ve yardımlarından dolayı Dr. Ecz.
Ali Murat İRAT’a teşekkür ederim.
Tez çalışmamda DSC analizlerinin gerçekleştirilmesinde büyük yardımları olan Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Sayın Prof. Dr. Tuncer DEĞİM’e ve yardımlarından dolayı Dr. Ecz Sibel İLBASMIŞ’a, XRPD analizinin yapılması için sağlamış olduğu destekten dolayı ODTÜ Elektrik ve Elektronik Mühendisliği Bölümü Öğretim Üyesi Sayın Prof. Dr.
Cengiz BEŞİKCİ’ ye ve ODTÜ Merkez Laboratuvarı çalışanlarından Müh. Pınar
TOKMAKKAYA’ya, TEM mikrograflarımın çekilmesini sağlayan Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Sayın Prof. Dr. Belgin CAN’a, in vivo deneylerde HPLC analizlerinin yapılmasında büyük desteğini gördüğüm Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Enstrümantal Analiz Birimi sorumlusu Sayın Nilüfer VURAL’a, ultrasantrifüj işlemini gerçekleştiren Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Enstrümantal Analiz Birimi uzmanlarından Dr. Elif KORKMALI ERTÜRÜN’e, AFM ile görüntülenme çalışmalarında yapmış olduğu katkılardan dolayı Nanomanyetik Bilimsel Cihazlar Şirketinin değerli çalışanı Kimyager Hilal ATALAN’a teşekkür ederim.
İlgi ve yardımlarıyla her zaman yanımda olan Dr. Ecz. Özge İNAL’a, Dr. Ecz.
Esin ÖZMENER SÖZEN’e ve Dr. Ecz. Bahar KAYSERİLİOĞLU’na, çalışmalarım boyunca her açıdan desteklerini gördüğüm, güler yüzleri ile hep yanımda olan, benzer zorlukları birlikte aştığımız, sevgili arkadaşlarım Dr. Ecz.Ulya BADILLI’ya, Dr. Ecz. Burcu DEVRİM’e ve Dr. Ecz. C. Tuba ŞENGEL TÜRK’e yardımları ve dostlukları için teşekkür ederim.
Değerli çalışma arkadaşlarım Dr. Ecz. Ongun M. SAKA’ya, Uzm. Ecz. Günseli YÜKSEL’e, Uzm. Ecz. Gülin AMASYA’ya, Uzm. Ecz. Berrin BAŞARAN’a, Uzm.
Ecz. Aslıhan KURTOĞLU’na ve Ecz. Mert SERİM’e bana gösterdikleri ilgi için teşekkür ederim.
Manevi desteği kadar bilimsel desteklerini de benden esirgemeyen babam Prof.
Dr. Fatin SEZGİN’e, ilgi ve varlığıyla bana her zaman güç veren annem Hatice SEZGİN’e ve arkadaşlığını benden esirgemeyen, her an yanımda olan sevgili abim Yard. Doç. Dr. Metin SEZGİN’e minnettarım.
Daima sevgiyle yanımda olan, bana sonsuz güven ve huzur veren, doktora çalışmalarım boyunca da hep destekçim olan, sevgili eşim Fatih Mehmet BAYINDIR’a ve biricik meleğim Zeynep BAYINDIR’a hayatıma katmış oldukları tüm güzellikler için minnettarım.
SİMGELER VE KISALTMALAR
% AÇEM Açığa çıkan etkin madde miktarı
% BB % Bağıl Biyoyararlanım
% BSS Yüzde Bağıl Standart Sapma
% EE Niozomlara yüklenen etkin madde yüzdesi (Entrapment Efficiency) A Safra tuzu çözeltisinde inkübe edilen formülasyonlardan elde edilen
absorbans değeri
A Niozomlara yüklenen etkin madde miktarı (g) a o Hidrofilik baş grubun alanı
ABD Amerika Birleşik Devletleri
AFM Atomik güç mikroskobu (Atomic Force Microscopy) ATRA All-Trans-Retinoik Asit
AUC 0→24 Plazma konsantrasyonu-zaman eğrisinin altında kalan alan (ng/ml.saat) B pH 7,4 PBS tamponunda disperse edilen niozom formülasyonlarından
elde edilen absorbans değeri
B Niozom hazırlamada kullanılan başlangıç etkin madde miktarı (g) Cmax Maksimum plazma konsantrasyonu (ng/ml)
CPP Kritik yerleşme parametresi (Critical Packing Parameter) cryo-TEM Kriyojenik Transmisyon Elektron Mikroskobisi
DAD Foto diyot dizi detektörü (Diode Array Detector) DCP Disetil fosfat
DCT Dokataksel
DLS Dinamik ışık saçılımı (Dynamic Light Scattering) DMSO Dimetil sülfoksit
DSC Diferansiyel taramalı kalorimetri (Differential Scanning Colorimetry) E Dielektrik sabiti
EMA Avrupa İlaç Ajansı (European Medicines Agency)
EO Etilen Oksit
FDA Amerikan İlaç ve Gıda Kurumu FK Fiziksel Karışım
Ge Yaygın geçiş piki-omuz GI Gastrointestinal
h Ortamın absolut viskozluğu
HPLC Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (High Pressure Liquid Chromatography)
HPMC Hidroksipropil metilselüloz (Hydroxy Propyl Methyl Cellulose) Ic Kritik hidrofobik grup uzunluğu
İTS İlaç Taşıyıcı Sistem
İ.V. İntravenöz
Kyağ/su Partisyon katsayısı
Kr Kristal erime noktası (°C)
max Maksimum absorbans görülen dalga boyu (nm) Lz Genel uzaklaşma hız sabiti (saat-1)
LOD Teşhis sınırları (Limit Of Detection) (µg/ml) LOQ Tayin sınırları (Limit Of Quantification) (µg/ml)
M Mobilite
MA Molekül ağırlığı
MLV Çok tabakalı vezikül (Multi Lamellar Vesicules)
MRT Ortalama kanda kalış süresi (Mean Residence Time) (saat) MWCO Molecular Weight Cut Off
NCI Ulusal Kanser Enstitüsü (National Cancer Institute) PALS Faz analizi ışık saçılımı (Phase Analysis Light Scattering) PBS Phosphate Buffered Saline pH 7,4 tamponu
PBS-Tw % 0,1 Tween 80 içeren PBS pH 7,4
PCS Foton korelasyon spektroskopisi (Photon Correlation Spectroscopy)
PCT Paklitaksel
PDI Polidispersite indeksi (Poly Dispersity Index) PEG Poli Etilen Glikol
P-gp Permeabilite-glikoprotein PLGA Poli Laktik-ko-Glikolik Asit r2 Determinasyon katsayısı RES Retikülo Endotelyal Sistem
rhGM-SF Rekombinant insan granülosit makrofaj koloni sitimüle edici faktör SGF-Tw % 0,1 Tween 80 içeren suni mide sıvısı pH 1,2
SH Standart Hata
SUV Küçük tek tabakalı vezikül (Small Unilamellar Vesicle) TCSB Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı
TEM Geçirimli elektron mikroskobu (Transmission Electron Microscope) Tmax Maksimum plazma konsantrasyonuna ulaşmak için geçen süre (saat)
2 /
t1 Plazma yarı ömrü (saat)
TTS Transdermal Terapötik Sistemler
UV Ultra Viyole
v/s/y Vezikül-su-yağ
Hidrofobik grup hacmi VIP Vazoaktif İntestinal Peptit
XRPD X-Işını Toz Kırınımı (X-ray Powder Diffraction)
YEM Yüzey Etkin Madde
Z Zeta potansiyeli (mV)
ŞEKİLLER
Şekil 1.1 Amerika Birleşik Devletlerinde 1975 ve 2004 yıllarında meydana gelen başlıca ölüm sebepleri ve yüzdeleri (Ries ve ark., 2007).
Şekil 1.2. Türkiye'de en çok görülen ölüm sebeplerinin yıllar içindeki seyri (TKASKD, 2010).
Şekil 1.3. Niozomun şematik gösterimi.
Şekil 1.4. Niozomların kimliğini ve özelliklerini belirleyen faktörler (Uchegbu ve Vyas, 1998).
Şekil 1.5. Uchegbu ve ark.’nın yapmış oldukları çalışmada elde ettikleri hekzadesil digliserol (C18G2)-kolesterol-Solulan C24’e ait üçlü faz diyagramı. Toplam sürfaktan:lipit miktarı=60mM. 1. Bölge: çok düzlemli (polihedral) niozomlar (5 µm), 2. Bölge: küresel,spiral ve boru biçimindeki tübüler niozomlar (2-10 µm), 3. Bölge: Diskomlar (12-60 µm), büyük niozomlar (12-40 µm), küresel, spiral ve tübüler niozomlar (2-10 µm), 4. Bölge: Diskomlar ve muhtemelen karışık miseller, 5. Bölge: kolesterol kristalleri, 6. Bölge: Küresel niozomlar (2-10 µm), 7. Bölge: Muhtemelen karışık misellerden oluşan berrak çözelti, 8.Bölge:Sıcaklığın artırılması ile oluşan karışık miseller (Uchegbu ve ark., 1996b).
Şekil 1.6. Proniozomların hazırlanması ve proniozomlardan niozom eldesinin şematik gösterimi.
Şekil 1.7. Amfifilik bir maddenin şematik gösterimi (Uchegbu ve Vyas, 1998).
Şekil 1.8. IgG antikoru ile kojuge edilmiş Span 60 niozomu (Hood ve ark., 2007).
Şekil 1.9. Oral olarak verilen etkin maddelerin oral biyoyararlanımının sağlanması için geçmesi gereken bariyerler.
Şekil 1.10. Lenfatik sistem ve kan dolaşımı için partiküllerin geçişi için muhtemel üç yolun gösterimi (1:Paraselüler geçiş, 2:Transselüler geçiş, 3:M- hücrelerinden geçiş).
Şekil 1.11. Farelere oral yolla 2,72 mg MTX/kg dozda serbest Metotreksat (MTX)
□, % 6 polisorbat 80 içinde MTX ■, tip A niozomlarına yüklü MTX○
ve tip B niozomlarına yüklü MTX ● uygulaması sonucunda elde edilen MTX serum konsantrasyonları (Azmin ve ark.,1985).
Şekil 1.12. Span:kolesterol (7:3) niozomlarına yüklü insülinin 3 saat kimotripsin ve tripsin çözeltilerinde ve 1 saat pepsin çözeltisinde inkübe edilmesi sonucunda belirlenen stabilitesi (Varshoza ve ark., 2003).
Şekil 1.13. Ovalbumin yüklü niozomların farelere oral yolla uygulamasından sonra elde edilen antikor titrelerinin sonuçları (Rentel ve ark., 1999).
Şekil 1.14. PCT’nin elde edilmesi.
Şekil 1.15. PCT’nin kimyasal yapısı.
Şekil 1.16. Taksan’ın kimyasal yapısı.
Şekil 1.17. PCT’nin etki mekanizması.
Şekil 1.18. PCT’nin hücre döngüsünde etkili olduğu faz.
Şekil 2.1. Çalışmada kullanılan maddelerin kimyasal formülleri.
Şekil 3.1. A) PCT’ye ait X-ışını difraktogramı. B) Literatürde verilen farklı PCT formlarının difraktogramları [a) 195°C’deki yarı-kristal paklitaksel, b) 100°C’deki dehidrate paklitaksel.2H2O c) 25°C’deki dehidrate paklitaksel.2H2O, d) 25°C’deki anhidr paklitaksel] (Liggins ve ark., 1997).
Şekil 3.2. A) PCT’ye ait DSC termogramı. B) Literatürde verilen farklı PCT formlarının termogramları [a) anhidr paklitaksel, b) amorf paklitaksel, c) paklitaksel.2H2O d) soğutularak rehidrate edildikten sonra yarı- kristal paklitaksel] (Liggins ve ark., 1997).
Şekil 3.3. PCT’nin metanol içindeki UV spektrumu.
Şekil 3.4. Metanol kalibrasyonunda belirtilen koşullarda elde edilen PCT pikini gösteren HPLC kromatogramı.
Şekil 3.5. PCT’nin HPLC yöntemi ile hazırlanan metanol ortamındaki kalibrasyon doğrusu.
Şekil 3.6. PCT’nin PBS-Tw (pH 7,4) ortamındaki kalibrasyonunda belirtilen koşullarında elde edilen PCT pikini gösteren HPLC kromatogramı.
Şekil 3.7. PCT’nin HPLC yöntemi ile hazırlanan PBS-Tw (pH 7,4) ortamındaki kalibrasyon doğrusu.
Şekil 3.8. PCT’nin SGF-Tw (pH 1,2) ortamındaki kalibrasyonunda belirtilen koşullarında elde edilen PCT pikini gösteren HPLC kromatogramı.
Şekil 3.9. PCT’nin HPLC yöntemi ile hazırlanan SGF-Tw (pH 1,2) ortamındaki kalibrasyon doğrusu.
Şekil 3.10. PCT’nin plazma ortamındaki kalibrasyonunda belirtilen koşullarda elde edilen PCT pikini gösteren HPLC kromatogramı.
Şekil 3.11. PCT’nin HPLC yöntemi ile hazırlanan plazma ortamındaki kalibrasyon doğrusu.
Şekil 3.12. (a) 10 dak vorteks uygulaması, (b) 20 dak vorteks uygulaması, (c) 30 dak ultrasonik banyoda sonikasyon uygulaması, (d) 15 dak vorteks uygulamasının ardından 45 dak ultrasonik banyoda sonikasyon uygulaması sonucu elde edilen Span 40 niozomlarına ait optik mikroskop görüntüleri (x40).
Şekil 3.13. Farklı sürfaktanlarla hazırlanan F1-F8 formülasyonlarına ait partikül büyüklüğü ve dağılımı grafikleri.
Şekil 3.14. a) F1 formülasyonuna ait amplitüd modunda elde edilen AFM görüntüsü b) F1 formülasyonuna ait topografinin 3 boyutlu AFM görüntüsü.
Şekil 3.15. Farklı sürfaktanlar kullanılarak hazırlanan niozom formüllerinden etkin madde çıkışı. (24 saat sonunda çıkan etkin madde miktarları-%: F1:
23,4; F2: 28,6; F3: 19,9; F4: 32,1; F5: 33,1; F6:19,7; F7: 27,6; F8:
23,8).
Şekil 3.16. Farklı sürfaktanlar ile hazırlanan F1-F8 formülasyonlarının gastrointestinal enzimler (kimotripsin, tripsin ve pepsin) varlığındaki stabiliteleri.
Şekil 3.17. F1 formülasyonunun üretiminin tekrarlanabilirliğini incelemek amacıyla hazırlanan 3 paralel formüle ait partikül büyüklüğü dağılımları.
Şekil 3.18. Farklı DCP miktarı ve etkin madde:(Span 40:kolesterol) oranı kullanılarak hazırlanan F1S1-F1S9 niozom formüllerinden etkin madde çıkışı. (24 saat sonunda çıkan etkin madde miktarları-%: F1S1: 25,2;
F1S2: 20,4; F1S3: 23,3; F1S4: 23,5; F1S5:30,9; F1S6: 29,9; F1S7:
19,4; F1S8: 30,5; F1S9: 30,7).
Şekil 3.19. Farklı sürelerde prob sonikasyon uygulanan niozomlara ait ortalama partikül büyüklükleri.
Şekil 3.20. Farklı sürelerde prob sonikasyon uygulanan niozomların prob sonikasyon öncesi ve 24 saat sonrasında tayin edilen ortalama partikül büyüklükleri.
Şekil 3.21. P6, K1 ve K2 formülasyonlarına ait partikül büyüklüğü ve dağılımı grafikleri.
Şekil 3.22. P6, K1 ve K2 formülasyonlarına ait zeta potansiyel dağılımı grafikleri.
Şekil 3.23. Carbopol ile kaplanmış (K1) ve kaplanmamış (P6) niozom formüllerinin safra tuzundaki stabilitesi
Şekil 3.24. Farklı konsantrasyonlardaki safra tuzunda inkübe edilen formüllerde yapılan PCT miktar tayini sonuçları.
Şekil 3.25. P6 ve K1 formüllerinden etkin madde çıkış tayini sonuçları.
Şekil 3.26. P6 niozomlarının geçirimli elektron mikroskobuyla çekilen mikrografları.
Şekil 3.27. K1 niozomlarının geçirimli elektron mikroskobuyla çekilen mikrografları.
Şekil 3.28. PCT ve DCP, kolesterol, Span 40’dan oluşan fiziksel karışıma (FK) ait X-ışını difraktogramları.
Şekil 3.29. PCT ve PCT, DCP, kolesterol, Span 40’dan oluşan fiziksel karışıma (FK+PCT) ait X-ışını difraktogramları.
Şekil 3.30. PCT ve etkin madde içermeyen P6 niozomuna (N) ait X-ışını difraktogramları.
Şekil 3.31. PCT ve PCT yüklü P6 niozomuna ait X-ışını difraktogramları.
Şekil 3.32. DSC analizi sonucunda elde edilen termogramlar [a) PCT, b) DCP, c) Carbopol 974P, d) Kolesterol, e) Span 40, f) PCT içeren fiziksel karışım, g) PCT ve Carbopol 974P içeren fiziksel karışım, h) P6 niozomu, ı) K1 niozomu].
Şekil 3.33. P6 niozomlarının üretiminde ölçek büyütmek amacıyla hazırlanan formüllere ait partikül büyüklüğü dağılımı grafikleri.
Şekil 3.34. P6 niozomlarının üretiminde ölçek büyütmek amacıyla hazırlanan formüllere ait partikül büyüklüğü dağılımı grafiklerinin toplu görünümü.
Şekil 3.35. Oral yolla verilen formülasyonlardan elde edilen PCT plazma konsantrasyonu-zaman profili.
Şekil 3.36. İ.V. yolla verilen formülasyonlardan elde edilen PCT plazma konsantrasyonu-zaman profili.
Şekil 3.37. Oral olarak formülasyonların uygulandığı deney hayvanlarından 24.saat sonunda alınan dokularda yapılan PCT miktar tayini sonuçları [(*
İşaretli dokuda PCT miktarı açısından K1 formülasyonu, süspansiyon ve P6’dan % 90 düzeyinde önemli fark göstermektedir (p<0,1)].
Şekil 3.38. İ.V. olarak formülasyonların uygulandığı deney hayvanlarından 24.saat sonunda alınan dokularda yapılan PCT miktar tayini sonuçları [*İşaretli dokularda PCT miktarı açısından Taxol ve P6 niozomları arasında % 95 düzeyinde önemli fark görülmektedir (p<0,05);** İşaretli dokularda PCT miktarı açısından Taxol ve P6 niozomları arasında % 90 düzeyinde önemli fark görülmektedir (p<0,1)].
Şekil 4.1. Niozomlara yüklenen etkin madde yüzdesi (%) ile niozom formülasyonlarında kullanılan noniyonik sürfaktanların HLB değerleri arasındaki ilişki.
ÇİZELGELER
Çizelge 1.1 Niozomlara yüklenmeyen etkin maddeyi uzaklaştırmak amacıyla kullanılan tekniklerin karşılaştırılması.
Çizelge 1.2 Vezikül oluşturucu sürfaktanlarda bulunan hidrofilik baş grupları.
Çizelge 1.3. Niozom oluşturma özelliğine sahip sürfaktan örnekleri.
Çizelge 1.4. 200 mg tek dozluk proniozomlara yüklü selekoksibin ve piyasa preparatı Celebrex kapsüllerin gönüllü insan deneklere (n=6) oral olarak uygulanması neticesinde elde edilen farmakokinetik parametreler (Nasr, 2010).
Çizelge 1.5. Niozomların parenteral yolla uygulamalarına yönelik çalışmalar.
Çizelge 1.6. Niozomların Topikal uygulamalarına yönelik çalışmalar.
Çizelge 1.7. Niozomların oküler uygulamalarına yönelik çalışmalar.
Çizelge 1.8. Paklitaksel’in Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı (TCSB), Avrupa İlaç Ajansı (European Medicines Agency - EMA) ve Amerikan Gıda ve İlaç Kurumu’ndan (Food and Drug Administration – FDA) onay almış piyasa preparatları.
Çizelge 1.9. PCT’nin oral uygulamalarına yönelik faz çalışmaları.
Çizelge 2.1. Niozomlar üzerinde yapılan ön formülasyon çalışmasında kullanılan bileşenler.
Çizelge 2.2. Farklı sürfaktanlar kullanılarak hazırlanan niozom formülasyonlarının bileşimi.
Çizelge 2.3. Span 40, disetil fosfat (DCP) ve kolesterolün farklı miktarları ile hazırlanan niozomların içerikleri.
Çizelge 2.4. F1S8 formülasyonu üzerinde partikül büyüklüğü küçültme çalışmaları yapılarak elde edilen formüller.
Çizelge 2.5. Biyoadhezif kaplama yapılan niozom formülasyonları.
Çizelge 2.6. XRPD spektrumu alınan numuneler.
Çizelge 2.7. DSC analizi yapılan numuneler.
Çizelge 2.8. Ölçek büyütme (scale-up) için hazırlanan formülasyonlar.
Çizelge 2.9. İn vivo çalışmalarda kullanılan formüller ve uygulama dozları.
Çizelge 3.1. PCT’nin metanol ortamındaki HPLC ile miktar tayininde belirlenen koşullar.
Çizelge 3.2. PCT’nin PBS-Tw (pH7,4) ortamındaki HPLC ile miktar tayininde belirlenen koşullar.
Çizelge 3.3. PCT’nin SGF-Tw (pH 1,2) ortamındaki HPLC ile miktar tayininde belirlenen koşullar.
Çizelge 3.4. PCT’nin plazma ortamındaki HPLC ile miktar tayininde belirlenen koşullar.
Çizelge 3.5. PCT’nin metanol, PBS-Tw, SGF-Tw ve plazma ortamlarındaki kalibrasyonlarının doğrusallık ve aralığı ile kalibrasyon doğrusuna ait istatistiksel veriler.
Çizelge 3.6. PCT’nin metanol ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen doğruluk ve geri elde sonuçları.
Çizelge 3.7. PCT’nin PBS-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen doğruluk ve geri elde sonuçları.
Çizelge 3.8. PCT’nin SGF-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen doğruluk ve geri elde sonuçları.
Çizelge 3.9. PCT’nin plazmada yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen doğruluk ve geri elde sonuçları.
Çizelge 3.10. PCT’nin metanol ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen tekrarlanabilirlik sonuçları.
Çizelge 3.11. PCT’nin PBS-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen tekrarlanabilirlik sonuçları.
Çizelge 3.12. PCT’nin SGF-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen tekrarlanabilirlik sonuçları.
Çizelge 3.13. PCT’nin plazmada yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen tekrarlanabilirlik sonuçları.
Çizelge 3.14. PCT’nin metanol ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı günlerdeki ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.15. PCT’nin PBS-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı günlerdeki ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.16. PCT’nin SGF-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı günlerdeki ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.17. PCT’nin plazmada yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı günlerdeki ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.18. PCT’nin metanol ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı analistlere ait ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.19. PCT’nin PBS-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı analistlere ait ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.20. PCT’nin SGF-Tw ortamında yapılan miktar tayininin analitik validasyonundan elde edilen farklı analistlere ait ara kesinlik sonuçları.
Çizelge 3.21. PCT’nin metanol, PBS-Tw, SGF-Tw ve plazma ortamlarındaki miktar tayini yönteminin teşhis ve tayin sınırları.
Çizelge 3.22. F1-F8 formülasyonlarına yüklenen etkin madde yüzdesi ve kullanılan sürfaktanların HLB değerleri.
Çizelge 3.23. F1-F8 formülasyonlarının partikül büyüklükleri ve polidispersite indeksleri.
Çizelge 3.24. F1-F8 formülasyonlarının zeta potansiyelleri.
Çizelge 3.25. Tekrarlayan üretimler ile elde edilen F1 formülasyonlarına ait karakterizasyon sonuçları.
Çizelge 3.26. F1 formülasyonunun otoklav ve gama radyasyon ile sterilizasyonu sonucunda elde edilen karakterizasyon parametreleri.
Çizelge 3.27. F1S1-F1S9 formüllerinin karakterizasyon parametrelerine uygulanan çoklu regresyon analizi sonucu elde edilen doğrulara ait istatistiksel veriler.
Çizelge 3.28. F1S1-F1S9 formülasyonlarına yüklenen etkin madde yüzdeleri.
Çizelge 3.29. F1S1-F1S9 formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü polidispersite indeksleri ve zeta potansiyelleri.
Çizelge 3.30. P6, K1 ve K2 niozomlarına ait zeta potansiyel, ortalama partikül büyüklüğü ve polidispersite indeksi ölçümleri.
Çizelge 3.31. Safra tuzunda inkübe edilen formüllerin partikül boyutları.
Çizelge 3.32. Numunelerin DSC analizinde elde edilen pikler (Kr: kristal erime noktası; Ge: yaygın geçiş piki-omuz).
Çizelge 3.33. P6 niozomlarının üretiminde ölçek büyütmek amacıyla hazırlanan formüllere ait etkin madde yükleme etkinliği tayini, partikül büyüklük ve dağılımı, zeta potansiyel sonuçları.
Çizelge 3.34. 5±3 °C’de saklanan P6 ve K1 niozomlarının stabilite test sonuçları.
Çizelge 3.35. Oral yolla verilen formülasyonlardan elde edilen biyoyararlanım parametreleri.
Çizelge 3.36. İ.V. yolla formülasyon verilişi neticesinde elde edilen PCT plazma konsantrasyonlarının farmakokinetik analizi sonuçları.
1. GİRİŞ
Hücrelerde DNA'nın hasarı sonucu hücrelerin kontrolsüz veya anormal bir şekilde büyümesi ve çoğalması olan kanser, günümüzün en önemli sağlık sorunlarından birisidir. Sık görülmesi ve öldürücülüğünün yüksek olması nedeniyle de ciddi bir halk sağlığı sorunudur.
Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Ulusal Kanser Enstitüsü’nün (NCI) 1975 ve 2004 senelerinde ABD’deki ölüm sebeplerinin yüzdelerine ait istatistikler Şekil 1.1’de verilmiştir (Bethesda, 2007).
Kanser % 19,2
Kalp Hastalıkları % 37,8 Kronik akciğer hastalıkları % 2,3
Pnömoni ve inluenza % 2,9
Diğer sebepler % 22
Kazalar % 5,4
Kazalar % 4,7 Serebrovasküler % 6,3 Serebrovasküler % 10,3
1975 2004
Kronik akciğer
hastalıkları % 5,1 Kanser % 23,1
Pnömoni ve inluenza % 2,5
Diğer sebepler % 31,2 Kalp Hastalıkları
% 27,2 Kanser % 19,2
Kalp Hastalıkları % 37,8 Kronik akciğer hastalıkları % 2,3
Pnömoni ve inluenza % 2,9
Diğer sebepler % 22
Kazalar % 5,4
Kazalar % 4,7 Serebrovasküler % 6,3 Serebrovasküler % 10,3
1975 2004
Kronik akciğer
hastalıkları % 5,1 Kanser % 23,1
Pnömoni ve inluenza % 2,5
Diğer sebepler % 31,2 Kalp Hastalıkları
% 27,2
Şekil 1.1. Amerika Birleşik Devletlerinde 1975 ve 2004 yıllarında meydana gelen başlıca ölüm sebepleri ve yüzdeleri (Bethesda, 2007).
İstatistikler incelendiğinde 1975 yılında en yüksek oranda ölüme sebep olan hastalık %37,4 oranıyla kalp hastalıkları olurken bunu % 19,2 ile kansere bağlı ölümler izlemektedir. 2004’e ait tabloda ise kalp hastalıklarına bağlı ölüm yüzdesi azalırken kansere bağlı ölüm yüzdesi giderek artmıştır.
Türkiye'de en sık görülen 5 ölüm sebebinin 1965'ten başlayarak yıllar içindeki seyri incelendiğinde kanserin 1990'a kadar kalp ve damar sistemi hastalıkları ve enfeksiyon hastalıklarından sonra en sık görülen 3. ölüm sebebi iken 1990 yılından itibaren kontrol altına alınan enfeksiyon hastalıklarının önüne geçerek en sık görülen 2. ölüm sebebi haline geldiği görülmektedir (Şekil 1.2) (TKASKD, 2010).
Şekil 1.2. Türkiye'de en çok görülen ölüm sebeplerinin yıllar içindeki seyri (TKASKD, 2010).
Standart kanser tedavisi kemoterapi, cerrahi operasyon ve radyoterapi veya kombinasyonları şeklinde olmaktadır. Tedavinin başarısız olması durumunda ise diğer yöntemler ile tedavi olabilme şansı sadece % 10’dur. Kemoterapi, kanserin yanı sıra AIDS, kardiyovasküler restenoz gibi diğer bir takım ciddi sağlık problemlerinde etkin tedavi sağlamaktadır. Ancak, kemoterapi ilaç toksisitesi ve ilaç formülasyonu problemlerinden ötürü büyük risk taşımaktadır. Bu nedenlerden dolayı antikanser etkin maddelerin daha etkili, stabil ve düşük toksisiteye sahip formülasyonlarının hazırlanması önem kazanmış ve farmasötik araştırmalar içersinde yerini almıştır (Dong ve Feng, 2005; Win ve Feng, 2005; Moutardier ve ark., 2003).
Kansere bağlı ölümlerin giderek artış göstermesi, kanser vakalarının artması, antikanser maddelerin birçoğunun formülasyon problemi nedeniyle etkin olarak kullanılamayışı bizi çalışmamızda antikanser etkili bir bileşik olan paklitaksel (PCT) üzerinde çalışmaya yönlendirmiştir.
Bu tez çalışmasının başlıca amaçları aşağıda verilmiştir:
Paklitaksel yüklü niozom formülasyonlarının hazırlanması ve in vitro karakterizasyonunun yapılması.
Niozom formülasyonlarının PCT’nin oral biyoyararlanımını artırma üzerindeki etkisinin in vivo çalışmalarla incelenmesi.
Hazırlanan formüllerin piyasa preparatlarına alternatif olarak intravenöz yolla kullanıp kullanılamayacağının in vivo çalışmalarla incelenmesi.
PCT’nin piyasa preparatları intravenöz yolla uygulanmaktadır ve formülasyonundan kaynaklanan pek çok olumsuz yan etki ortaya çıkmaktadır. Bu tez çalışmasında başlıca amaç oral biyoyararlanımı %1’in altında olan PCT’yi oral biyoyararlanımını artırmaya yönelik olarak niozomal ilaç taşıyıcı sistemlere yüklemektir. Niozomların nanometre düzeyindeki boyutları nedeniyle Peyer plakları vasıtasıyla etkin maddesi ile birlikte partiküler halde alınabileceği ve gastrointestinal (GI) sistemde doğrudan eliminasyonunun önlenebileceği düşünülmüştür. Bu amaçla hazırlanan niozom formülasyonlarına GI sistemdeki mukoadhezyonlarını sağlayabilecek bir biyoadhezif polimer olan Carbopol 974P ve 971P (alil pentaeritrol ile çapraz bağlı akrilik asit polimeri) ile kaplama yapılarak formülasyonun bağırsaktan geçiş süresinin ve etkin maddenin absorbe olduğu bölgedeki kalış süresinin uzayacağı düşünülmüştür. Carbopol polimerlerinin bağırsak yapısındaki sıkı bağlantı yerlerini (tight junction) açarak bağırsak epitelyuminden maddelerin geçişini artırdığı bilinmektedir. Niozomlara kaplama işleminin uygulanmasının bir diğer amacı da bu özellikten faydalanmaktır (Li ve ark., 2005). Bu amaçla PCT’nin niozom formülasyonları hazırlanılarak karakterize edilmiştir ve in vivo etkinlikleri incelenmiştir. Hazırlanan formüllerin formülasyonundan kaynaklı pek çok olumsuz yan etkiye neden olan piyasa preparatlarına alternatif olarak intravenöz yolla kullanıp kullanılamayacağı da yine in vivo çalışmalarda incelenmiştir.
1.1. Veziküler sistemler
İdeal bir sistem etkin maddeyi etki bölgesine taşıyabilmeli ve tedavi süresi boyunca uygun şekilde salabilmelidir. Bu amaca ulaşabilmek ve istenen biyodağılımı sağlayabilmek için etkin maddelerin taşıyıcı sistemlere yüklenmesi, etkin maddenin moleküler yapısında değişiklikler yapılması veya vücuda etkin maddenin verilişinin optimize edilmesi üzerinde yoğunlaşılmıştır. Araştırmacılar geleneksel dozaj formlarıyla tedavide karşılaşılan sıkıntıların aşılması, ilaç etkinliklerinin artırılarak yan etkilerin azaltılması ve hasta uyuncunun yükseltilmesi amacıyla çeşitli ilaç taşıyıcı sistemler üzerinde çalışmaktadır. Bu alanda özellikle veziküler sistemler ilgi çekmektedir (Azeem ve ark., 2009).
Veziküler sistemlerin avantajları şu şekilde sıralanabilir:
1) Hem hidrofilik hem de lipofilik etkin maddeler veziküler sistemlere yüklenebilir.
2) Sürekli etkin madde çıkışı sağlanabilir.
3) Çözünürlüğü düşük maddelerin biyoyararlanımı artırılabilir.
4) Hızla metabolize olan etkin maddelerin eliminasyonunu geciktirir.
5) Etkin maddelerin düşük çözünürlük problemlerini ortadan kaldırır.
6) Etkin madde stabilitesini artırır.
7) Etkin maddelerin hızlı bir şekilde degrade olmasını engeller.
1.2. Lipozomların tanımı ve genel özellikleri
Lipozomlar bir veya daha fazla, sulu kompartıman içeren içiçe lipit tabakalarının oluşturduğu kürelerden oluşmuş basit mikroskobik veziküllerdir. Enkapsüle ettikleri etkin maddeyi korumaları, hedeflendirilecek etkin maddeyi kontrollü olarak salabilmeleri ve endositoz ile hücresel alıma uğramaları lipozomları avantajlı kılmıştır (Jesorka ve Orwar, 2008).
Bugün birkaç lipozom ticari preparatı bulunmakla birlikte lipozomların hidroliz veya oksidasyonla bozunması, önemli bir stabilite problemi oluşturmaktadır.
Lipozom yapısında bulunan fosfolipitlerin pahalı oluşu ve değişken saflıklarda oluşu da bir diğer sınırlayıcı faktördür. Lipozomlar parenteral olarak uygulanabilmektedir ancak oral uygulamaları safra tuzları ve fosfolipazlara olan dayanıksızlıklarından dolayı mümkün değildir. Bu gibi sebeplerden dolayı lipozomlara alternatif olarak niozomların kullanımı gündeme gelmiştir (Junyapresert ve ark., 2008).
1.3. Niozomların tanımı ve genel özellikleri
Lipozomların analogları olan niozomlar (non-ionic surfactant based vesicles- noniyonik yüzey etkin madde vezikülleri) noniyonik amfifillerin (sürfaktanlar) sulu ortamda meydana getirdiği kapalı çift tabakalı yapılardır (Uchegbu ve Vyas, 1998) (Şekil 1.3).
Şekil 1.3. Niozomun şematik gösterimi.
Niozomların in vivo davranışları lipozomlara benzemektedir. Lipozomlara göre daha stabildirler (Mukherjee ve ark., 2007; Cortesi ve ark., 2007), işlem görürken inert bir atmosferde çalışmak gerekmez ve lipozomlarda görülen değişken fosfolipit saflığına ve yüksek maliyete bağlı dezavantajlar niozomlar ile ortadan kalkar.
Membrandan süzülerek, otoklavlama ve gama radyasyon ile sterilize edilebilirler.
Niozomlarda kapalı çift tabakaların oluşma işlemi nadiren spontane olarak gelişir ve genellikle sisteme fiziksel ajitasyon veya ısı uygulanması gerekmektedir.
Sonuçta oluşan yapıda molekülün hidrofobik kısımları sulu çözücüden korunur ve hidrofilik uçlar ise sulu ortamla temas halindedir.
Niozomlar ilk olarak 1970’li yılların başlarında Strathclyde Üniversitesinde L’Oreal firması için Guy Vanlerberghe ve ark.’nın sentezlediği noniyonik sürfaktanların farmasötik amaçla kullanım potansiyellerinin araştırılması ile ortaya çıkmıştır (Uchegbu, 2000, s.:115). Kozmetik amaçlı yapılan bu çalışmalardan hemen sonra niozomların ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanımı gündeme gelmiştir. İlk olarak niozomlara yüklenen etkin madde Azmin ve ark.’nın (1985) yapmış olduğu çalışma ile metotreksat olmuştur. İleriki yıllarda layişmanyoz tedavisi amacıyla sodyum stiboglukonat yüklü niozomlar hazırlanarak etkinlikleri incelemiştir (Hunter ve ark., 1988; Baillie ve ark., 1986).
Niozomların esas kimliğini ve özelliklerini belirleyen faktörler Şekil 1.4’de verilmiştir. Tüm bu değişkenlerin niozom taşıyıcı sistemlerin hazırlanışı sırasında dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi gerekmektedir (Uchegbu ve Vyas, 1998; Verma ve ark., 2010).
Ana yüzey etkin maddenin
seçimi Hidratasyon
sıcaklığı
Etkin maddenin özellikleri
Kinetik enerjinin absorbsiyonu
Partikül büyüklüğü
küçültme teknikleri
Membran bileşenlerinin
özellikleri Niozomun
fiziksel özellikleri
Ana yüzey etkin maddenin
seçimi Hidratasyon
sıcaklığı
Etkin maddenin özellikleri
Kinetik enerjinin absorbsiyonu
Partikül büyüklüğü
küçültme teknikleri
Membran bileşenlerinin
özellikleri Niozomun
fiziksel özellikleri
Şekil 1.4. Niozomların kimliğini ve özelliklerini belirleyen faktörler (Uchegbu ve Vyas, 1998).
İlaç taşıyıcı sistem olarak niozomların seçim nedenleri ve avantajları aşağıda verilmiştir (Biju ve ark., 2006):
• Stabiliteleri lipozomlardan daha fazladır.
• İçerdikleri etkin maddelerin stabilitesini artırırlar.
• Hidrofilik ve hidrofobik üniteler içerdiğinden farklı çözünürlüklerdeki etkin maddelerle yüklenebilirler ve çözünürlüğü düşük etkin maddelerin çözünürlüklerini artırabilirler.
• Esnek yapı karakterleri vardır (bileşim, akışkanlık, büyüklük, v.b.).
• İstenilen amaca yönelik tasarlanabilirler.
• Yüzeylerine hidrofilik üniteler (polietilen glikoller -PEG-, konkanavalin A, polisakkaritler) bağlanarak uzun süre sirküle etmeleri sağlanabilir.
• Yapılarına giren noniyonik yüzey etkin maddeler çoğunlukla biyolojik olarak parçalanabilen, geçimli olan ve immünolojik reaksiyon göstermeyen maddelerdir.
• Etkin maddelerin kan dolaşımından atılımını geciktirir, biyolojik ortamdan korur ve hedef hücreye bağlanarak etkinliği artırır.
• Niozomlar enkapsüle ettikleri etkin maddeleri UV ışınlarının etkisinden koruyarak stabilitesini artırırlar (Rogerson ve ark., 1987).
• İn vivo koşullarda etkin maddenin uzatılmış salımını sağlayabilirler (Balasubramaniam ve ark., 2002).
Niozomlar tek tabakalı veya çok tabakalı olarak hazırlanabilirler. Genellikle stabil bir niozom formülü hazırlayabilmek adına formülasyona çeşitli yardımcı maddeler ilave edilmektedir. Kullanılan yardımcı maddeler ve sürfaktanların oranları değiştirilerek farklı permeabiliteye ve stabiliteye sahip yapılar elde edilebilir.
Uchegbu ve ark. yapmış oldukları bir çalışmada hekzadesil digliserol (C18G2)- kolesterol-Solulan C24’ü farklı oranlarda kullanarak farklı şekillere sahip niozom formülleri oluşturmuştur (Uchegbu ve ark., 1996b) (Şekil 1.5).
Vezikül bileşimi, sıcaklık gibi faktörler değiştirilerek küresel, heliks, tübüler ve polihedral şekillerde niozom yapıları elde edilebilmektedir (Khosravi-Darani ve ark., 2007). Niozomlar mekanik stres uygulandığında şekil değişikliklerine uğramaktadırlar (Nasseri ve Florence, 2003).
Şekil 1.5. Uchegbu ve ark.’nın yapmış oldukları çalışmada elde ettikleri hekzadesil digliserol (C18G2)-kolesterol-Solulan C24’e ait üçlü faz diyagramı. Toplam sürfaktan:lipit miktarı=60mM. 1. Bölge: çok düzlemli (polihedral) niozomlar (5 µm), 2. Bölge: küresel,spiral ve boru biçimindeki tübüler niozomlar (2-10 µm), 3. Bölge: Diskomlar (12-60 µm), büyük niozomlar (12-40 µm), küresel, spiral ve tübüler niozomlar (2-10 µm), 4. Bölge: Diskomlar ve muhtemelen karışık miseller, 5. Bölge: kolesterol kristalleri, 6. Bölge: Küresel niozomlar (2-10 µm), 7. Bölge: Muhtemelen karışık misellerden oluşan berrak çözelti, 8.Bölge:Sıcaklığın artırılması ile oluşan karışık miseller (Uchegbu ve ark., 1996b).
1.3.1. Niozom Hazırlama Yöntemleri
Niozomlar oluşturulurken sisteme enerji girmesi gerekmektedir. Niozom hazırlama yöntemlerinde temel prensip sürfaktan/lipit karışımının yüksek ısıda hidrate edilmesi ve daha sonra opsiyonel olarak veziküllerin boyutlarının kolloidal dispersiyon elde etmek amacıyla küçültülmesidir.
1) Film hidratasyon yöntemi
Sürfaktan/kolesterol karışımı kloroform, metanol veya dietil eter gibi bir organik solvan ile yuvarlak tabanlı balonda çözülür ve organik solvan rotavaporda vakum uygulanarak uçurulur. Kuru sürfaktan filmi 50-60C’de sulu faz ile karıştırılır. Bu yöntem elle çalkalama yöntemi olarak da bilinmektedir. Çok tabakalı veziküllerin (MLV) hazırlanmasında kullanılmaktadır. Hazırlanan veziküllerin çapı büyük olup suda çözünen etkin maddeleri yükleme kapasiteleri düşüktür (Pardakhty ve ark., 2007; Agarwal ve ark., 2001; Kaur ve ark., 2007).
2) Eter enjeksiyon yöntemi
Sürfaktan/ kolesterol karışımı dietil eterde çözülür ve 60C’de sulu faza iğne yardımı ile yavaşça enjekte edilir. Eter buharlaşırken büyük MLV’ler oluşmaktadır (Gopinath ve ark., 2001). Enjeksiyon ve karıştırma hızını değiştirerek farklı büyüklük ve homojenliğe sahip niozomlar elde edilebilir (Aggarwal ve ark., 2004). Bu metotta eter yerine petrol eteri, etilmetil eter veya diklorometan kullanılabilir veya metanol ile kombine bir şekilde kullanılabilir (Devaraj ve ark., 2002). Bu yöntem ile küçük ve tekdüze, yüksek yükleme etkinliğine sahip veziküller elde edilebilir. Bu yöntemin dezavantajı eterin genellikle tam olarak ortamdan uzaklaştırılamamasıdır. Bunun neticesinde proteinler gibi vezikül yapısına yüklenen maddelerin yapısında bozulmalar meydana gelebilir.
3) Ters faz buharlaştırma yöntemi
Sürfaktan/kolesterol karışımı kloroform ile çözülür. Etkin maddenin çözüldüğü sulu faz bu karışıma ilave edilir ve iki faz 4-5C’de sonike edildikten sonra kloroform düşük basınç altında uzaklaştırılır. Karışım bir jel meydana getirir ve bu jel daha sonra hidrate edilerek veziküller oluşturulur (Aggarwal ve ark., 2004). Bu yöntem ile etkin maddelerin büyük MLV’lere yüklenmesi sağlanabilir. Bu yöntemin bir dezavantajı makromoleküllerin denatürasyonuna sebep olmasıdır.
4) Uzaktan yükleme (Transmembran pH farkı yöntemi)
Bu yöntemde niozomlar, vezikülün membranında amonyum sülfat varlığı veya pH farkı gibi vezikül içinde tutulmayı sağlayan bir faktörden faydalanılarak hazırlanır (Parthasarathi ve ark., 1994). Amonyum sülfat kullanılarak amin yapısındaki etkin maddelerin niozomlar içine yüklenebilmesi sağlanmaktadır. Doksorubisin bu şekilde niozomlara yüklenmiştir (Uchegbu ve ark., 1996a). Amonyum sülfat yüklü niozomlar kuru sürfaktan/lipit dispersiyonunun amonyum sülfat çözeltisi ile sonike edilmesi veya sürfaktan/lipit filmin amonyum sülfat çözeltisi ile hidrate edilmesiyle elde edilir. Yüklenemeyen amonyum sülfat uzaklaştırıldıktan sonra doksorubisin ilave edilerek sıcaklık 60C’ye getirilir. Doksorubisin molekülleri çifte tabakayı geçer ve etkin maddenin sülfat tuzları oluşarak vezikül içerisinde hapsolurlar. Bu yöntem ile yüksek yükleme etkinlikleri elde edilebilir ve düşük/yüksek molekül ağırlığına sahip etkin maddeler için uygun bir yöntemdir.
Amonyum sülfat kullanımının yanı sıra pH farkı kullanılarak da veziküller içine etkin maddenin hapsolması sağlanabilir. Uchegbu ve ark. (1995), bu amaçla pH’sı 4 olan tris tamponu ile hidrate ettikleri sürfaktan/lipit filmi üzerine doksorubisin çözeltisi ilave ederek pH’yı 7’ye çıkarmışlardır. Bu pH’da doksorubisinin iyonlaşması baskılanarak kolayca membrandan geçmesi sağlanmıştır. Vezikül içerisinde ise protonlanan etkin madde buraya hapsolmuştur.
Benzer yöntemi kullanan Mayer ve ark. (1985), sürfaktan/kolesterol karışımını organik solvanda çözdükten sonra organik solvanı düşük basınç altında uçurarak bir film elde etmişlerdir. Bu filmi, vorteks işlemi uygulayarak sitrik asit ile hidrate etmişler ve vezikülleri hazırlamışlardır. Elde edilen MLV’ler arka arkaya dondurularak çözülmüştür. Daha sonra sulu faz ilave edilerek vorteks uygulanmıştır.
Disodyum hidrojen fosfat ilavesi ile pH 7,0-7,2’ye yükseltilmiştir. Elde edilen süspansiyon 10 dakikada 60C’ye getirilerek niozomlar oluşturulmuştur.
5) Sonikasyon
Cam vial içerisindeki sürfaktan-kolesterol çözeltisi üzerine sulu faz eklenir. Belli bir süre boyunca karışım prob sonikatör ile karıştırılır. Elde edilen veziküller küçük ve tek tabakalıdır (SUV). Eter enjeksiyon yöntemine göre yükleme etkinliği daha düşüktür.
6) Mikroakışkanlaştırma
Mikroakışkanlaştırma son zamanlarda ortaya çıkan ve belirli partikül büyüklüğü dağılımına sahip vezikülleri hazırlamaya yönelik olan bir tekniktir. Yöntemin temelinde 2 akışkanın çok yüksek hızlarda birbiriyle temas ettirilmesi yatmaktadır (Lo ve ark., 2010).
7) Kurutulmuş veziküllerden niozom oluşturulması
Bu yöntemde sonike edilmiş boş tek tabakalı veziküller dondurularak kurutulduktan sonra etkin maddenin sulu çözeltisi ile hidrate edilirler. Bunun neticesinde katı lipitlerin küçük bölünmüş bir formda disperse olması sağlanmaktadır. Sulu çözelti ilavesi ile rehidrate olabilen, eriyen ve vezikül oluşturmak üzere tekrar kapanabilen organize bir membran yapısı oluşturulmaktadır. Suda çözünen etkin maddelerin yüksek miktarlarda enkapsüle olabilmesini sağlayan bir yöntemdir. Liyofilizasyon niozomların stabilitesini artırmaktadır. Liyofilize formülasyonlara su ilavesi neticesi
elde edilen veziküllerin tekrar disperse edilmesi daha kolay olmaktadır. (Mukherjee ve ark., 2007; Mura ve ark., 2007; Uchegbu ve Duncan, 1997).
8) Kabarcık yöntemi
Organik çözücü ve yüksek kayma güçleri kullanılmadan lipozom ve niozomları hazırlamak amacıyla geliştirilmiş bir tekniktir. Talsma ve ark. (1994), inert gaz kabarcıklarını hidrate olmamış (fosfo)lipitler veya noniyonik sürfaktan/kolesterol karışımları ile muamele ederek stabil lipozom/niozom dispersiyonları oluşturmuşlardır. Oluşan dispersiyonlarda partikül boyutu 0,2-0,5µm arasında olmuştur. Deney düzeneğinde 3 boyunlu yuvarlak tabanlı balon sıcaklığı kontrol edilebilen su banyosuna oturtulmaktadır. Balonun ortasındaki boynuna suyla soğutulan akış kolonu yerleştirilmiştir. Bir diğer boyuna ise termometre yerleştirilerek sıcaklık kontrolü sağlanmaktadır. 3. girişten ise azot gazı verilmektedir. Bu hazırlama tekniği ile lipozomlar/niozomlar tek basamakta ve sadece bir taşıyıcı kap kullanarak üretilebilmektedir.
9) Niozomların proniozomlardan hazırlanması
Bir başka niozom hazırlama yöntemi ise sorbitol gibi suda çözünebilen bir taşıyıcının sürfaktan ile kaplanmasıdır. Kaplama neticesinde kuru toz formunda bir formülasyon elde edilir. Herbir suda çözünebilen taşıyıcı partikülünün etrafı kuru sürfaktan filmi ile kaplıdır. Bu formülasyonlar proniozomlar olarak adlandırılmaktadır (Alsarra ve ark., 2005). Proniozomlara ortalama faz geçiş sıcaklığının üzerinde sulu fazın ilave edilmesi ve sistemin karıştırılmasıyla niozomlar elde edilir (Şekil 1.6).
Taşıyıcı Sürfaktan
Proniozomlar Su Niozomlar Taşıyıcı Sürfaktan
Proniozomlar Su Niozomlar
Şekil 1.6. Proniozomların hazırlanması ve proniozomlardan niozom eldesinin şematik gösterimi.
10) Handjani-Vila ve ark.’nın yöntemi
Katı sürfaktan ve lipit karışımı üzerine ısıtılmış sulu faz ilave edilir ve homojen lamellar film oluşturulana kadar çalkalanır. Karışım kontrollü sıcaklıkta ultrasantrifüjleme ve çalkalama ile homojenize edilir (Özer, 2002, s.:126)
1.3.1.1. Niozomlara Yüklenemeyen Etkin Maddeyi Uzaklaştırma Yöntemleri
Sürfaktan:lipit filmlerinin hidratasyonu neticesinde tüm etkin maddenin enkapsüle edilmesi genellikle gerçekleşemez. Üretimin optimizasyonunun sağlanabilmesi için yüklenemeyen etkin maddenin uzaklaştırılması gerekmektedir. Etkin maddenin yarısının enkapsüle olduğu ve yarısının dışarıda kaldığı sistemlerin kullanılması durumunda bifazik biyodağılım sağlanabilir. Bu durumda tedaviyi başlatıcı başlangıç dozu hızla çıkar ve daha sonra sürdürme dozu salınır. Niozomlara yüklenmeyen etkin maddeyi uzaklaştırmak amacıyla kullanılan teknikler aşağıda verilmiştir:
1) Diyaliz: Sulu niozomal dispersiyon diyaliz membrana koyularak fosfat tamponu, serum fizyolojik veya glikoz çözeltisi gibi ortamlarda diyaliz edilir.
Suda çözünen etkin maddelerin uzaklaştırılması için uygun bir yöntemdir (Muzzalupo ve ark., 2008; Hao ve ark., 2002; Tavano ve ark.,2010;
Ruckmani ve ark., 2000).
2) Jel Filtrasyon: Sephadex kolonlar kullanılarak niozomal dispersiyonun jel filtrasyonu yapılır. Hareketli faz olarak fosfat tamponu veya serum fizyolojik kolon içerisinden geçirilerek serbest etkin madde ve niozomlar ayrıştırılır.
(Rentel ve ark., 1999).
3) Santrifüj: Niozomal süspansiyon 7000 g altında bir hızda santrifüj edilir ve çökelek alınır. Yıkanan çökelek tekrar süspande edilerek yüklenmemiş etkin maddeden arındırılmış niozomal süspansiyon hazırlanır.
4) Ultrasantrifüj: Santrifüj ile çöktürülemeyen 1 µm’nin altında partikül büyüklüğüne sahip niozomların çöktürülmesi amacıyla kullanılır. Yaklaşık 150 000 g’de 90 dakika santrifüj işlemi uygulanarak elde edilen niozom çökeleği yeniden süspande edilerek kullanılır (Arunothayanun ve ark., 2000;
Uchegbu ve Duncan, 1997).
Kullanılan yöntemlerin avantaj ve dezavantajları Çizelge 1.1’de verilmiştir.
Endüstriyel boyut düşünüldüğünde yükleme etkinliğini olabildiğince artırarak yüklenmeyen etkin maddeyi ayırma basamağı tamamen üretimden çıkartılabilir veya daha önce de değinildiği gibi yüklenemeyen maddenin tedavideki ilk dozu sağlamasına yönelik formülasyonlar geliştirilebilir. Ancak tutulan etkin madde miktarının sabitliği belirlenmelidir.
Çizelge 1.1. Niozomlara yüklenmeyen etkin maddeyi uzaklaştırmak amacıyla kullanılan tekniklerin karşılaştırması.
Ayrıştırma Yöntemi
Avantajları Dezavantajları Diyaliz 10 µm’nin altındaki
veziküller için uygundur.
Yüksek viskozluğa sahip sistemler için uygundur.
Ucuzdur.
Çok uzun sürede işlem
tamamlanmaktadır (5-24 saat).
Diyaliz edilen süspansiyon büyük hacimde olmalıdır. (Özel bir şekilde atılması gereken maddeler için uygun
olmayabilir.)
Niozom dispersiyonunun seyrelmesine neden olur.
Tekrar ultrafiltrasyon ile formülün konsantre hale getirilmesi gerekmektedir.
Santrifüj ( 7000g)
Hızlı bir yöntemdir (30 dakika).
Ucuz bir yöntemdir.
Niozom süspansiyonun konsantre hale
getirilmesini sağlar.
Mikron altındaki niozomların çökmesini sağlayamaz.
Kırılgan sistemlerin
bozulmasına neden olabilir.
Ultrasantrifüj ( 150 000g)
Mikron üstü ve altındaki niozomların çökmesini sağlar.
Niozom süspansiyonun konsantre hale
getirilmesini sağlar.
Ultrasantrifüj cihazı pahalıdır.
Santrifüj süresi uzundur (1-1,5 saat).
Kırılgan sistemlerin
bozulmasına neden olabilir.
Agregat oluşmasına neden olabilir.
1.3.1.2. Niozomlarda Partikül Büyüklüğü Küçültme Yöntemleri
Niozomlar ilk hazırlandıklarında genellikle mikron boyutlarında olmaktadır.
Veziküllerin biyodağılımında partikül boyutu önemli rol oynamaktadır. Örneğin 200 nm altındaki fosfolipit vezikülleri karaciğerde tutuluma uğrarken dalakta tutulmazlar. Partikül boyutunun önemi nedeniyle niozomların hazırlanma prosedürlerine partikül boyutunu küçültme aşaması da ilave edilmektedir.
Niozomların partikül boyutlarını küçültmek için birkaç yöntem bulunmaktadır:
1) Prob sonikasyon: 5-florourasil yüklü Span 80 niozomlarının partikül büyüklükleri prob sonikasyon ile 500 nm’den 200 nm’ye indirilmiştir.
(Paolino, 2008)
2) Filtrasyon: Stafford ve ark. (1988), Nucleopor filtrelerden geçirdikleri sodyum stiboglukonat yüklü C18G3 niozomlarının partikül büyüklüklerini 140 nm’ye düşürmüşlerdir.
3) Sonikasyon ve filtrasyonun kombine kullanımı: Uchegbu ve ark. (1995), doksorubisin yüklü Span 60 niozomlarını 220 nm Milipore filtreden süzerek ve sonikasyona tabi tutarak 200 nm boyutlarında niozomlar hazırlamışlardır.
4) Mikroakışkanlaştırma: Mikroakışkanlaştırma yöntemiyle hazırlanan niozomların partikül büyüklükleri 10-100 nm aralığındadır. Doğrudan niozom hazırlama yöntemi olarak mikroakışkanlaştırma seçilirse küçük boyutta ve monodispers dağılıma sahip niozomlar hazırlanabilir (Lo ve ark., 2010).
1.3.2. Niozom Oluşumuna Etki Eden Faktörler
a) Niozom Oluşturucu Sürfaktanların Yapısı ve Özellikleri
Teorik olarak bakıldığında niozom oluşabilmesi için belli bir amfifil madde ve sulu çözücü ortam gerekmektedir. Bazı durumlarda formüllere kolesterol eklenebilir veya
veziküllerin itici sterik veya elektrostatik etkilerle agrege olmasını önleyici moleküller yapıya katılabilir. Sterik stabilizasyona örnek olarak doksorubisin yüklü Span 60 niozomlarının yapısına Solulan C24 (kolesteril poli-24-oksietilen eter) ilave edilmesi verilebilir (Shi ve ark., 2006). Elektrostatik stabilizasyon ise yapıya disetil fosfat veya stearil amin ilavesiyle yapılabilir (Junyapresert ve ark., 2008).
Niozom oluşturan amfifillerin hidrofilik baş grup (Çizelge 1.2) ve hidrofobik kuyruk yapılarına sahip olması gerekmektedir. Hidrofobik kısım bir veya iki alkil veya perfloroalkil grubu veya özel durumlarda tek bir steroidal grubundan oluşabilir (Çizelge 1.3). Alkil zincir uzunluğu 12-18 karbon arasındadır. Moleküller 1-3 alkil zinciri içerebilmektedir. Vezikül oluşturan perfloroalkil sürfaktanlarında zincir uzunluğu 10 karbona kadar düşebilir. Steroidal, C14 alkil veya C16 alkil grubu içeren crown eter amfifillerinin de vezikül oluşturabildikleri gösterilmiştir. Vezikül oluşturucu sürfaktanların yapısına pek çok hidrofilik baş grubu girebileceği gibi hidrofobik gruplar sınırlı sayıdadır. Sürfaktanların iki ayrı kısmı eter, amid veya ester bağlarıyla bağlanabilir (Manosroi ve ark., 2003) (Çizelge 1.2).
Çizelge 1.2. Vezikül oluşturucu sürfaktanlarda bulunan hidrofilik baş grupları.
Hidrofilik baş gruplar Formül Gliserol
Çizelge 1.2. Devam.
Etilenoksit
Crown eter
Polihidroksi
Şeker baş grupları ve aminoasitler (galaktoz türevleri)
