Analitik Yöntemlerin Validasyonu

Farklı ortamlardaki etkin maddenin miktar tayini için analitik validasyon yapılmıştır.

Analitik yöntem validasyon parametreleri olarak doğrusallık ve aralığı, doğruluk ve geri elde, kesinlik (tekrarlanabilirlik ve ara kesinlik), teşhis sınırları (LOD) ve tayin sınırları (LOQ) ile özgünlük incelenmiştir.

Doğrusallık ve Aralığı

Bir analitik işlemin doğrusallığı (belli bir aralıkta), o işlemin bir numunedeki analit konsantrasyonu ile doğru orantılı test sonuçları verebilme özelliği olarak tanımlanmaktadır. Bir analitik işlemin aralığı ise uygun kesinlik, doğruluk ve doğrusallığı sağladığı gösterilen analitik işlem için numunedeki analitin en yüksek ve en düşük konsantrasyonları (miktarları) arasındaki aralıktır. Aralığa bu uç noktalardaki konsantrasyonlar da dahildir.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonlarda yöntemin doğrusallık ve aralığını bulmak amacıyla etkin maddenin asetonitril içinde stok çözeltileri hazırlanmıştır. Bu stok çözeltilerden metanol, PBS-Tw ve SGF-PBS-Tw ile uygun seyreltmeler yapılarak sırasıyla 0,25-20 µg/ml, 0,05-6 µg/ml ve 0,05-1 µg/ml konsantrasyon aralığında farklı konsantrasyonlarda çözeltiler elde edilerek HPLC analizleri yapılmıştır. Bilinen konsantrasyonlara (x) karşı elde edilen alan (y) değerleri grafiğe geçirilerek GraphPad InStat3 programı ile kalibrasyon doğrusu hazırlanmıştır. Elde edilen doğrunun güven sınırları (% 95) belirlenmiştir.

İn vivo deneylerde dokulardaki ve kandaki PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonda yöntemin doğrusallık ve aralığını bulmak amacıyla etkin maddenin asetonitril içinde stok çözeltileri hazırlanmıştır. Bu stok çözeltilerden asetonitril ile uygun seyreltmeler yapılarak 0,16-2,4 µg/ml konsantrasyon aralığında farklı konsantrasyonlarda çözeltiler elde edilmiştir. 100 µl plazma üzerine bu çözeltilerden 25 µl, 10 µl DCT (15 µg/ml) ve 50 µl metanol eklenerek Bölüm 2.2.7’de anlatıldığı şekilde PCT ekstraksiyonu yapılarak HPLC için numuneler hazırlanmıştır. Bilinen PCT konsantrasyonlarına (x) karşı elde edilen PCT/DCT alan oranı (y) değerleri grafiğe geçirilerek GraphPad InStat3 programı ile kalibrasyon doğrusu hazırlanmıştır. Elde edilen doğrunun güven sınırları (% 95) belirlenmiştir.

Doğruluk ve Geri Elde

Bir analitik işlemin doğruluğu gerçek değerin veya kabul edilmiş referans değerin deneysel olarak elde edilen sonuçlara yakınlığı olarak tanımlanmaktadır.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonlarda doğruluk ve geri elde değerlerini tayin etmek amacıyla yüksek, orta ve düşük konsantrasyon olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda PCT çözeltileri hazırlanmıştır. Bu konsantrasyon değerleri metanol kalibrasyonu için 1 μg/ml, 10 μg/ml ve 17,5 μg/ml; PBS-Tw kalibrasyonu için 0,25 μg/ml, 1 μg/ml ve 4 μg/ml;

SGF-Tw kalibrasyonu için 0,2 μg/ml, 0,6 μg/ml ve 1 μg/ml olarak belirlenmiştir.

Hazırlanan her bir çözelti arka arkaya 6 kere HPLC’de analiz edilmiştir. Okunan alan değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % geri elde değerleri ve % bağıl standart sapma (% BSS) değerleri bulunmuştur.

İn vivo deneylerde dokulardaki ve kandaki PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonda doğruluk ve geri eldeyi tayin etmek amacıyla yüksek, orta ve düşük konsantrasyon olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda (0,4 µg/ml, 0,8 µg/ml, 2 µg/ml) PCT çözeltileri hazırlanmıştır. 100 µl plazma üzerine bu çözeltilerden 25 µl, 10 µl DCT (15 µg/ml) ve 50 µl metanol eklenerek Bölüm 2.2.7’de anlatıldığı şekilde PCT ekstraksiyonu yapılarak HPLC için numuneler hazırlanmıştır. Hazırlanan her bir numune arka arkaya 6 kere HPLC’de analiz edilmiştir. Okunan PCT/DCT alan oranı değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % geri elde değerleri ve

% bağıl standart sapma (% BSS) değerleri bulunmuştur.

Kesinlik

Bir analitik işlemin kesinliği belirlenen şartlar altında aynı homojen numunenin çok sayıdaki analizden elde edilen ölçümlerin yakınlığını (dağılımın derecesi) tanımlamaktadır. Kesinlik 3 farklı seviyede incelenmektedir: tekrarlanabilirlik, ara kesinlik ve tekrar elde edilebilirlik. Kesinlik homojen ve güvenilir numunelerde incelenmelidir. Analitik işlemin kesinliği ölçümlerin standart sapması ve % bağıl standart sapması (% BSS) bulunarak tanımlanmaktadır.

Çalışmamızda PCT miktar tayini amacıyla kullanılan analitik yöntemlerin kesinliğini tayin etmek amacıyla yöntemlerin tekrarlanabilirliği ve tekrar elde edilebilirliği test edilmiştir.

Tekrarlanabilirlik

Tekrarlanabilirlik aynı koşullar altında ve kısa bir zaman aralığında yöntemin kesinliğini göstermektedir.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonlarda tekrarlanabilirlik tayini amacıyla aynı analist tarafından yüksek, orta ve düşük konsantrasyon olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda PCT çözeltileri hazırlanmıştır. Bu konsantrasyon değerleri metanol kalibrasyonu için 1 μg/ml, 10 μg/ml ve 17,5 μg/ml; PBS-Tw kalibrasyonu için 0,25 μg/ml, 1 μg/ml ve 4 μg/ml;

SGF-Tw kalibrasyonu için 0,2 μg/ml, 0,6 μg/ml ve 1 μg/ml olarak belirlenmiştir.

Hazırlanan her bir çözelti arka arkaya 6 kere HPLC’de analiz edilmiştir. Okunan alan değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % BSS değerleri bulunmuştur.

İn vivo deneylerde dokulardaki ve kandaki PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonda tekrarlanabilirlik tayini amacıyla yüksek, orta ve düşük

konsantrasyon olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda (0,4 µg/ml, 0,8 µg/ml, 2 µg/ml) PCT çözeltileri hazırlanmıştır. 100 µl plazma üzerine bu çözeltilerden 25 µl, 10 µl DCT (15 µg/ml) ve 50 µl metanol eklenerek Bölüm 2.2.7’de anlatıldığı şekilde PCT ekstraksiyonu yapılarak HPLC için numuneler hazırlanmıştır. Hazırlanan her bir numune arka arkaya 6 kere HPLC’de analiz edilmiştir. Okunan PCT/DCT alan oranı değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % bağıl standart sapma (% BSS) değerleri bulunmuştur.

Ara Kesinlik

Ara kesinlik farklı gün, farklı analist, farklı cihaz gibi laboratuvar içi değişiklikleri tanımlamaktadır.

Çalışmamızda farklı ortamlarda yapılan PCT miktar tayini yöntemlerinin her biri için ara kesinlik çalışması yapılmıştır. Ara kesinlik çalışmasında farklı günler ve farklı analistlerin yöntem kesinliğine etkisi incelenmiştir.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonlarda farklı günlerdeki ara kesinliğin tayini amacıyla aynı analist tarafından yüksek, orta ve düşük konsantrasyon olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda PCT çözeltileri hazırlanmıştır. Bu konsantrasyon değerleri metanol kalibrasyonu için1 μg/ml, 10 μg/ml ve 17,5 μg/ml; PBS-Tw kalibrasyonu için 0,25 μg/ml, 1 μg/ml ve 4 μg/ml; SGF-Tw kalibrasyonu için 0,2 μg/ml, 0,6 μg/ml ve 1 μg/ml olarak belirlenmiştir. Hazırlanan her bir çözelti arka arkaya 6 kere HPLC’de analiz edilmiştir. Bu işlem 3 farklı günde tekrar edilmiştir. Okunan alan değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % BSS değerleri bulunmuştur.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonlarda farklı analistlere ait ara kesinliğin tayini amacıyla 2 farklı analist tarafından metanol kalibrasyonu için: 1 μg/ml, PBS-Tw kalibrasyonu için: 1 μg/ml

ve SGF-Tw kalibrasyonu için: 0,6 μg/ml konsantrasyonda PCT çözeltileri hazırlanmıştır. Hazırlanan her bir çözelti arka arkaya 6 kere aynı cihazlar kullanılarak HPLC’de analiz edilmiştir. Okunan alan değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % BSS değerleri bulunmuştur.

İn vivo deneylerde dokulardaki ve kandaki PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonda farklı günlerdeki ara kesinliğin tayini amacıyla aynı analist tarafından yüksek, orta ve düşük konsantrasyon olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda (0,4 µg/ml, 0,8 µg/ml, 2 µg/ml) PCT çözeltisi hazırlanmıştır. 100 µl plazma üzerine 25 µl PCT çözeltisi, 10 µl DCT (15 µg/ml) ve 50 µl metanol eklenerek Bölüm 2.2.7’de anlatıldığı şekilde PCT ekstraksiyonu yapılarak HPLC için numuneler hazırlanmıştır. Hazırlanan her bir numune arka arkaya 6 kere HPLC’de analiz edilmiştir. Bu işlem 3 farklı günde tekrar edilmiştir. Okunan PCT/DCT alan oranı değerleri kalibrasyon doğrusunda yerine konularak konsantrasyon değerleri hesaplanmış ve buradan % BSS değerleri bulunmuştur.

Farklı günlerdeki ara kesinliği göstermek amacıyla 3 farklı konsantrasyona ait ölçüm sonuçlarının ortalamaları arasında 1., 2. ve 3. günlerde anlamlı farklılıklar olup olmadığını göstermek amacıyla SPSS paket programı kullanılarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulanmıştır. Farklı analistlere ait ara kesinliği göstermek için ise 2 farklı analiste ait ölçüm sonuçlarının arasında anlamlı fark olup olmadığını göstermek amacıyla SPSS paket programı kullanılarak student-t testi uygulanmıştır.

Teşhis ve Tayin Sınırları

Bir analitik işlemin teşhis sınırı (Limit of Detection-LOD) bir numunede kesin bir değer olarak tayin etmeden sadece teşhis edilebilecek en düşük analit miktarıdır.

Tayin sınırı (Limit of Quantification-LOQ) ise bir numunede uygun kesinlik ve doğrulukla kantitatif olarak tayin edilebilecek en düşük analit miktarıdır.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonlarda teşhis sınırlarını (LOD) ve tayin sınırlarını (LOQ) tayin etmek amacıyla her bir ortam için hazırlanan üç paralel kalibrasyondaki en düşük okunan alanın bir üstündeki alanlardan standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Bulunan değerler 3,3 ile çarpılarak LOD, 10 ile çarpılarak LOQ değerleri bulunmuştur.

In vivo deneylerde dokulardaki ve kandaki PCT miktar tayininde kullanılmak üzere yapılan kalibrasyonda teşhis sınırlarını (LOD) ve tayin sınırlarını (LOQ) tayin etmek amacıyla yapılan üç paralel kalibrasyondan elde edilen kesişim değerlerinin standart sapmaları hesaplanarak kalibrasyon doğrusunun eğimine bölünmüştür.

Bulunan değer 3,3 ile çarpılarak LOD, 10 ile çarpılarak LOQ değerleri bulunmuştur.

Özgünlük

Özgünlük analiz esnasında numunede olması beklenen bileşikler varlığında da analiti kesin bir şekilde tayin edebilme özelliğidir. Bu bileşikler impüriteler, deterjanlar, matriks bileşenleri… v.b. yapılar olabilmektedir.

İn vitro deneylerde PCT miktar tayini yapılırken niozom formülasyonuna katılan yardımcı maddelerin PCT’nin HPLC analizinde elde edilen piki ile girişim yapıp yapmadığını gözlemek için etkin madde ve etkin madde – yardımcı madde karışımlarının ayrı ayrı çözeltileri hazırlanarak belirlenen koşullarda pikleri alınmıştır.

İn vivo deneylerde dokulardaki ve kandaki PCT miktar tayininde kullanılmak üzere analitik yöntem geliştirirken yöntemin özgünlüğünü belirlemek amacıyla plazma, dokular, ekstraksiyonda kullanılan yardımcı solvanlardan gelen pikler ile DCT ve PCT piklerinin girişim yapıp yapmadığı araştırılmıştır. Bu amaçla DCT ve/veya PCT içermeyen/içeren plazma ve doku ekstraktları hazırlanarak HPLC’de analiz edilmiştir.