Penisilinle Epilepsi Oluflturulan S›çanlarda Gyrus Dentatus Granüler Hücre Tabakas›ndaki Hacim De¤ifliklikleri
[*]Determination of Volume Changes in Dentate Gyrus Granulare Cell Layer in Penicillin-Induced Epileptic Rats
Ilgaz AKDO⁄AN, Esat ADIGÜZEL, P›nar AKYER Epilepsi 2003;9(2):67-72
Dergiye gelifl tarihi: 28 fiubat 2003 Düzeltme iste¤i: 1 May›s 2003 Yay›n için kabul tarihi: 3 Haziran 2003 Pamukkale Üniversitesi T›p Fakültesi Anatomi Anabilim Dal›.
*1. Ulusal Sinir Bilimleri Kongresi’nde poster olarak sunulmufltur (16-20 Mart 2002, Eskiflehir).
‹letiflim adresi: Dr. Ilgaz Akdo¤an. Pamukkale Üniversitesi T›p Fakültesi, Anatomi Anabilim Dal›, 20070 K›n›kl›, Denizli.
Tel: 0258 - 213 40 30 / 1388 Faks: 0258 - 213 28 74 e-posta: [email protected]
Amaç: Deneysel olarak penisilinle epilepsi olufltu- rulan s›çanlarda gyrus dentatus hacim de¤ifliklik- leri araflt›r›ld›.
Çal›flma Plan›: Çal›flmada 12 adet, 16-20 hafta- l›k Sprague-Dawley cinsi difli s›çan (220-350 gr) iki gruba ayr›ld›. Kontrol grubuna intrakortikal se- rum fizyolojik, di¤er gruba ayn› yolla penisilin-G (500 IU) verildi. Bir hafta sonra ç›kar›lan beyinler dondurmal› mikrotomda donduruldu ve 150 µm kal›nl›kta kesildi. Elde edilen histolojik kesitler he- matoksilen-eosin ile boyand›. Kesitlerdeki gyrus dentatus granüler hücre tabakas›n›n mikroskop görüntüsü monitöre aktar›ld› ve hacmi stereolojik bir yöntem olan Cavalieri prensibine göre hesap- land›.
Bulgular: Serum fizyolojik verilen s›çanlara göre, penisilinle epilepsi oluflturulan s›çanlar›n gyrus dentatus hacimleri daha büyük bulunmas›na ra¤- men, aradaki fark istatistiksel olarak anlaml› de¤il- di (Mann-Whitney U-testi, p>0.05).
Sonuç: Deneysel epileptik nöbetlerin beynin de-
¤iflik bölgelerindeki etkilerini araflt›rmada nöron say›s› ile birlikte hacim de¤iflikliklerinin de de¤er- lendirilmesi objektif sonuçlara ulaflmada katk›
sa¤layacakt›r.
Anahtar Sözcükler: Dentate gyrus/sitoloji; hastal›k mo- delleri, hayvan; elektroensefalografi; epilepsi/kimyasal yolla oluflturulan; hipokampus/fizyoloji/ilaç etkileri; mik- roskopi/yöntem; nöron/ilaç etkileri; penisilin G; s›çan.
Objectives: We investigated the changes in rat dentate gyrus volume in a penicillin-induced epilepsy model.
Study Design: The study included 12 adult female Sprague-Dawley rats (220-350 gr) of 16 to 20 weeks. The animals were assigned to receive either intracortical saline solution or penicillin G (500 IU). A week later, the brains were removed and frozen in a cryostat. All tissues were sec- tioned at 150 µm and stained with hematoxylen and eosin. The sections were visualized under light microscope and cell layer images of the den- tate gyrus granulare were transferred to a moni- tor. The volumes were quantified stereologically using the Cavalieri ’s principle.
Results: The mean dentate gyrus volume of peni- cillin administered rats was greater than that of the control rats. However, this increase was not statistically significant (Mann-Whitney U-test, p>0.05).
Conclusion: The effects of experimental epilep- tic seizure models on different areas of the brain may be more objectively evaluated both by the number of neurons and quantification of volume c h a n g e s .
Key Words: Dentate gyrus/cytology; disease models, ani- mal; electroencephalography; epilepsy/chemically induced;
hippocampus/physiology/drug effects; microscopy/meth- ods; neurons/drug effects; penicillin G; rats.
Gyrus dentatus, formatio hippocampalis’i oluflturan yap›lard a n d › r.[ 1 ] Formatio hippocam- palis’i oluflturan yap›lardan entorhinal korteks ile aff e rent, hipokampus CA3alt bölgesi ile eff e- rent ba lant›lar› vard › r.[ 1 ]Hipokampus ile anato- mik komflulu una karfl›l›k histolojik aç›dan farkl›l›k gösterir. Hipokampus esas olarak pira- midal nöro n l a rdan oluflurken, gyrus dentatusun as›l yap›s›n› granüler hücreler oluflturu r.[ 1 ]G y ru s d e n t a t us ve hipokampus histolojik olarak üç ta- bakadan oluflmaktad›r. Üç tabakal› yap›s›ndan dolay›, bu bölgelerin hipereksitabilite gösterd i i ve epileptik nöbetlerde kolayl›kla uyar›labildi i ileri sürülmüfltür.[ 2 ] Böylece, zay›f bir stimülas- yon bile epileptiform aktiviteye neden olmakta- d › r. Bu yüzden epilepside ve deneysel epilepsi modellerinde formatio hippocampalis ile ilgili çok say›da çal›flma vard › r.[ 3 , 4 ]
Günümüzde epilepsinin ve epileptik nöbet- lerin fizyopatolojisinin daha iyi anlafl›lmas› için deneysel epilepsi modelleri gelifltirilmifltir.[ 5 ] Çal›flmam›zda, deneysel epilepsi oluflturmak için kulland› ›m›z penisilin, epileptojenik bir odak oluflturmakta ve fokal bafllay›p yay›larak jeneralize tipe dönüflen epileptik nöbetler orta- ya ç›karmaktad›r.[6]
Daha önce yapt› ›m›z bir çal›flmada, penisi- lin ile deneysel epilepsi oluflturulan s›çanlarda gyrus dentatus nöron say›lar› hesaplanm›flt›.[7]
Ancak, penisilin epilepsi modelinin gyrus den- tatus granüler hücre tabakas› hacmini nas›l et- kiledi i bilinmiyordu. Bu çal›flmada, penisilin ile meydana getirilen deneysel epilepsi sonucu oluflan nöbetlerin gyrus dentatus granüler ta- baka hacmine olan etkisinin araflt›r›lmas› amaç- land›. Hacimler, objektif ve etkin bir stereolojik yöntem olan Cavalieri prensibine göre hesap- land›.[8,9]
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmada, Pamukklale Üniversitesi Deney Hayvanlar› Laboratuar›’ndan elde edilen 12 adet, 16-20 haftal›k, Sprague-Dawley cinsi difli s›çan kullan›ld›. Çal›flma düzene i ile ilgili ola- rak Etik Kurul onay›n›n al›nmas›n›n ard›ndan s›çanlar standart laboratuvar koflullar›nda (s›- cakl›k 22 °C, 12 saatlik ayd›nl›k-karanl›k siklu- su) beslendi ve hayvanlara yap›lan tüm ifllem- ler hijyenik kurallara uygun olarak, yar› steril flartlarda gerçeklefltirildi. S›çanlar rastgele ola- rak kontrol (n=6) ve penisilin (n=6) gruplar›na ayr›ld›. Hayvanlar, intraperitoneal uygulanan xylazine (10 mg/kg, Rhompun®, Bayer, Türki- ye) ve ketamin (90 mg/kg, Ketalar®, Parker Da- vis, Türkiye) ile uyutulduktan sonra, stereotak- si aletine yerlefltirildi. Kafa derisi vertikal ola- rak kesildikten sonra bregma noktas› bulundu.
Kontrol grubuna intrakortikal olarak, bregma- n›n sa ›ndan, 2 mm posterior, 2 mm lateral ve 2
fiEK‹L 1
S›çanda gyrus dentatus granüler tabakas›n›n ›fl›k mikroskop görüntüsü (H-E x 4).
GD: Gyrus dentatus; CA3-CA4: Hipokampus alt bölgeleri.
mm derine uyacak koordinatlarda 0.1 ml serum fizyolojik (%0.9 NaCl) ve penisilin grubuna ay- n› yolla ve ayn› koordinatlarda penisilin-G (500 IU, 0.1 ml) verildi. Her iki grubun elektriksel deflarjlar› EEG aleti ile kaydedildi. Bipolar EEG kay›tlar›, genel anestezi alt›nda, iki yüzeyel gü- müfl elektrodu kafa derisinde sa paryetal ve mid-oksipital bölgeye ve bir referans (toprak) elektrodu hayvan›n kuyru una konarak elde edildi (kay›t duyarl›l› ›=20 µV/mm; kay›t ka ›t h›z› 15 mm/sn.; TC=0.3 Hz, HF=70 Hz). Her iki grup için, yedi günlük bekleme süresi sonunda ç›kar›lan beyinler dondurmal› mikro t o m d a (Leica CM3050) -50°C’de donduruldu. Dondur- mal› mikrotom -15°C’ye ayarland› ve beyinler- den 150 µm kal›nl›kta yatay kesitler elde edildi.
Kesitler, hematoksilen-eosin ile boyand›.
Cavalieri prensibi ve hacim hesaplamalar›
Kesitler ›fl›k mikroskobuna (Nicon Eclipe E 600, N.A.=1.25) yerlefltirildi ve gyrus dentatus granüler hücre tabakas›n›n x 4 büyütmedeki mikroskop görüntüsü bir video kamera (Hitac- hi OSP Color Video Camera VK-C22OE) kulla- n›larak monitöre (Sony Trinitron Color Video Monitor PVM-14N1MDE) aktar›ld› (fiekil 1).
Her kesit için gyrus dentatus granüler tabakas›-
n›n monitör ekran›ndaki izdüflümü, uygun bü- yüklükteki parflomen ka ›d›na çizildi. Bu çi- zimler üzerine, noktalar aras› uzakl› › önceden belirlenen “noktal› say›m cetveli”[10,11] rastgele konularak gyrus dentatusun granüler tabakas›
üzerine düflen nokta say›s› belirlendi. Bu ifllem her kesitteki çizim için üç kez tekrarland› ve üç say›m›n ortalamas› al›nd›. Böylece, her beyin- den al›nan kesitlerden elde edilen toplam nok- ta say›s› (Q-) belirlendi. Kesitler aras›ndaki uzakl› ›n belirlenmesi için her bir kesitin kal›n- l› › ölçüldü.[12]Daha sonra, kesitlerden elde edi- len toplam nokta say›s› (Q-), noktal› say›m cet- velinde bir noktan›n temsil etti i alan ve kesit- ler aras›ndaki uzakl›k çarp›larak, gyrus denta- tus granüler tabaka hacmi hesapland›.
Cavalieri prensibine göre hacim hesaplama- lar› için afla ›daki formül kullan›ld›;[8,9,13]
V = (Q-) x (a) x (h)
V = Hacim (gyrus dentatus toplam hacmi).
Q-= Noktal› say›m cetvelinde say›lan toplam nokta say›s›.
a = Alan (Noktal› say›m cetvelindeki her noktan›n temsil etti i alan) (0.09 mm2) . h = Yükseklik veya kal›nl›k (iki kesit
aras›ndaki uzakl›k).
Normal EEG
Klonik nöbet
Tonik nöbet
100µV 1 sn
(a)
(b)
(c)
fiEK‹L 2
(a) ‹ntrakortikal serum fizyolojik verilen s›çanlardan ve (b, c) penisilin ile epilepsi oluflturulan s›çanlardan elde edilen EEG kay›t örnekleri.
BULGULAR
‹ntrakortikal serum fizyolojik verilen kont- rol grubundaki s›çanlar›n EEG kay›tlar›nda elektriksel aktivitede bir de ifliklik gözlenme- di (fiekil 2a). ‹ntrakortikal penisilin verilen s›- ç a n l a rda ise enjeksiyondan 2-3 dakika sonra nöbetler gözlendi (fiekil 2b, c).
S e rum fizyolojik verilen s›çanlar›n sol gyru s dentatus hacmine (ort. hacim=2.24±0.38 mm3) gö- re penisilin epilepsi modeli oluflturulan s›çanlar›n sol gyrus dentatus hacmi (ort. hacim=2.38±0.36 m m3) (Tablo 1) daha büyük görünmesine ra men, aradaki fark istatistiksel olarak anlaml› de ildi (Mann-Whitney U testi, p>0.05).
TARTIfiMA
Gyrus dentatus ve hipokampus, filogenetik olarak “archiocortex”in esas k›sm›n› olufltu- ru r l a r. Histolojik olarak, di er korteks yap›lar›
alt› tabakal› olmas›na karfl›n, bu korteks bölge- si üç tabakal›d›r.[ 1 ] Üç tabakal› yap›s›ndan do- lay› bu bölgenin hipereksitabilite gösterdi i ve epileptik nöbetlerde kolayl›kla uyar›labildi i b e l i r t i l m i fl t i r.[ 2 ] Epileptik nöbetler, hipokam- pusta geri dönüflü olmayan nöron kayb›na ne- den olmaktad›r.[ 1 4 - 1 6 ]Geri dönüflü olmayan hüc- re kayb›, CA1 ve CA3 piramidal hücre l e r i n d e y a y g › n d › r. Ancak, gyrus dentatusun granüler h ü c releri ve CA2piramidal hücreleri, bu hücre kayb›na rölatif olarak dayan›kl›d›r.[ 1 6 , 1 7 ] B u n a uyumlu olarak, daha önce yapt› ›m›z çal›flma- da, penisilin ile oluflturulan deneysel epilepsi sonucu gyrus dentatus granüler hücre say›s›n- da önemli bir de ifliklik bulunmam›flt›r.[ 7 ] A n- cak, penisilin epilepsi modelinde, gyrus den- tatustaki de iflikliklerin tan›mlanmas›nda nö- ron say›lar›n›n yan› s›ra hacim de ifliklikleri-
nin de bilinmesi önemlidir. Bu çal›flmalar› göz önüne alarak, çal›flmam›zda penisilin epilepsi modeli sonucu oluflan nöbetlerin gyrus denta- tus hacim de iflikliklerine etkisini araflt›rmay›
a m a ç l a d › k .
Epilepside gyrus dentatus granüler hücre yay›lmas› (dispersion) ve mossy liflerin filiz- lenmesinin (mossy fibre sprouting) gözlendi i b i l d i r i l m i fl t i r.[ 1 8 ] Granüler hücre yay›lmas›, ge- nifllemifl bir granüler tabaka (stratum granulo- sum) ile karakterizedir.[ 1 8 ] Bu olay›n mekaniz- mas› tam olarak ayd›nlat›lamam›flt›r. Bir hipo- teze göre, nöron göçü sonucu anormal düzen- lenme ve granüler hücrelerin ektopik pozisyo- na gelmesi bu genifllemede rol oynamakta- d › r.[ 1 8 ]Çal›flmam›zda, penisilin verilen s›çanla- r›n gyrus dentatus hacminde bir art›fl gözlen- m i fl t i r. Bu sonuç, granüler hücre yay›lmas› ne- deniyle ortaya ç›km›fl olabilir. Ancak, penisilin ve kontrol gruplar› aras›ndaki farkl›l›k istatis- tiksel olarak anlaml› bulunmam›flt›r.
Bizim çal›flmam›zda, deneysel epilepsi olufl- turmak için penisilin kullan›lm›flt›r. Penisilin kimyasal olarak konvulsiv bir ajand›r.[5,19]Parsi- yel nöbetlerin oluflturulmas›nda, topikal olarak kullan›lan penisilinden yararlan›labilir. Korti- kal yüzeye uygulanan penisilin ile akut parsi- yel (akut fokal) epilepsidekine benzer EEG’ler k a y d e d i l e b i l i r.[ 1 9 - 2 1 ] Merkezi sinir sisteminde GABA inhibitör, glutamat eksitatör özellikteki nörotransmiterlerdir. GABA arac›l› inhibisyo- nun zay›flamas›, epileptik nöbetin yay›lmas›n- da önemli bir etkendir.[22]Fokal epilepsi, beyin korteksindeki azalm›fl GABA arac›l› inhibisyon ve glutamata ba l› eksitasyon etkisiyle olu- flur.[22]Penisiline ba l› epileptik nöbet, korteks- teki GABA inhibisyonunun azalmas› ve gluta- TABLO 1
‹ntrakortikal serum fizyolojik verilen (kontrol) ve penisilin ile deneysel epilepsi oluflturulan s›çanlar›n s›çanlar›n sol gyrus dentatus granüler tabaka hacimleri ve kullan›lan parametreler
Kontrol grubu Penisilin grubu
Sݍan 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Q-(Say›lan nokta say›s›) 201 92 163 229 178 189 229 109 169 231 167 104 a (Noktal› say›m cetvelinde bir 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09
noktan›n temsil etti i alan, mm2)
V (Hacim, mm3) 2.17 1.99 1.76 2.88 2.24 2.38 2.27 2.35 1.97 2.91 2.1 2.71
mat salg›s›n›n artmas›yla oluflmaktad›r.[17,19,22-24]
Ayr›ca, penisilinin, GABA etkisini bloke etti i, non-spesifik bir GABA antagonisti olabilece i ve GABAerjik etkiyi zay›flatarak konvulsiv etki oluflturabilece i düflünülmektedir.[25,26] Penisili- nin oluflturdu u epileptiform aktivite, fokal bafllay›p yay›larak jeneralize olmas› flekliyle klinikteki grand mal epilepsiye benzer bir tab- lo oluflturmaktad›r.[6]
Çal›flmam›zda, penisilin ile deneysel epilep- si oluflturulan s›çanlar›n gyrus dentatus granü- ler hücre tabakas›nda anlaml› bir hacim art›fl›
bulunmam›flt›r. Penisilin grubu s›çanlarda ha- cimde art›fl görülmesi, ancak bunun istatistik- sel olarak anlaml› bulunmamas› penisilin ile o l u fl t u rulan epileptik nöbetlerin tipine ba l›
olabilir. Ayr›ca, bu sonuç, gyrus dentatusun histolojik yap›s›ndan dolay› epileptik nöbetler- de kolay uyar›labilmesine ra men, granüler hücrelerin geri dönüflü olmayan hücre kayb›na di er formatio hippocampalis bölgelerine göre daha dayan›kl› olmas› ile aç›klanabilir. Deney- sel epileptik nöbetlerin beynin de iflik bölgele- rindeki etkilerinin araflt›r›lmas›nda nöron say›- m› ile hacim de iflikliklerinin birlikte ele al›n- mas› objektif de erlendirmelerin yap›lmas›na yard›mc› olacakt›r.
Teflekkür
Makalenin yazarlar› olarak, yapt›klar› katk›- lardan dolay› Doç. Dr. Türker fiahiner ve Doç.
Dr. Atilla O uzhano lu’na (Pamukkale Üniver- sitesi T›p Fakültesi Nöroloji Anabilim Dal›, De- nizli) teflekkür ediyoruz.
KAYNAKLAR
1. Berry M, Bannister LH, Standring SM. Nervous sys- tem. In: Williams PL, editor. Gray’s anatomy. 38th ed. New York: Churchill Livingstone; 1995. p. 901- 1399.
2. Guyton AC. The central nervous system. In: Basic n e u roscience anatomy and physiology. 2nd ed.
Philadelphia: W.B. Saunders; 1991. p. 262-3.
3. Mouritze Dam A. Hippocampal neuron loss in epilepsy and after experimental seizures. Acta Neurol Scand 1982;66:601-42.
4. Mello LE, Cavalheiro EA, Tan AM, Kupfer WR, P retorius JK, Babb TL, et al. Circuit mechanisms of s e i z u res in the pilocarpine model of chronic epilepsy:
cell loss and mossy fiber sprouting. Epilepsia 1993;
3 4 : 9 8 5 - 9 5 .
5. Biziere K, Chambon JP. Animal models of epilepsy and experimental seizures. Rev Neurol 1987;143:
329-40.
6. Sagratella S, Niglio T, Scotti de Carolis A. An inves-
tigation on the mechanism of anticonvulsant action of ketamine and phencyclidine on convulsions due to cortical application of penicillin in rabbits.
Pharmacol Res Commun 1985;17:773-86.
7. Ad›guzel E, Akdo an I, Düzcan SE, Tufan C. Effect of penicillin induced epilepsy seizure on granulere cell layer of the dentate gyrus in rat: a stereological s t u d y. Neuroscience Research Communications 2002;31:101-9.
8. Gundersen HJ, Bendtsen TF, Korbo L, Marcussen N, Moller A, Nielsen K, et al. Some new, simple and e fficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS 1988;
96:379-94.
9. Gundersen HJ, Jensen EB. The efficiency of system- atic sampling in stereology and its prediction. J Microsc 1987;147( Pt 3):229-63.
10. Roberts N, Cruz-Orive LM, Reid NM, Brodie DA, Bourne M, Edwards RH. Unbiased estimation of human body composition by the Cavalieri method using magnetic resonance imaging. J Microsc 1993;
171( Pt 3):239-53.
11. fiahin B, Aslan H, Ünal B, Canan S, Bilgiç S, Kaplan S, et al. Brain volumes of the lamb, rat and bird do not show hemispheric asymmetry: a stereological study. Image Anal Stereol 2001;20:9-13.
12. Korkmaz A, Tümkaya L. Estimation of the section thickness and optical dissector height with a simple calibration method. J Microsc 1997;187:104-9.
13. Howard CV, Reed MG (editors). Estimation of refer- ence volume using the Cavalieri method. In:
Unbiased stereology- three-dimensional measure- ment in microscopy. 1st ed. Oxford: BIOS Scientific Publishers; 1998. p. 39-54.
14. Dam M, Bolwig T, Hertz M, Bajorec J, Lomax P, Dam AM. Does seizure activity produce Purkinje cell loss? Epilepsia 1984;25:747-51.
15. Esiri MM, Oppenheimer DR (editors). Epilepsy. In:
Diagnostic neuro p a t h o l o g y. Oxford: Blackwell Scientific Publications; 1989. p. 280-5.
16. Sloviter RS. Decreased hippocampal inhibition and a selective loss of interneurons in experimental epilepsy. Science 1987;235:73-6.
17. Schwartzkroin PA, Mcintyre DC. Limbic anatomy and physiology. In: Pedley TA, editor. Epilepsy: a c o m p rehensive textbook. 1st ed. Philadelphia:
Lippincott Raven Publishers; 1997. p. 323-37.
18. P roper EA, Hoogland G, Van Veelen CW, Grann PN.
Morphological changes in the human epileptogenic hip- pocampus. Neuroscience Research Communications 2 0 0 1 ; 2 9 : 1 2 9 - 4 6 .
19. Fisher RS. Animal models of the epilepsies. Brain Res Brain Res Rev 1989;14:245-78.
20. Purpura DP, Penry JK, Tower DB, Woodbury DM, Walter RD (editors). Experimental models of epilep- sy. A manual for the laboratory worker. 1st ed. New York: Raven Press; 1972.
21. Schwartzkroin PA, Mody I. Acute seizures models (intact animals). In: Pedley TA, editor. Epilepsy: a c o m p rehensive textbook. 1st ed. Philadelphia:
Lippincott Raven Publishers; 1997. p. 397-403.
22. Ba ›r›c› F, Gökçe FM, Marangoz C. Depressive effect of nicardipine on penicillin-induced epileptiform activity in rats. Neuroscience Research Communications
1 9 9 9 ; 2 4 : 1 4 9 - 5 4 .
23. Domann R, Uhlig S, Dorn T, Witte OW. Participation of interneurons in penicillin-induced epileptic dis- charges. Exp Brain Res 1991;83:683-6.
24. Pedley TA, Meldrum BS (editors). Cellular mecha- nism of focal epileptogenesis. In: Recent advances
in epilepsy. Number two. 1st ed. E d i n b u rg h : Churchill Livingstone; 1985. p. 1-63.
25. Treiman DM. GABAergic mechanisms in epilepsy.
Epilepsia 2001;42 Suppl 3:8-12.
26. Engel J. Seizures and epilepsy. Philadelphia: F.A.
Davis Co.; 1989.
