‹ntrahipokampal Kainik Asit Uygulanm›fl S›çanlarda Ifl›k Mikroskopi Çal›flmas›
*A Light Microscopy Study of the Intrahippocampal Kainic Acid-Treated Rats
Tangül fiAN, Serap fi‹RVANCI, Emsal SALIK, Feriha ERCAN, fiule ÇET‹NEL, Hasan YANANLI, Filiz ONAT
Epilepsi 2001;7(1-2):9-16
Objectives: We examined whether there is neu- ronal loss in the hippocampus of kainic acid-treat- ed rats.
Study Design and Methods: Adult Sprague- Dawley rats (250-300 g) were assigned to either intrahippocampal isotonic saline or kainic acid.
Four months later, following intracardiac perfusion hippocampi of the rats were isolated and trans- ferred to the fixative solution. Semi-thin sections were prepared and stained with toluidine blue for light microscopy.
Results: Neuronal loss was observed in the CA1 region of the hippocampus of the kainic acid-treat- ed rats, being greater on the ipsilateral than the contralateral side. Axonal projections were increased in the molecular layer of the ipsilateral dentate gyrus. There was no evidence of neu- ronal loss and increased axonal projections in the control group.
Conclusion: Kainic acid-treated rat model is instrumental because it has similar characteristics with human mesial temporal lobe epilepsy.
Key Words: Hippocampus/drug effects; epilepsy/
chemically induced; injections; kainic acid; microscopy;
rats.
Amaç: Bu çal›flmada, s›çanda oluflturulan kainik asit epilepsi modelinde hipokampusta nöron kay- b› olup olmad›¤› incelendi.
Çal›flma Plan› ve Yöntemler: Eriflkin Spra- gue-Dawley s›çanlara (250-300 gr) intrahipo- kampal serum fizyolojik veya kainik asit verildi.
Enjeksiyondan 120 gün sonra intrakardiyak perfüzyon yap›l›p hipokampus izole edildi ve fiksatif içine al›nd›. Haz›rlanan yar›-ince kesit- ler toluidin mavisi ile boyan›p ›fl›k mikroskobu alt›nda incelendi.
Bulgular: ‹ntrahipokampal tek tarafl› enjeksiyon yap›lm›fl s›çanlar›n hipokampusunda CA1 böl- gesinde ipsilateral tarafta kontralaterale göre daha fazla nöron kayb› gözlendi. ‹psilateral den- tat girus moleküler tabakas›nda aksonal liflerde art›fl görüldü. Kontrol grubundaki s›çanlarda nö- ron kayb›na ve aksonal lif art›fl› bulgular›na rast- lanmad›.
Sonuç: Kainik asit uygulanm›fl s›çan modeli, insan mesial temporal lob epilepsisi ile en çok benzerlik gösteren model olmas› aç›s›ndan önemlidir.
Anahtar Sözcükler: Hipokampus/ilaç etkisi; epilep- si/kimyasal yolla oluflturulan; enjeksiyon; kainik asit;
mikroskopi; sݍan.
Dergiye gelifl tarihi: 28.10.2000 Düzeltme iste¤i: 14.02.2001 Yay›n için kabul tarihi: 29.03.2001
Marmara Üniversitesi, T›p Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dal› (fian, fiirvanc›, Sal›k, Ercan, Çetinel);
Farmakoloji ve Klinik Farmakoloji Anabilim Dal› (Yananl›, Onat).
*Bu çal›flma Beyin Araflt›rmalar› Derne¤i (BAD) taraf›ndan desteklenmektedir.
‹letiflim adresi: Dr. Tangül fian. Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi, Elektron Mikroskopi Ünitesi, Haydarpafla, 81326 Kad›köy - ‹stanbul.
Tel: 0216 - 348 05 58 Faks: 0216 - 414 47 31 e-posta: sirvanci@prizma.net.tr
Temporal lob epilepsisi insanda di¤er epi- lepsilere göre daha s›k ortaya ç›kmaktad›r.
Temporal lob üzerine yap›lan histopatoloji ça- l›flmalar›nda olgular›n %65’inde hipokampal skleroz saptanm›flt›r.[1] Bu nedenler araflt›rmac›- lar›n ilgisini hipokampal bölgeye yo¤unlaflt›r- m›flt›r. Anterior hipokampal skleroz ile tempo- ral lob epilepsileri aras›nda görülen yak›n ilgi nedeniyle terminolojik olarak parsiyel epilepsi- lere hipokampal epilepsi ad› verilmesi de be- nimsenmifltir.[2] Hipokampal skleroz ile tempo- ral lob epilepsisi aras›ndaki yüksek korelasyo- na ra¤men, nöbetlerin bafllamas› ve ilerleme- sinde hipokampal nöron kayb›n›n rolü henüz aç›k olarak anlafl›lamam›flt›r. Epilepsinin ve nö- betlerin etyopatogenezini ayd›nlatmak amac›y- la hayvanlarda çeflitli epilepsi ve nöbet model- leri oluflturulmaktad›r. Temporal lob epilepsisi- nin oluflumunu aç›klamak amac›yla kullan›lan modellerden biri de, glutamat reseptör agonisti olan kainik asidin sistemik ya da lokal yoldan uygulanmas›d›r.
Nöronal hipereksitabilite art›fl›n›n, hücresel ve moleküler düzeyde de¤ifliklikler meydana getirerek (a) eksitatör sistemlerde afl›r›laflma, (b) eksitatör ve inhibitör fonksiyonlarda nöro- modülasyon defekti, (c) inhibitör fonksiyon bo- zuklu¤u, (d) nöronal membranlarda veya iyon kanallar›nda transport defekti oluflturdu¤u ko- nusunda de¤iflik hipotezler ortaya at›lm›flt›r.
Bir nörotoksin olan kainik asidin s›çanlara enjeksiyonu, akut ve doza ba¤l› olarak konvül- siyonlara, nörotoksik eksitasyona ba¤l› nöbete ve haftalar sonra da spontan reküren nöbetlere neden olmaktad›r.[3]Kronik tablo, insan mesial temporal lob epilepsisindeki klinik de¤ifliklik- lerle yak›n benzerlikler gösterir. Medikal teda- viye yan›t vermeyen temporal lob epilepsili hastalardan al›nan cerrahi materyalde, hipo- kampal CA3/CA4 ve CA1 bölgelerinde nöron kayb› ve reaktif gliozis oldu¤u gözlenmifltir.[1]
Benzer bir lezyon ve glial yan›t, s›çanlarda int- raperitoneal, intraserebroventriküler ve intra- hipokampal kainik asit uygulamas›ndan sonra da görülmüfltür.[4] Bir baflka çal›flmada ise CA3 piramidal nöronlar›n›n ve CA4 komissürel aso- siasyonel liflerin kainik asit ile hasara u¤rat›l- mas›ndan 1-3 ay sonra, ipsilateral dentat giru- sun iç moleküler tabakas›nda çinko yönünden zengin terminallerin iflaretlenmesinde art›fl gözlenmifltir.[5]
Kainik asit enjeksiyonu, temporal lob epi- lepsisindeki hipereksitabilitenin alt›nda yatan mekanizmalar› araflt›rmak aç›s›ndan oldukça uygun bir model olma özelli¤ini tafl›maktad›r;
çünkü, bu epilepside görülen Ammon boynu- zu sklerozu ve hipokampal hipereksitabilite ka- inik asit modelinde görülebilmektedir.[6-9]
Bu çal›flmada, hayvanlarda oluflturulan ka- inik asit modeli ile insan temporal lob epilepsi- sinde görülen Ammon boynuzu sklerozunun nöropatolojik profilinin ayd›nlat›lmas› amaç- land›.
GEREÇ VE YÖNTEM
Eriflkin 250-300 gr a¤›rl›¤›ndaki 10 adet Sprague-Dawley s›çan ketamin (50 mg/kg, int- raperitoneal) ile uyutulduktan sonra, stereotak- sik alet (Stoelting, Model 51600) yard›m› ile ka- fa sabitlenip kafa derisi vertikal olarak aç›ld›.
Hipokampus koordinatlar› bregmadan arkaya 6.0 mm, sa¤a 4.5 mm ve kafatas› yüzeyinden afla¤›ya do¤ru 7.0 mm’dir. Hipokampusa mad- de uygulamas› tek tarafl› olarak yap›ld›. Kont- rol grubuna (n=5) serum fizyolojik, kainik asit grubuna (n=5) ise 0.2 µg/taraf madde uygulan- d›. Daha sonra hayvanlar kendi ortamlar›nda yiyecek ve su al›mlar› serbest olacak flekilde bekletildi. Enjeksiyondan 120 gün sonra s›çan- lar eterle uyutulup perfüzyon pompas› ile 50 ml/dk h›zda intrakardiyak perfüzyon yap›ld›.
Perfüzyonda fiksatif olarak 0.1 M HEPES tam- ponu içinde %2.5 glutaraldehit, %0.5 parafor- maldehit, %0.2 pikrik asit kullan›ld›. Beyinler- den izole edilen hipokampus dokusu 24 saat boyunca 4°C’de bekletildi. HEPES tamponun- da dokular y›kand›ktan sonra takibe al›nd›.
%1.5 osmium tetroksit/%1.5 potasyum ferrisi- yanid ile 30 dk postfiksasyondan sonra deiyo- nize suyla y›kanan dokular, %0.5 uranil asetat- ta 30 dk bekletildi. Yükselen alkol serileri ve propilen oksit ile dehidratasyon yap›ld› ve bloklar Epon 812’ye gömüldü. K›rk sekiz saat boyunca 60°C’de etüvde bekletilen doku blok- lar›ndan yar›-ince kesitler al›nd› ve toluidin mavisi ile boyama yap›ld›.
BULGULAR
Ifl›k mikroskobu ile yap›lan çal›flmada, tek tarafl› intrahipokampal kainik asit uygulanan s›çanlar›n ipsilateral hipokampus doku kesit- leri, kontralateral taraf ile ve serum fizyolojik uygulanan kontrol hipokampus bulgular› ile
fiEK‹L 1
Kontrol hipokampus. CA bölgelerinde nöronlar›n devaml›l›¤› görülüyor (oklar: CA1) (x 40).
fiEK‹L 2
Tek tarafl› intrahipokampal kainik asit enjeksiyonu uygulanm›fl s›çanda ipsilateral hipokam- pus. CA1 bölgesinde nöron kayb› gözleniyor (oklar). Asterisk: Reaktif gliozis bölgesi (x 40).
karfl›laflt›r›ld›. ‹psilateral hipokampusun CA2 ve CA3 bölgelerinde nöron kayb› gözlenmedi.
Kontrol hipokampusun CA1 bölgesindeki pi- ramidal hücre tabakas›nda nöronlarda de- vaml›l›k izlenirken (fiekil 1), ipsilateral CA1 seviyesinde (fiekil 2, 3) kontralateral CA1 se- viyesine (fiekil 4, 5) göre daha fazla nöron kayb› oldu¤u kalitatif olarak gözlendi. ‹psila-
teral hipokampusta gliozis oldu¤u görüldü (fiekil 2, asterisk). ‹psilateral hipokampusun dentat girus supragranüler tabakas›nda akso- nal lif art›fl› saptand› (fiekil 7). Art›fl gösteren bu aksonal liflerin myelinli oldu¤u görüldü.
Kontrol s›çanlarda (fiekil 6) ve kontralateral hipokampusta (fiekil 8) bu bulguya rastlan- mad›.
TARTIfiMA
Daha önceki önçal›flmam›zda amigdalohi- pokampektomi yap›lm›fl hastalar›n hipokam- puslar›nda Ammon boynuzunda bulunan pira- midal hücrelerde kay›p oldu¤unu gözlemifl- tik.[10]Ammon boynuzu sklerozu oluflturabilme özelli¤ine sahip olan kainik asit modelinde de benzer bir bulguya rastlanmas›, daha önceki
çal›flmam›zla histolojik bak›mdan paralellik göstermektedir. Dolay›s›yla deney, kainik asit uygulamas›n›n sonucunu do¤rulayacak biçim- de beyin hasar›n› ortaya koyan bir sonuç gös- termifltir.
Bouilleret ve ark.,[11] eriflkin farelere intrahi- pokampal kainik asit enjeksiyonundan iki saat sonra CA1, CA3c ve hilusta piknotik piramidal
fiEK‹L 4
Tek tarafl› enjeksiyon, kontralateral hipokampusta ipsilaterale göre daha az oldu¤u görülen nöron kayb› (oklar) (x40).
fiEK‹L 3
Tek tarafl› enjeksiyon, ipsilateral hipokampusta nöron kayb› (oklar) (x100).
fiEK‹L 5
Tek tarafl› enjeksiyon, kontralateral hipokampusta nöron kayb› (oklar) (x100).
fiEK‹L 6
Kontrol hipokampus. Dentat girus moleküler tabakada aksonal lif art›fl› gözlenmemektedir (g: Granüler tabaka; m: Moleküler tabaka) (x400).
hücreler; bir hafta sonra ayn› bölgelerde hücre kayb› gözlemifller; bir ay sonra da CA1 ve CA3c bölgelerinin tamam›na yak›n bir bölümünün dejenerasyona u¤rad›¤›n› ve granül hücre taba- kas›n›n yayg›nlaflt›¤›n› saptam›fllard›r. Yapt›¤›- m›z çal›flmada da kainik asit intrahipokampal uygulanm›fl ve dört ayl›k bir bekleme süresin- den sonra histolojik inceleme yap›lm›flt›r. Dola-
y›s›yla, yukar›da belirtilen çal›flmadakine uy- gun bir flekilde oluflan hücre kayb› bir ayl›k bir sürede gerçekleflmifl, daha sonraki zaman süre- cinde bir de¤ifliklik izlenmemifltir.
Hücre kayb›n›n sektör üzerinde hangi böl- gede oldu¤u konusunda çeflitli tart›flmalar var- d›r. Davenport ve ark.,[12] intrahipokampal ka- inik asit enjeksiyonundan sonra, hücre say›m›
sonucu CA3 piramidal tabakas›nda ve hilar bölgede hücre kayb› oldu¤unu göstermifllerdir.
Nadler ve ark.,[13]kainik asidin tek tarafl› intra- hipokampal uygulamas›ndan sonra CA3 böl- gesindeki nöronlar›n hasarland›¤›n› gözlemifl- lerdir. Özellikle CA2 bölgesi hücre kayb› bak›- m›ndan etkilenmemektedir ve insan temporal lob epilepsisinde tan›mlanan “dirençli sektör”
olma özelli¤ini göstermektedir.[14] Bu çal›flma- m›z da ayn› bölgenin kainik asit uygulamas›n- da direnç gösterdi¤ini ortaya koymufltur.
Davenport ve ark.[15]baflka bir çal›flmada ise tek tarafl› intrahipokampal kainik asit enjeksi- yonunun supragranüler mossy lifi filizlenmesi- ne neden oldu¤unu ortaya koymufllard›r. Nor- malde dentat girustan ç›kan mossy liflerinin
fiEK‹L 7
Tek tarafl› enjeksiyon, ipsilateral hipokampus. Dentat girusun moleküler tabakas›nda aksonal liflerde art›fl (oklar) (x400).
fiEK‹L 8
Tek tarafl› enjeksiyon, kontralateral hipokampus. ‹psilateral hipokampus ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda dentat girus moleküler tabakada aksonal lif art›fl› gözlenmemektedir
(g: Granüler tabaka; m: Moleküler tabaka) (x400).
myelinsiz projeksiyonlar oluflturmas›na kar- fl›n,[16] çal›flmam›zda moleküler tabakada art›fl gösteren aksonal liflerin myelinli oluflunun gözlenmesi dikkat çekicidir. Bu bulgular, ka- inik asit etkisiyle dentat girus moleküler taba- kas›nda mossy lifi filizlenmesi meydana gelmifl olabilece¤ini düflündürmektedir. Enjeksiyon sonras› beklenen sürecin uzunlu¤u bu sonucu ortaya ç›karm›fl olabilir.
Hipokampal skleroz, özellikle CA1’de pira- midal hücre kayb›, reaktif gliozis, dentat girus- ta granül hücre yayg›nlaflmas› ve mossy fibril reorganizasyonu ile karakterizedir.[17] Bu çal›fl- mam›zda ipsilateral hipokampusta saptad›¤›- m›z gliozis de daha önceki çal›flmalarla uyum göstermektedir.
Kainik asit enjeksiyonundan sonra dentat girusun iç moleküler tabakas›nda görülen mossy lif kollaterallerinin filizlenmesine neden olan etkiler kesin olarak bilinmemektedir. Hi- pokampal yollar›n deneysel olarak hasara u¤- rat›lmas› reaktif plastisiteye neden olmaktad›r.
‹psilateral ve komissürel afferentler, inervasyo- nu ortadan kalkan dendritik bölgeleri yeniden uyarmak için filizlenme göstermektedirler.[18]
Nadler ve ark.[4]CA3/CA4 nöronlar›n›n kainik asit ile hasara u¤rat›lmas›ndan sonra, hipo- kampal mossy lif kollaterallerinin, dejenere olan assosiasyonel-komissürel afferent liflerin yerini ald›klar›n› göstermifllerdir. Komissürel assosiasyonel lifler normalde granüler hücre dendritlerinin iç moleküler tabakas›n› uyar- maktad›rlar. Dejenerasyon sonucu, anormal bir flekilde filizlenen reküren granüler hücre kolla- teralleri bu liflerin yerini almaktad›r. Bu rekü- ren kollaterallerin baz›lar›n›n eksitatör oldu-
¤u,[19]bunun da kronik epileptik bir odak orta- ya ç›kmas›nda önemli etkisi olabilece¤i düflü- nülmektedir.[5]
Milgram ve ark.,[20] kainik asit uygulanm›fl hayvanlarda CA1 piramidal nöronlar›nda ka- y›p gözlemifllerdir. Epileptiklerde görülen nö- bet tetiklenmesi ve nöronal yan›t›n art›fl›nda, inhibisyon mekanizmalar›n›n ifllemeyiflinin önemli bir faktör oldu¤u düflünülmektedir.
Dentat girusta bu inhibisyonun, moleküler ta- bakadaki GABAerjik internöronlar› uyaran re- küren kollateraller taraf›ndan gerçeklefltirildi¤i öne sürülmektedir. Cornish ve Wheal,[21]tek bir intraserebroventriküler kainik asit enjeksiyo- nundan 16 hafta sonra, CA1 bölgesindeki inhi-
bisyonun azald›¤›n› bulmufllard›r. Milgram ve ark.[20] taraf›ndan bu de¤iflikliklerin internöron kayb›ndan dolay› olabilece¤i ileri sürülmüfltür.
Sloviter,[22] perforan yolun tekrarlanan uyar›la- r›ndan sonra hilar bölgedeki somatostatin içe- ren internöronlarda selektif bir kay›p oldu¤unu gözlemifllerdir. Scharfman ve Schwartzkroin[23]
dentat girus afferentlerinin uyar›lmas›ndan sonra, kalsiyum ba¤lay›c› proteinlerin olmad›¤›
hücrelerde dejenerasyon bulgusuna rastlam›fl- lard›r. Status epileptikus modellerinde hasar profili de¤iflken olmas›na ra¤men, CA1 ve hilar bölgelerde birbirleriyle uyumlu hücre kayb›
gözlenmektedir.
Sonuç olarak, kainik asit uygulanm›fl s›çan modeli, insan mesial temporal lob epilepsisine di¤er temporal lob epilepsi modellerinden da- ha çok benzerlik göstermektedir. Bafll›ca nöron kayb› olan bölgeler (dentat girusun hilusu ve CA1) ayn›d›r. Gliozis ve mossy lifi filizlenmesi de insan mesial temporal lob epilepsisinde ve deneysel kainik asit modelinde görülen ortak bulgulard›r. Yapt›¤›m›z bu çal›flmada, kainik asit modelinde hipokampal sklerozun karakte- ristik özellikleri olan CA1 piramidal hücreleri- nin kayb›, reaktif gliozis ve mossy lifi filizlen- mesi meydana gelmifl olabilece¤ini düflündü- ren myelinli lif art›fl› bulgular›yla, bu modelin insan mesial temporal lob epilepsisini çal›flmak için uygun bir model olma özelli¤i tafl›d›¤›n›
saptad›k.
KAYNAKLAR
1. Babb TL, Brown WJ. Pathological findings in epilep- sy. In: Engel J Jr, editor. Surgical treatment of epilep- sies. New York: Raven Press; 1987. p. 511-40.
2. Babb TL. Research on the anatomy and pathology of epileptic tissues. In: Lüders H, editor. Epilepsy surgery. New York: Raven Press; 1991. p. 719-27.
3. Kofler N, Kirchmair E, Schwarzer C, Sperk G.
Altered expression of NPY-Y1 receptors in kainic acid induced epilepsy in rats. Neurosci Lett 1997;
230:129-32.
4. Nadler JV, Perry BW, Cotman CW. Selective reinner- vation of hippocampal area CA1 and the fascia den- tata after destruction of CA3-CA4 afferents with kainic acid. Brain Res 1980;182:1-9.
5. Sundstrom LE, Mitchell J, Wheal HV. Bilateral reor- ganisation of mossy fibres in the rat hippocampus after a unilateral intracerebroventricular kainic acid injection. Brain Res 1993;609:321-6.
6. Babb TL, Lieb JP, Brown WJ, Pretorius J, Crandall PH. Distribution of pyramidal cell density and hyperexcitability in the epileptic human hippocam- pal formation. Epilepsia 1984;25:721-8.
7. Babb TL, Pretorius JK, Kupfer WR, Crandall PH.
Glutamate decarboxylase-immunoreactive neurons are preserved in human epileptic hippocampus. J Neurosci 1989;9:2562-74.
8. Engel J Jr. The Hans Berger lecture. Functional explorations of the human epileptic brain and their therapeutic implications. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1990;76:296-316.
9. Sutula TP. Experimental models of temporal lobe epilepsy: new insights from the study of kindling and synaptic reorganization. Epilepsia 1990; 31 Suppl 3;
S45-54.
10. fian T, Onat F, Özkara Ç, Öztürk E, fianl› S, Ercan F.
Immunocytochemical study in hippocampus of patient with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia 1999;40 Suppl 2:205.
11. Bouilleret V, Ridoux V, Depaulis A, Marescaux C, Nehlig A, Le Gal La Salle G. Recurrent seizures and hippocampal sclerosis following intrahippocampal kainate injection in adult mice: electroencephalogra- phy, histopathology and synaptic reorganization sim- ilar to mesial temporal lobe epilepsy. Neuroscience 1999;89:717-29.
12. Davenport CJ, Brown WJ, Babb TL. GABAergic neu- rons are spared after intrahippocampal kainate in the rat. Epilepsy Res 1990;5:28-42.
13. Nadler JV, Perry BW, Cotman CW. Selective reinner- vation of hippocampal area CA1 and the fascia den- tata after destruction of CA3-CA4 afferents with kainic acid. Brain Res 1980;182:1-9.
14. Margerison JH, Corsellis JA. Epilepsy and the tempo- ral lobes. A clinical, electroencephalographic and neu- ropathological study of the brain in epilepsy, with particular reference to the temporal lobes. Brain 1966;
89:499-530.
15. Davenport CJ, Brown WJ, Babb TL. Sprouting of GABAergic and mossy fiber axons in dentate gyrus following intrahippocampal kainate in the rat. Exp Neurol 1990;109:180-90.
16. Frotscher M, Zimmer J. Lesion-induced mossy fibers to the molecular layer of the rat fascia dentata: identi- fication of postsynaptic granule cells by the Golgi-EM technique. J Comp Neurol 1983;215:299-311.
17. Babb TL, Kupfer WR, Pretorius JK, Crandall PH, Levesque MF. Synaptic reorganization by mossy fibers in human epileptic fascia dentata. Neuroscience 1991;42:351-63.
18. Laurberg S, Zimmer J. Lesion-induced sprouting of hippocampal mossy fiber collaterals to the fascia den- tata in developing and adult rats. J Comp Neurol 1981;200:433-59.
19. Tauck DL, Nadler JV. Evidence of functional mossy fiber sprouting in hippocampal formation of kainic acid-treated rats. J Neurosci 1985;5:1016-22.
20. Milgram NW, Yearwood T, Khurgel M, Ivy GO, Racine R. Changes in inhibitory processes in the hippocampus following recurrent seizures induced by systemic administration of kainic acid. Brain Res 1991;551:236-46.
21. Cornish SM, Wheal HV. Long-term loss of paired pulse inhibition in the kainic acid-lesioned hip- pocampus of the rat. Neuroscience 1989;28:563-71.
22. Sloviter RS. Decreased hippocampal inhibition and a selective loss of interneurons in experimental epilep- sy. Science 1987;235:73-6.
23. Scharfman HE, Schwartzkroin PA. Protection of dentate hilar cells from prolonged stimulation by intracellular calcium chelation. Science 1989;246:
257-60.
