Blakeslee ve ark. (1922) tarafından Datura stramonium’da ilk haploid bitkilerin keşfedilmesinden sonra, haploidi ile ilgili çalışmalar başlamıştır.
Haploidlerin sağladığı potansiyel, araştırmacıları haploid bitki elde etmek amacıyla yapılan denemelere yoğunlaştırmıştır. Birçok bitki türünde ya çiçeklere uygulanan dışsal muameleler yardımıyla ya da haploid eşey hücrelerini in vitro kültüre alarak haploid bitki elde edilmesi amacına ulaşılmaya çalışılmıştır (Maheshwari, 1996).
Guha ve Maheshwari 1964, 1966 ve 1967 yıllarında art arda yayınladıkları makalelerinde, Datura innoxia bitkisinde in vitro uyartım sonucu androgenesis yoluyla ilk haploid bitkileri elde ettiklerini bildirmişlerdir. Geliştirilen bu anter kültürü tekniği, biber (Sibi ve ark., 1979; Dumas de Vaulx ve ark., 1981; Abak, 1983), patlıcan (Chambonnet, 1985) gibi birçok sebzede ıslah programlarında kullanılır duruma gelmiştir.
Cucurbitaceae familyasına ait türlerde haploid bitki elde etmek amacıyla yapılan ilk çalışmalar ise 1950’lerde başlamıştır. Hayase (1954), türler arası melezleme yönteminden yararlanarak Cucurbita maxima Duch. ex Lam. çiçeklerini, Cucurbita moschata Duch. ex Lam. çiçek tozları ile tozlayarak kışlık kabakta haploid bitkiler elde etmiştir. Swaminathan ve Singh (1958), X ışınları uygulanan tohumdan elde edilen diploid karpuz bitkisi üzerinde tek bir haploid kol gelişimi gözlemlediklerini belirtmişler, elde edilen haploid bitkinin şaşırtma sonrası gelişimi ise başarısız olmuştur.
Aalders (1958), hıyarda (Cucumis sativus L.) haploid bitki elde etmek amacıyla, hasat ettiği olgunlaşmamış meyvelerin tohumlarını suda yüzdürme yöntemini uygulayarak su üzerinde kalan hafif tohumların embriyolarını kültüre almış ve 13 adet haploid hıyar bitkisi elde etmiştir. Cucurbitaceae familyasının ilk monoploid özelliği taşıyan bu bitkilerinin 8 tanesi büyütülebilmiş ve kolhisin uygulanarak diploid hale getirilmiştir. Fakat bu bitkilerden yeni bireyler elde edilememiştir.
Gürsöz (Sarı) (1990)’ün bildirdiğine göre Dumas de Vaulx (1979), kavunu (Cucumis melo L.) (2n=24), Cucumis ficifolius (2n=4x=48) ile tozlayarak türler arası
melezlemeler yapmıştır. Polenlerin çim borusu gelişimini uyartmak amacıyla, stigmalarını yüzeysel olarak bistüri ile kesip dişi çiçekleri kavun polenleri ile tozlayarak meyveler elde etmiştir. Tozlama sonucu elde edilen meyvelerin tohumlarından melez bitki elde edilememiştir ve oluşan bitkilerin gelişimlerinde sorunlarla karşılaşılmıştır. Bitkilerde kromozom sayımları yapıldığında haploid yapıda oldukları ve haploid oranlarının ise ilkbahar aylarında % 0.284, sonbaharda ise % 0.070 olduğu tespit edilmiştir.
Dryanovska ve Ilieva (1983), kavunda (Cucumis melo L.) organogenesis ve haploid bitki elde edebilmek için androgenesis ve gynogenesis yöntemlerini kullanmışlardır. Araştırıcılar, ovülleri plasenta ile kültüre alarak kallus oluşturmuş ve ovül kültürü neticesinde bir adet haploid bitki elde etmişlerdir.
Zhang ve Rhodes (1992)’un bildirdiğine göre, Xue ve ark. (1983), frekansı düşük olmasına rağmen anter kültürü ile karpuzda haploid bitkicikler elde ettiklerini ve bu bitkicikleri başarıyla diploid bitkilere dönüştürdüklerini bildirmişlerdir.
Anterler tek çekirdekli aşamada, 5 mm çapta ve çiçek tomurcukları açık taç yapraklara sahip iken toplanmıştır. Kallus oluşumu 2 ppm BA, 2 ppm kinetin, % 3 sakkaroz ve % 0.6 -0.7 agar içeren pH 5.8’lik MS ortamında sağlanmıştır.
Organogenesis ise agar ile katılaştırılmış 5-10 ppm GA₃, 4 ppm BA, 30-40 ppm adenin ve 500 ppm laktalbümin hidrolizat içeren MS ortamında sağlanmıştır.
Organogenesis farklılaşması ve sürgün oluşumunun 2 ppm triaconital içeren agar bazlı besi ortamında meydana geldiğini ve kök oluşumunun ise 0.2 ppm IBA, 1 ppm IAA ve % 1.5 sakkaroz içeren pH 5.7’lik MS besi ortamında oluştuğunu rapor etmişlerdir.
Kumar (1984), iki kabakgil türü Luffa cylindrica ve Trichosanthes dioica Roxb.’da olası kallus oluşum ve farklılaşmalarını araştırmak amacıyla anter kültürü yapmıştır. Araştırmacı, kültüre alınan anterlerden direkt ya da indirekt olarak kök ve embriyo elde ettiğini, araştırması sonucunda oluşan köklerden üçünün, embriyolardan ise birinin haploid olduğunu bildirmiştir.
Chambonnet ve Dumas de Vaulx (1985), kabakta (Cucurbita pepo L.) döllenmemiş ovülleri in vitro kültüre alarak embriyo kesesi hücrelerinden haploid bitkiler elde etmişlerdir. Araştırıcılar, uygun in vitro koşullar altında kültüre alınan
ovüllerden elde ettikleri embriyoları bitki oluşturmaya başladığında hormonsuz besin ortamına transfer etmişlerdir. En yüksek sonuçlar antezisten 1 veya 2 gün önce henüz döllenme olmadan elde edilen ovüllerin kullanılmasıyla elde edilmiştir ve 100 ovül başına 4-7 arasında bitki oluşumu gerçekleşmiştir. Bitkilerin çoğunluğunun diploid, bazılarının haploid-diploid kimera, aneuploid veya poliploid olduğu saptanmıştır.
Diploid bitkilerin genetik analizi sonucu yapılan karşılaştırma sonucunda ana bitkiye benzemeyen 8 heterozigot F1 bitki gözlenmiştir. Rejenerasyona uğramış F1
bitkilerinin her biri farklı fenotipik özellikler göstermişlerdir.
Sauton (1987), ticari bir F1 kavun çeşidini normal kültür koşulları altında serada yetiştirerek kendileme yapmış, daha sonra ovaryumları tozlanmadan 5 gün sonra toplamıştır. Birkaç damla Tween-20 damlatılmış olan % 10’luk kalsiyum hipoklorit solüsyonunda 10 dakika yüzey sterilizasyonu yapılan ovaryumları, saf su ile 3 kez çalkalayarak içerisinde nemlendirilmiş filtre kağıtları bulunan petrilere aseptik koşullarda aktarmıştır. Plasenta dokuları dikkatlice uzaklaştırılan ovülleri 20 g/l sakkaroz + 10 g/l agar ilave edilen MS ortamında kültüre almıştır. Kültür tarihinden 3-4 hafta sonra ovüllerin çimlendiği, sonraki 4 hafta sonunda da oluşan bitkilerin toprağa şaşırtılacak duruma geldiğini gözlemlemiştir.
Shail ve Robinson (1987), kapakta yaptıkları türler arası melezleme çalışmalarında, Cucurbita pepo cv. Black Jack ile C. ecuadorensis’i tozlamışlardır.
Tozlanmadan 24 ile 72 saat sonra izole edilen ovüllerin besin ortamına aktarımlarının ardından kallus ve kök oluşturduklarını, ancak bitkiye dönüşümün gerçekleşmediğini bildirmişlerdir.
Kwack ve Fujieda (1988), Cucurbita moschata’nın döllenmemiş ovüllerini in vitro kültüre alarak haploidi uyartımını incelemişlerdir. Araştırıcılar, antezis safhasında alınarak 2 gün 5 ⁰C’de ön sıcaklık uygulanan ovaryumlardan alınan ovüllerin 30 g/l sakaroz içeren MS ortamı üzerinde kültüre alınmasının en iyi sonucu verdiğini ve ovüllerden % 17’sinin embriyo oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu embriyoların uygun bir ortama transfer edildiğinde çoğunun kallus oluşturmaya yöneldiğini ve anormal morfolojik gelişmeler gösterdiğini, sadece birkaç tanesinin normal sürgün ve kök verdiğini izlemişlerdir. Bu araştırma ile elde edilen 3 bitkiden birinin diploid (2n=40), ikisinin ise tetraploid olduğu saptanmıştır.
Sarı ve ark. (1994), tarafından “Crimson Sweet”, “Halep Karası”, “Sugar Baby” ve “Panonia F1” karpuz çeşitlerinde ışınlanmış polenlerle uyartım yoluyla toplam 761 adet partenokarpik embriyo elde edilmiştir. En yüksek embriyo oranının
“Halep Karası” çeşidinde olduğunu, bitkiye dönüşüm oranlarının ise çok düşük seviyede kaldığını belirten araştırıcılar, in vitro kültür sonrası 17 adet bitki elde ettiklerini bildirmişlerdir. Yapılan sitometrik incelemeler (flow sitometri) sonrasında elde edilen tüm bitkilerin haploid olduğu saptanmış ve kolhisin kullanarak katlanmış haploid hatlar üretilmiştir.
Gémés ve ark. (1996), kabakta döllenmemiş ovaryumları 2-3 cm uzunluğa ulaştığında (çiçek açımından önce) toplayarak yüzey dezenfeksiyonundan sonra, ovaryumların dış kabuklarını soyarak dilimleyip in vitro kültüre almışlardır.
Eksplantlar, başlangıçta TDZ ve % 4 sakkaroz ilave edilmiş, daha sonra da NAA ve BA’nın farklı bileşimleri kullanılmış EI ortamına transfer edilmiştir. Yaklaşık 6 hafta sonra ovüllerden embriyoların oluştuğu ve her bir ovaryumdan yaklaşık 10-15 embriyo oluştuğu gözlenmiştir. Araştırma sonucunda elde edilen bitkiciklerin kromozom sayısı ölçümlerinde, % 70’inin haploid, % 30’unun katlanmış haploid ve aneuploid olduğu saptanmıştır.
Metwally ve ark. (1998a), kabak bitkisinin ovaryumlarını antezisten 1 gün önce toplayarak 0, 2, 4 ve 8 gün süre ile +4 oC sıcaklıkta tutmuşlardır. Araştırıcılar daha sonra ovülleri çıkararak 30 g/l sakkaroz, 8 g/l agar ve 2,4-D’ nin 0.1, 1.0, 5.0 ve 10 mg/l’lik 4 farklı konsantrasyonunun eklendiği MS ortamında kültüre almış ve 25±1⁰C sıcaklık ve 16 saatlik ışık periyodunda 4 hafta bekletmişlerdir. Bu süre sonunda ovüller büyüme düzenleyici madde içermeyen MS ortamına transfer edilmiştir. Kültüre alınan 100 ovülden elde edilen bitki sayısı dikkate alındığında en fazla bitkinin, soğuk uygulaması yapılmayan ovaryumlardan çıkarılan ve 1 veya 5 mg/l 2,4-D eklenen MS ortamında kültüre alınan ovüllerden elde edildiği bildirilmiştir.
Gémés ve ark. (2002), 5 partenokarpik hıyar ıslah hattı (7D4C, KS0C, D20F2A5, E10D14, Perez ML) (ana ebeveyn) ve bir hibrit çeşit (Perez F1) kullanarak ovaryum kültürü yapmışlardır. Araştırıcılar donör bitkileri sera koşulları altında yetiştirilen bitkilerden döllenmemiş ovaryumları tam çiçeklenmeden 3 gün
önce, 6 saat önce ve tam çiçeklenme döneminde toplayarak in vitro kültüre almışlardır. Araştırmada her genotipte 150 ovaryum test edilmiştir. Rejenerasyon ortamına (CBM) 0.02 mg/l TDZ ve % 4 sakkaroz ilave edilmiş, kültürler karanlıkta 24 oC, 28 oC veya 35 oC sıcaklıklarda inkübe edilerek 2 ile10 gün süre ile kültüre alınmıştır. Ovaryumlar 0.05 mg/l NAA, 0.2 mg/l BA ve % 3 sakkaroz ilave edilen rejenerasyon ortamına (CBM) transfer edildikten sonra 26 oC’de, 16/8 saat (aydınlık/
karanlık) ışık rejimine tabi tutulmuştur. Araştırıcılar çalışma sonucunda en fazla embriyonun 35 oC sıcaklık uygulamasından elde edildiğini, ovaryum başına elde edilen embriyo oranının en fazla % 18.4, bitki oranının ise % 7.1 olduğunu bildirmişlerdir.
Kumar ve ark. (2002), Calypso ve Green Long hıyar çeşitlerinde büyüme düzenleyicilerin ve anterlere uygulanan sıcaklık ön-muamelelerinin in vitro anter kültürüne tepkilerini incelemişlerdir. Optimum embriyojenik kallus/embriyo oluşumu 2.0 mM 2,4-D (2,4-diklorofoneksiasetik asit) ve 1.0 mM BAP (benzilaminopürin) kombinasyonlarından sağlandığı görülmüştür. Çiçek tomurcukları 4 oC’de 0-10 gün ve 32 oC’de bir gün boyunca ön-muameleye sokulmuş, en iyi sonucun 4 oC sıcaklıkta, 2 gün boyunca bekletilenden alındığı bildirilmiştir. Embriyo farklılaşması 0.09 sakkaroz, 0.25 mM NAA (naftalin asetik asit) ve 0.25 mM (kinetin) içeren B5 ortamında, embriyo gelişmesi ise 5.0 mM ABA (absisik asit) içeren ortamda gerçekleştirilmiştir. Embriyolardan bitkiciklerin oluşumu 0.09 M sakkaroz içeren B5 ortamında sağlanmıştır. Ploidi seviyelerinin analizi için her çeşitten 24 bitkiciğin kök uçları kullanılmış, Calypso çeşidinde 21 ve Green Long çeşidinde 17 haploid bitki elde edildiği bildirmiştir.
Mohamed ve Refaei (2004), yazlık kabak (Cucurbita pepo L.) “Eskenderany”
çeşidinde yaptıkları çalışmada donör bitkinin farklı ekim sezonu ve tarihlerinin anter kültürüne etkilerini incelemişlerdir. Kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonundan en iyi yanıt, 1 Mart’tan itibaren yaz süresince ve 1 Kasım’dan itibaren kış süresince yetişen bitkilerden elde edilmiştir. Kış sezonu zarfında yetişen bitkilerden sağlanan anterlerdeki kallus oluşum ve bitki rejenerasyon düzeyinin yaz sezonundakilerden oldukça fazla olduğunu belirten araştırıcılar, rejenerantların yaklaşık % 60’ının ise haploid yapılı (2n = X = 20) bitkilerden oluştuklarını saptamışlardır.
Yılmaz Ergin (2005), haploid embriyo ve bu embriyolardan bitki elde etmek amacıyla kabakta (Cucurbita pepo L. ) ovaryum kültürü yapmıştır. “Sakız” ve
“Zeybek F1” kabak çeşitlerinin, antezisten 1 gün önce, antezis döneminde ve antezisten 1 gün sonra alınan döllenmemiş ovaryumları 4, 6, 8 dilime bölünerek, farklı miktarlarda TDZ (0.01, 0.1 ve 1 mg/l) eklenen bitki besi ortamına (CBM) transfer edilmiştir. Embriyo teşvik ortamının karanlık koşullarda yaklaşık 3 hafta inkübe edildiği ve yalnızca 0.1 mg/l TDZ ilave edilen CBM ortamında antezisten 1 gün önce ve antezis döneminde alınan ovaryumlarda embriyo oluşumu gözlendiği açıklanmıştır. Araştırıcı ikinci bir deneme olarak enine disk şeklinde ve boyuna dilim şeklinde kesilen ovaryumları embriyo teşvik ortamına transfer etmiştir, gelişme gösteren ovüller NAA ve BA’in farklı konsantrasyonlardaki kombinasyonlarını içeren rejenerasyon ortamına aktarılmıştır. Transfer edilen ovüllerin bazılarında şişme şeklinde gelişime görüldüğü, ancak bitkiye dönüşümün gerçekleşmediği bildirilmiştir.
Shalaby (2007), kabakta in vitro ginogenesis indüksiyonu üzerine genotipin, gövde üzerindeki dişi çiçek pozisyonlarının, sıcaklık uygulamalarının ve sakkaroz konsantrasyonlarının etkilerini araştırdığı; dört farklı deneme gerçekleştirmiştir. İlk denemede 12 farklı genotipten antezisten 1 gün önce toplanan dişi çiçeklerin ovülleri 2,4- D ve kinetinin her birinden 1 mg/l ve % 3 sakkaroz içeren MS besi ortamında kültüre alınmıştır. İzole edilen ovüllerde ginogenesise en iyi tepkiyi “Raad F1” çeşidi göstermiştir. İkinci denemede, iki farklı genotipin (Giad F1 ve Raad F1) ovülleri ana gövde üzerindeki birinci, ikinci ve üçüncü nodlarda oluşan dişi çiçeklerden elde edilmiş ve ilk denemede tanımlanan besi ortamına aktarılmıştır. Petri başına en yüksek ovül yüzdesi ve bitki oluşum miktarı, ikinci nodlarda oluşan çiçeklerden kaydedilmiştir. Üçüncü denemesinde “Queen F1” çeşidinden ayırdığı ovülleri 4oC ve 32 oC’de 0, 4, 7 ve 14 gün süresince inkübe eden araştırıcı, 4 oC ve 32 oC’de 4 gün uygulanan sıcaklık şoklarının embriyojenik ovül oluşumunu arttırdığını tespit etmiştir. Son olarak “Eskenderany” çeşidi ile yaptığı çalışmada üç farklı sakkaroz dozunun (30, 60 ve 90 g/l) ovül kültürüne etkilerini incelemiştir. En iyi sonucun 30 g/l sakkaroz eklenen MS besi ortamından alındığını ve 90 g/l sakkaroz içeren MS besi ortamında ise ginogenik ovüllerin oluşmadığını bildirmiştir. Denemeler
sonucunda elde edilen bitkilerin köklerinde yapılan kromozomik incelemelerde, bitkilerin % 65’inin haploid olduğu açıklanmıştır.
Suprunova ve Shmykova (2008), hıyarda in vitro ovül, anter ve mikrospor kültürlerinden elde edilen haploid bitki verimini arttırmak amacıyla, genotip, bitki büyüme düzenleyicilerin konstrasyonu, çiçek tomurcuğu uzunluğu ve mikrosporların gelişim evresinin etkilerini araştırmışlardır. İncelenen büyüme düzenleyiciler arasından, ginogenesis indüksiyonu için en uygun konsantrasyon 0.2 mg/l thidiazuron (TDZ) olarak bulunmuştur. Ovülleri kültüre alınan genotiplerden yalnızca “Gordion” çeşidinde haploid bitki elde edilmiştir. Araştırıcılar yaptıkları sitolojik incelemeler sonucunda, androgenesis aracılığıyla haploid bitki eldesi için geç tek çekirdekli ve erken biselüler evredeki mikrosporları içeren, 6 mm’den daha uzun çiçek tomurcuklarının en uygun aşama olduğu sonucuna varmışlardır. Elde edilen embriyojenik kallusların anter kültüründe somatik hücrelerden, mikrospor kültüründe ise polen tanesinin vejetatif hücrelerinden oluştuklarını belirlemişlerdir.
Diao ve ark. (2009), tarafından hıyarda 35 oC’de sıcaklık ön uygulama süresinin, TDZ ve AgNO3 konsantrasyonlarının ovaryum kültüründe embriyo oluşumuna etkilerini araştırmışlardır. Kültür başlangıcında uygulanan 35 oC’de 3 günlük sıcaklık şoku en yüksek embriyo oluşum frekansı ile sonuçlanmıştır. TDZ’nin embriyo oluşumunda olumlu etkiye sahip olduğunu bildiren araştırıcılar, en yüksek embriyo oluşum sıklığını (% 72.7) 0.04 mg/l TDZ eklenen indüksiyon ortamında elde ettiklerini bildirmişlerdir. Gümüş nitratın embriyo oluşumuna herhangi bir etkisinin olmadığını, fakat oluşum süresini kısalttığını açıklamışlardır. Denemede kullanılan genotipler arasında belirgin bir farka rastlanmamıştır. Elde edilen 40 adet rejenere bitki arasından iki bitki haploid (2n = x =7), beş bitki tetraploid (2n = x=
28), geri kalanı ise diploid olarak belirlenmiştir. Mikrosatellit markırlar (SSR) diploid bitkilerdeki homozigotluğu araştırmak için kullanılmıştır. Elde edilen 17 bitkinin spontan dihaploid olduğu tespit edilmiştir. Çalışma sonuçlarına dayanarak, hıyarda ovaryum kültürünün DH hatların üretimi için kullanışlı bir yöntem olduğu tespitine varılmıştır.
Gürsoy ve ark. (2012), ovül ve ovaryum kültüründe haploid embriyo elde etmek için yaptıkları çalışmalarında, “Halep Karası” karpuz çeşidinin döllenmemiş
ovaryumlarını antezisten 1 gün önce, antezis döneminde ve antezisten 1 gün sonra toplamışlardır. Steril koşullarda ovaryum kültürü için yumurtalıklardan dilimlenerek elde edilen eksplantları ve ovül kültürü için ise ovaryumlardan izole edilen ovülleri 1mg/l TDZ, 1 mg/l SPM (spermin), 1 mg/l TDZ + 1mg/l SPM eklenen iki farklı besi ortamında (CBM ve MS) kültüre almışlardır. Kültürler 25-26 oC’de, 16/8 saat aydınlık/karanlık periyodunda 8 hafta süresince inkübe edilmiştir. Rejenerasyon gösteren ovülleri ve ovaryum eksplanlarını bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen MS ve CBM ortamlarına transfer etmişlerdir. Ovül kültüründe en yüksek rejenerasyon yüzdesini (% 2.5) antezisten 1 gün sonra toplanan dişi çiçeklerde, 1 mg/l TDZ + MS ve 1mg/l SPM + CBM besi ortamlarından elde ettiklerini, ovaryum kültüründe ise en yüksek rejenerasyon yüzdesini (% 10) antezisten bir gün sonra toplanan dişi çiçeklerde, 1 mg/l TDZ + MS besi ortamında sağlandığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar ovaryumlardan rejenere olan tüm karpuz bitkilerinin (10 adet) diploid yapılı olduklarını tespit etmişlerdir.
Rakha ve ark. (2012), kabakta anter ve ovül kültürü yapmışlardır. Ovül kültüründe genotipin, 2,4-D konsantrasyonlarının ve soğuklama uygulamalarının etkilerini incelemişler, sonuç olarak 4 oC’de 7 veya 14 gün soğuğa maruz bırakılan, besi ortamı içeriğinde 5 mg/l 2,4-D içeren uygulamadan en yüksek rejenere bitki yüzdesi (% 25.33) ve ovül başına bitki miktarını elde etmişlerdir. Anter kültüründe ise 4 oC’de 4 gün soğuklama uygulanan anterlerin genotipe, besi ortamının sakkaroz (50, 120, 90, 150 g/l) ve 2,4-D (1 ve 5 mg/l) içeriklerine verdikleri tepkileri incelemişler, sonuç olarak en olumlu yanıtı 90 g/l sakkaroz ve 1 mg/l 2,4-D konsantrasyonlarının verdiğini, ayrıca ovüllerden elde edilen bitkilerin % 60’ının ve anterlerden elde edilen bitkilerin % 50’sinin haploid olduklarını rapor etmişlerdir.