A.
U.
Veteriner Fakültesi Viroloji Kürsüsü Prof ])r. Selahattin CarilirkANKARA'DA BİR AT BİRLİGİNDE ATLARıN
RHİNovİRUSUNA (NM1 i SUŞU) KARŞI ANTİKOR
DAGILJMI ÜZERİNDE SEROLOJİK ÇALJŞMALA!t
İbrahim Burgu>1<
Serologische Untersu~hungen auf das Vorkommen von
Antikörpe:;:-gegen den equinen Rhinovirus (Stamm NM1ı )
bei einer Pferdebestand in Ankara
Zusa.mmenfassung: Um die neutralisierende Antikörper gegen den
equiner. Rhino7}irus bei PferGen in einer PJerdebestiind in Ankara
festzustel-len wurden i00 Serum proben entlwmmen und mit der
ivlikroneulmlisationmet-hode alil neulralisierende Antikörper untersucht. Aus 100 Seren waren 15 (I 5
%)
Serum proben positiv und der Neutralisationtiter bei der Positiven waren ;:.wisc1zenden 1/3.98-1/37.2.Özet: Ankara' da bir at birliğinde bulunan atlarda Rhinovirus equi'ye kar,ıı nötralizan antikorlann varlığını saptamak amaa ile 100 adet serum
nu-munesinde mikronötralizasyon testi ile nötmlizan antikorlar arandı. 100
se-rumdan 15 i (% IS) pozitif bulundu. BiL pozitif serumlar 1/3. 98-ı 137.2 arasında nötrali<aS)'o'1.tilresi verdiler.
Giriş
Soğuk algınlıklarının etkenleri üzerinde uzun yıllar araştırma-lar yapılmıştır. tık defa 1960 yılında yapılan bir çalışmada bu tür hastalıkların etkeni olarak bir virus izole edildiği bildirilmiştir (21). Daha sonraları bu çalışma sonuçları bazı ara~tırıeılar tarafından da onaylanmıştır (8). S o li.lllUm yollarında enfeksiyonlar meydana
ge-tiren viruslardan biri de rhinoviruslar olup bu viruslar üzerinde
Ankara'da Bir At Birliğinde Atlann ... 95
~itli ara~tırmalar yapılmıştır (4, 6). Atların rhinovirusları ilk defa Ig62 yılında Plummer (15) tarafından İngiltere'de izole edilmiştir. Çeşitli araştırıcılarda değişik ülkelerde atlardan rhinovirusları izole etmeyi başarmışlardır (3, 7, 17,22). Plummer (15) İngiltere'de Well-eome ara~tır~a enstitüsü laboratuvarlarında yaptı,ğı bir çalışmada' 13/ at gaitasından maymun böbrek hücre kültürlerinde bir virus izo-le etmiş ve yaptığı denemeizo-ler sonunda bu virusu "equine respiratory virus" olarak identifiye ('tmi~tir.
Ditehfieldt ve MacPherson'da (7) Ig65 yılında Kanada'da so-lunum sistemi hastalığı gö~teren atlardan iki ayrı rhinovirus izole etmişlerdir. Araştırıcılar bu scrotipler arasında uyguladıkları çap-raz nötralizasyon testleri sonunda bu tipleri serotip i ve serotip 2
ola-rak isimlendirmişlerdir. Serotip 2 bugüne kadar başka bir yerde izo-le edilmemi~tir. Ig63 yılında Wilson, Bryans, DoII ve Tudor (22) A-merika Birlqik Devletleri'nde Kentueky'de atlardan izole ettikleri rhinovirus suşunu serotip i. olarak saptamı~lardır. BurrO\vs (5)
İn-giltere'de Ig67 yılında nafif solunum yolu enfeksiyonu gösteren üç genç attan NM11 rhinovirus suşunu izole etmiş ve bu suşu özellikleri nedeni ile serotip i olarak saptamıştır. Becker, KeIIer ve Teufel (3)
Batı Almanya'da Berlin'de yaptıkları bir çalışmada atlardan rhino-virus izole etmişler ve HEROS adını verdikleri bu su'şu özellikleri nedeni ile scrotip i olarak saptamışlardır.
Rhinovicus equi Picoma viruslar grubuna dahildir (15). Virus ribonükleik asit kapsar. Ultrasantrifüj ve phcsphotungustat ile ya-pılan negatif kontrastlı elektronmikroskop çalışmalarında virusun büyüklüğü 25-3° milimikron olarak ölçülmüştür (15, 18). Rhinovi-rus equi morfolojik olarak Polio viru5Una benzer ve basit bir kübik simetri gösterir (7, 15)' Virion'tin yoğunluğu Cesiumchlorid (CsClı)
ile yapılan ölçümlerde 1.40 g(mI. (rs) ile 1.45 g(mI. (18) olarak sap-tanmıştır. Enteroviruslarda ise bu yoğunluk 1.34 g (mL. dir. Virusun sakkarozdaki sedimentasyon gücü 160 S dir (21).
Rhinovirus equi etere, kloroforma ve fluorokcırbona (CıCI3FJ dayanıklıdır (15, r8, ıg). ısıdan kolayca etkilenmez. so°C'da çok az bir enfeksiyözite kaybı gösterir (2, 15, 18). Bütün rhi!10viruslarda ol-duğu gibi rhinovirus equi'de asite dayanıksızdır. Enterovirusların aksine pH
2-5
değerlerinde kolayca inaktive olur (21).Rhinovirus equi'nin hemaglütinasyon ve hemadsorbsiyon özel-liği yoktur. Bugüne kadar çeşitli eritrositlerle (insan, maymun, ke-i
96 İbrahim Bıirgu
di, köpek, at, öküz, rat, gelincik, kobay ve civciv) yapılan testler olum-suz sonuç vermiştir (rs, r8).
Rhinovirus equiJnin invitro üretilmesinde çeşitli kültürler kullanıl-mıştır. Araştırıcıların gözlemlerine göre virus diğer rhinovirusların aksine 37°C da gayet iyi üremektedir (özellikle insan rhinovirusları 33°C'da üremektedir) (3). Yapılan çalışmalarda virusun at, maymun, tavşan, köpek, hamster böbrek kültürlerinde ve devamlı kültürlerden de MS-2ı, LLC-MKı (r3), Hep-2 ve Hela kültürlerinde üredtği
bil-dirilmiştir (r, 3, ro, rs). Deneme hayvanlarında yapılan deneysel enfeksiyon çalışmalarından başarılı sonuçlar alınamamıştır (IS, 22,) Ancak dencme hayvanlarından immun serum elde edilmesinde yarar-lanılmıştır (2, ıs).
Atlar üzerinde çeşitli araştırıcılar deneysel enfcksiyon çalışmala-rı yapmışlardır (IS, 16). Bu araştırmalar sonunda, intranasal inoku-lasyonda inkubasyon süresinin 2-3 gün olduğu saptanmıştır.
Enfeksiyon üst solunum yollarında kataral bir yangı ile başlar. Hayvanlarda sulu tabiattan mukopurulcnt karektere kadar değişen bir burun akıntısı vardır. Aynı zamanda lenf yumrularında şişmcler görülür. Kısa süreli kuru olmayan bir öksürük bulunur. tık hasta-lık haftasının sonunda viremi meydana gelir ki bu viremi devri 4° °CJ ın üstüne kadar çıkan bir atcşle kendini belli eder. Ateşli dönem yak-laşık 4-5 gün kadar sürer ve nötralizan antikorların oluşması ile son bulur (7, 16, ıg).
/' Rhinovurius equi'nin serolojisi üzerinde çeşitli araştırıcılar çalış-mışlardır (7, IO, 17, ıg, 20). Teufcl ve Keller (ıg) 71 at serumu ile
yaptıkları nötralizasyon testi sonucunda 63 serumda
(%
88) yüksek titrede antikor varlığı saptamışlardır. Ditchfieldt ve MaePherson (7) nötralizasyon testi ile'rhinovirus equiJye karşı ı /4-ı /ı024 değerleri arasında antikor bulmuşlardır. Studdertve Gleeson (ı 7) AvustralyaJda 355 serum ile yaptıkları bir çalışmada rhinovirus equi scrotip ıJe karşı%
47.9 oranında pozitifseruma rastlamışlardır. Finci (ro) pasif hemoliz testi yardımı ile spesifik antikorların varlığını saptamıştır.Rhinovirus equi'nin plak karakterleri üzerinde de araştırıcılar durmuşlardır (ı, ı8). Araştırıcılar çalışmaları sonunda plakların 6-7 ci günlerde oluştuğunu, küçük yapıda, düzensiz karakterde plak-ların meydana geldiğini tesbit etmişlerdir (r, 18). Diğer taraftan Studdert ve Gleeson (ı8) rhinovirus equi ile floresans seroloSi çalış-maları da yapmışlardır.
Ankara'da Bir At Birliğinde Atlano ..• 97
Yurdumuzda atların rhinovirusları ile ilgili tck çalı~ma Ate~ (ı) tarafından yapılmı~tır. Ara~tırıcı bu çalı~masında Rhinovirus equi NMll (serotip i) su~unun MS-2i hücre kültürlerinde
plakformasyon-ları üzer!nde çalı~mı~tır.
Bu ara~tırmada Rhinovirus equi'nin ülkemizde ilk kez serolo-jik olarak epidemiyolojisinin incelenmesi amaçlanml~tlr. Bu nedenle de bir ahır enzootisi ~eklinde seyreden bu hastalığın scrolojik çalı~-ması toplu bir at birliği olan Cumhurba~kanlığı Muhafız alayına bağlı süvari birliğindeki konkur ve süvari atlarında yapılmı~tlr.
Materyal ve Metot
Virus: Ara~tırmamızda Rhinovirus equi'nin NMıı (scrotip ı)
su~u kullanıldı. Su~ Serbest Berlin üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Enstitüsünden sağlandı.
Serumlar: Araştırmada serum nötralizasyon testi ilc serol~jik
de-ğerlendirmeye konulan serumlar Cumhurba~kanlığı Muhafız ala-yına bağlı süvari birliğindeki süvari ve konkur atlarından alındı. Bu amaçla 100 adet serum numunesi kullanıldı. Alınan serum numu- i
neleri serolojik uygulamadan önce 56°Ç'da su banyosunda go daki-ka inaktive edildi ve 5 X antibiyotik (I 00 lE penisilin ImI., 1O0 ga-ma streptomisin ımı' ve 0.005 mg. kanamisin ImI.) katılıp oda de-recesinde iki saat bekletildi, daha sonra sterilite kontrolları yapılıp kullanılana kadar -20°C'da saklandı.
MS-2 ı devamlı hücre kültürü: Gerek virus üretmek amacı ile ve
gerekse nötralizasyon testinde MS-21 hücre kültürleri kullanıldı. Hücre üretme vasatı olarak
%
10 inaktif dana serumu ve antibiyo-tik kapsayan Hanks vasatı (I 2) kullanıldı.Virus üretilmesi: Rhinovirus equi NM" (scrotip I) su~unu
çoğalt-mak amacı ilc MS-2ıhücre kültürlerine ekimler yapıldı. Virus üretil-mesinde vasat olarak serumsuz, antibiyotikli Earle vasatı (g) kul-lanıldı ve üretme i~lemi g7°C'da uygulandı. Ekimi izleyen 48 inci saatte mikroskop altında yapılan kontrollarda MS~2ı hücre kültür-lerinde
%
80-go oranında sitopatolojik effektin (CPE) görülmesi üzerine viruslu hücre kültürü ~i~cleri etüvden alınarak derin dondu-rucuda donduruldu. Daha sonra çözdürülen viruslu materyal gooo devirde go dakika santr~füje edildi ve küçük porsiyonlar halinde -60 oC' da saklandI.98 İbrahim Burgu
Virusun mikrotitrilfYon yöntemi ile tıtresinin tesbiti: Kötralizasyon testinde kullanılacak olan virusun enfeksiyözite gücü Fr('y ve Liess' in (ıı) bildirdikleri mikrotitrasyon yöntemi ile saptandı. Virus phos-phat Puffer solüsyonu (PBS) içinde log. LO tabanına göre sulandırıl- ,_
dı. Her sulandırma basamağı için mikrotitrasyon tablasından altı göz kullandı. Gözlere her bir sulandırma basamağından o. ı mL. ko-nuldu. Gözlerdeki virus sulandırmaları üzerine özel pipet. yardı-mı ile 0.05 mL. hücre (3.0 X 105 hücreımı.) damlatıldı. Mikrotitras-yon tablasının üzeri ,toksik etkisi olmayan özel yapıştırıcı bant" ile örtülerek 37°C'da inkubasyona kondu. Hergün doku kültürü mikros-kobu ile, hücrede meydana gelen sitopatolojik değişiklikler kontrol edilerek 3 üncü gün sonunda sonuçlar Kaerber'e (14) göre hesapla-narak virusun titresi saptandı.
MikronötralizafYon testi: Toplanan kan serumlarında Rhinovi-rus e4ui'ye. karşı antikor olup olmadığını araştırmak için bu test uy-gulandı. Kontrolu yapılacak olan kan serumları deney tüplerinde PBS ile 112 oranında sulandırıldı. Bu sulandırmalar üzerine eşit miktarda titresi bilinen virustan (looDKtDso
=
ro2•0 ILO mL.) konuldu.Böylece 114 lük bir sulandırma elde edildi. Bu serum
+
virus karı-şımı 2 saat oda derecesinde tutulduktan sonra mikronötralizasyon tablasındaki gözlere 0.1 mL., konuldu. Her serum numunesi için 4 göz kullanıldı. Daha sonra bütün gözlere özel pi pet yardımı ile MS-21 hücre süspansiyonundan (3.0 X 105 hücreımı.)
damlatıldı. Tabla-nın üzeri özel şeffaf bant ile örtülerek 37 oC lik etüve kardırıldı. Do-ku kültürü mikroskobu ile yapılan muayenelerle sonuçlar 3 üncü günde meydana .gelen sitopatalajik effekte göre değerlendirildi.Pozitif serumların serum nötralizafYon değerlerinin (SNso) tesbiti: Mik-ronötralizasyon testi uygulaması sonunda 114 lük sulandırma da pozitif çıkan 15 serum numunesindeki antikor titreleri yine mikro-nötralizasyon yöntemi ile saptandı. Pozitif serumlar PBS içinde 1/2
sulandırıldı.. Bu sulandırılan serumlardan sıra ile mikronötralizas-yon tablasında ilk sıradaki 4 adet göze 0.1 mL. konuldu. tık sıradaki gözleri izleyen sıradaki gözlere özel pi pet ile serumsuz Earle vasa-tından 0.05 mL. damlatıldı. Daha sonra özel mikrosulandırıcılar yar-dımı ile en üst sıralarda bulunan serum sulandırmalarından başla-mak ve alttaki gözlere 0.05 mL. taşıbaşla-mak suretiyle serumlar 1/512 ye kadar sulandırıldı. Sulandırma işleminden sonra bütün gözlere
.Firma Grencr und Söhne, Nürtingen !württ. •• Cooke Engineering Company, Alcxandria, U.S.A.
Ankara'da Bir At Birliğinde Atlann ... 99
titresi bilinen virustan (100 DKİDso
=
IOM/1.0 mL.) özel pipetyardı-mı ile 0.05 mL. damlatıldı ve mikronötralizasyon tablasının üzeri ~effaf yapı~tırıcı bant ile örtülerek 2 saat oda derecesiAde bırakıldı.
Bu sürenin sonunda tablanın üzerindeki bant kaldırılarak her göze yine özel pipet yardımı ile MS-2ihücre süspansiyonundan (3.0 X ıos hücre /mI.) 0.05 mL.damlatıldı. Tablanın üzeri yeniden örtülerek 37°C' lık etüve kaldırıldı ve daha sonra mikroskop altında yapılan kont-roUarla 3 üncü günde pozitif serumlardaki antikor titrcIeri saptandı.
Sonuçlar
Virusıııı mikrotitrasyon yöntemi ile elde edilen titresi: Rhinovirus equi
NMtı (serotip i) su~unun MS-2i hücre kültürlerindeki
enfeksiyözi-te gücü DKİDso
=
104•0/1.0 mL. olarak saptandı.Şüpheli serumlarlf!, yapılan antikor taraması sOhu;lan:
Cumhurba~-kanlığı muhafız alayına bağlı süvari birliğindeki kofileur ve süvari atlarından alınan 100 adet kan serumunda Rhinovirus equi NM11 (serotip i) su~una karşı yapılan antikor taraması 'sonunda 15 adet serumda
(%
i5) bu virusa kar~ı nötralizan antikorların varlığıtes-bit edildi. Aynı zamanda pozitif sonuç veren bu hayvanların ya~la-rının iki ya~ından yukarı olduğu saptandı. Ayrıca bu hayvanların 5 adedinin Gemlik Askeri Harasından, 6 adedinin özel at yeti~tirmc çiftliklerinden veya ~ahıslardan, i adedinin Karacabey harasından
ve i adedininde Fransa'dan alındığı anlaşıldı (Tablo ı).
Tablo ı. 1/4 sulandırmada pozitif sonuç veren serumlar. Hayvanın adı Polat Yavuz Tayfun Çapkın Hakan Sema Laçin Lerzan Ejder Kosova Çilli Pamir Sabire Gül i Zeynep Doğum tarihi 1975 1974 1974 1975 1967 1975 1971 1969 1970 1972 1968 1974 1968 1974 Geldiği yer Gemlik Askeri Hara Şahıs
Şahıs
Gemlik Askeri Hara Gemlik Askeri Hara Gemlik Askeri Hara Şahıs
Gemlik Askeri Hara Fransa Şahıs Şahıs Şahıs Karacabey Harası Şahıs
100 İbrahim Burgu
Pozitif serumların SNso değerleri: Pozİtif sonuç veren i5 serumdaki
antikor titreleri (SNso) i13.98-1 137.2 değerleri arasında bulundu
(Tablo 2).
Tablo 2. Pozitif serumların antikor titreleri (SN,.).
Hayvanın adı Serum sulandırma
1/3.98 1/4.68 1/5.62 ı/9.33 ı/ı 1.2 ı/22.4 1/37.2 Polat
+
Yavuz+
Tayfun -i-Çapkın+
Hakan+
Sema+
Laçin Lerzan T, Ejdcr+
Kosova /+
Çilli+
Pamir -i-Sabire+
Gül i+
Zeynep+
--
--Toplam 2 6 i ı 2 2 i TartışınaCumhurba~kanlığı Muhafız alayına bağlı süvari birliğindeki konkur ve süvari atlarında Rhinovirus equi NM1 t (serotip i) suşuna karşı nötra1İzan antikor varlığını saptamak amacı ile yapılan bu ça-lı~mada 100 attan 15 inde
(%
LS) pozitif sonuç alınmı~tır. Diğer ül-kelerde bu konu ile ilgili yapılan çalı~malarda elde edilen pozitif se-rumlardaki nötralizan antikor düzeyleri bizim bulgularımızın üze-rindedir (7, lO, 17, ıg, 20). Diğer taraftan pozitif sonuç verenhay-vanların ya~larının iki ya~ından yukarı olması Plummer (15), Ditch-fieldt ve MaePherson (7).ve Teufel ve KellerJİn (ıg) bulguları ile uyum gösterrrii~tir.
Türkiye'de bu konuda serolojik bir çalışma yapılmamış olması bu çalışmada alınan sonuçların Türkiye'deki yarış atı ve konkur at-ları populasyonu bakımından bir değerlendirmesine olanak verme-mektedir. Ancak pozitif sonuç alınan hayvanların birliğe geliş yer-lerinin farklı olması, bu tür devlet kurumları ve sportif amaçlarla at yetiştirilen özel çiftliklerde bu hastalık yönünden araştırmaların yapılmasını ve bu hastalığa karşı korunma önlemlerinin alınmasını kanımızca zorunlu kılmaktadır. Hastalığın ahır personeline de bula-şabilmesi kuşkusuz üzerinde durulması gereken diğer önemli bir ko-nudur.
Ankara'da Bir At Birliğinde At1amı ...
Literatür
101
i - Ateş, M. (1979): Atların rlıinovirusunun plak formasyonları
üzerin-de araştırmalar. Doktora tezi. F.ü. Vet. Fak. pp 31.
2- Beeker, W. (1972): Die Komplementbindungsreaktion mit dem Equ-inen Rhinovirusstamm N Mııund ihre Eignung zur serologischen
Diag-nostik der Erkraııkung. Inaugural Diss. Berlin pp 45.
3- Beeker, W., ~eUer,
U.
und Teufel, B. (1974): Die Rhinovi-rus-infektion d{s Pferdes. BerI. Münch. tierarztI. Wschr. 87, 305-3°8.4- Bögel,~. and Böhm,U. (1962): Ein Rhinovirus des Rindes. ZentbL. Bakt. i Orig. 187, 2-14.
5- Burrows, R. (1968): Equine Rhinouiruses. Proc. 2nd Int. Conf. on Eguine Infectious Diseases. Paris Verlag S. Karger Basel
197°.
6- Bürki, B. (I 965): Picomaviruses of cats. Arch. ges. Virus forsch. r5, 692-696.
7- Ditehfieldt,
J.
and MaePherson, L. W. (1965): The properties and classifieation of two new rhinovıruses recoveredfrom horses in To-ronto, Canada. Cornell Vet. 55, 18r-189'.8- Ditehfieldt, W.
J.
B. (1969): Rhinovıruses and parainfluenza vi-ruses of horses.J.
Am. med. Ass. 155, 384-387.9- Earle, W. R. (1943): Production of malignaney in vitro. IV. The m,ousefibroblast cultures and changes in the living ceUs.
J.
natn. Cancer Inst. 4, 165-212.10- Finci, E. (1978): A passive haemQlysis test for the detection of anti-bodies of rhinovirus equi. Vet. Fak. Dcrg. Ankara Univ. XXV, 720-73°'
11- Frey, H. R. und Liess. B. (1971): Vermehrungskinetik und Ver-wendbarkeit einer stark zytopathogenen VD-MD Virusstammes für diagnostische Untersuehungen mit der Mikrotiter-Methode. ZentbL. Vet. Med. B 18, 6r-71.
12- Hanks,
J.
H. and WaUeee, R. E. (1949): Relation of oxygen and tempa-rature in the preservation of tissue by refrİgeration. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 112, 1°4°-1°5°.102 İbrahim Burgu
"
)
13- HuD, R. N., Cherry, W. R. and Tritch, O.
J.
(1962): Growth characteristics of monkey kidney eel! strains LLC-MKı and their utility in virus research.J.
Exp. Med. 115, 903-912.i4- Karher, G. (1964): In diagnostic procedures for virus and ricketsial disease. Pubı' Hlth. Ass. (New-York) 3, 48-50.
15- PIummer, G. (1962): A equine respiratory virus with enterovirus properti.s. Nature, s. 195, 519-520.
16- PIummer, G. and Kerry, J. B. (1962): Studies on\ the equine respiratory virus. Vet. Ree. 74., 967-97°.
17- Studdert, M. j. and GIeeson, L.
J.
(1977): Isolation of equine rhinovirus type ı. Aust. vet.J.
53, 452.18- Studdert, M. j. and GIeeson, L.
J.
(1978): Isolation and cha-racterisation of an equine rhinovirus. ZentbI. Vet. Med. V 25, 225-237. 19- Telifel, P. und KeDer, H. (1970): Das Vorkommen neutralisie-render Antikörper gegen dert equinen R/ıinovirusstamm NMıı in BerlinerPferdebestiinden. BerI. Müneh. tierarztI. Wschr. 23, 466-467. 20- TeufeI, P. (1977): Untersuchungen zur R/ıinovirusinfektion des
Pfer-des. Prakt. Tierarzt (Sondemummer) 30-32.
21- Tyreıı, D.
A.J.
and Parsons, R. (1960): Some virus isolation from common colds. III. Cytopathogenie effeets in tİssue eultures.Laneet, i, 239-246.
22- Wilson,J. C., Bryans,J. T., Doıı, E. R. and Tudor, L.(196S): Isolation of a newly identifiee'. equine respiratory virus. Comell vet. 55, 4:25-431.
