TOKAT VE KELKİT HAVZASI CİVARINDAKİ İLLERDE KENE-KÖKENLİ
KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜNÜN RT-PCR YÖNTEMİ İLE TEŞHİSİ
Gül AYDOĞAN Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Şaban TEKİN
2008 Her hakkı saklıdır
ii T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
TOKAT VE KELKİT HAVZASI CİVARINDAKİ İLLERDE
KENE-KÖKENLİ KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜNÜN
RT-PCR YÖNTEMİ İLE TEŞHİSİ
Gül AYDOĞAN
TOKAT 2008
Başkan: Doç. Dr. Şaban TEKİN İmza:
Üye : Doç. Dr. İsa GÖKÇE İmza:
Üye : Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI İmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
iv TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
TOKAT VE KELKİT HAVZASI CİVARINDAKİ İLLERDE KENE-KÖKENLİ KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜNÜN
RT-PCR YÖNTEMİ İLE TEŞHİSİ Gül AYDOĞAN
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsi Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Şaban TEKİN
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) hastalığı, insanlarda şiddetli kanamalar ve yüksek ateş gibi septomlarla seyreden, zoonoz karakterli bir hastalıktır. KKKA hastalığın etkeni negatif anlamlı, tek iplikçikli ve üç parça RNA molekülünden oluşan bir RNA virüsüdür. Tokat ili ve civarında yapılan arazi çalışmaları neticesinde toplanan kene ve serum örneklerindeki KKKA virüsü varlığı, virüsün S segmentine (Np) spesifik olarak dizayn edilen iki farklı primer seti kullanılarak Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemiyle test edilmiştir ve pozitif örneklerin genetik analizleri yapılmıştır. Bu çalışmada test edilen bazı örneklerde KKKA virüsü varlığı RT-PCR yöntemiyle moleküler olarak belirlenmiş ve pozitif PCR numunelerinin 1423 baz çiftlik kısmının DNA dizi analizi yapılarak diğer KKKA virüsleriyle benzerliği ortaya çıkartılmıştır. BLAST homoloji araştırmalarının sonuçlarına göre, bu çalışmada bulunan ve EXPASY bilgi bankası analizlerine göre 467 amino asiti kodlayan 1423 baz çifti nükleotid dizisinin Bulgaristan, Rusya ve Kosova’da daha önceden belirtilmiş bazı KKKA viral nükleotid dizileri ile %97 oranında; Çin, Umman, Özbekistan, İran’da bulunanlarla ise %88 oranında benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Buna göre, Tokat bölgesinde bulunan KKKA virüsünün muhtemelen Kuzey Avrupa, Balkanlar ve Rusya kökenli olduğu tahmin edilmektedir.
2008, 43 sayfa
ii ABSTRACT Master Thesis
DIAGNOSIS OF TICK-BORNE CRIMEAN CONGO HAEMORRHAGIC FEVER VIRUS WITH RT-PCR METHOD IN TOKAT AND THE OTHER CITIES OF
KELKIT BASIN Gül AYDOĞAN Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Doç. Dr. Şaban TEKİN
Crimean Congo Haemorrhagic Fever (CCHF) is a zoonotic disease with symptoms of heavy haemorrage and high fever in humans. CCHF virus (CCHFV), the causative agent of disease, is an RNA virus with a negatif single stranded tri-parted RNA genom. In this study, the presence of CCHFV was tested by RT-PCR using CCHFV S segment (Np) specific primers in ticks and serum samples collected from Tokat and vicinity. The presence of the CCHFV was determined in some samples tested, positive samples with 1423 base pairs (bp) were sequenced and nucleotid homology of the sequences with previously found CCHFV S segments were compared. According to BLAST searches and EXPASY analyses, 1423 bp sequence coding 467 amino acid showed 97 % similarity with segments from and Bulgaria, Russia, and Kosovo, and 88 % similarity with segments from China, Omman, Ozbekistan, and Iran. These results indicates that CCHFV found in Tokat and vicinity is possibly originated from East Europe, Balkans, and Russia.
2008, 43 pages
Doç. Dr. Şaban TEKİN’e, yine bu çalışmayı destekleyen deneyimlerimde ve çalışmalarımda kıymetli tecrübelerinden faydalandığım Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI’ya teşekkürü bir borç bilirim. Yüksek lisans süresince maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.
iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET………..i ABSTRACT……….. ii TEŞEKKÜR……….iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ………... .. vi ŞEKİLLER DİZİNİ………viii ÇİZELGELER DİZİNİ……….ix 1. GİRİŞ ve LİTERATÜR ÖZETİ……….1 1.1. Tarihçe……… 1
1.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı’nın Dünya’daki Epidemileri………. . 1
1.3. Kanamalı Virüsler……….. 4
1.3.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü……… . 6
1.3.1.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü’nün Replikasyonu……… 7
1.3.1.2. Filogenetik Çalışmalar………..7
1.3.1.3. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü’nün Genetik Çeşitliliği……… 9
1.3.1.4. Keneler………10
1.3.1.4.1. Kenelerin Morfolojik Özellikleri……….10
1.3.1.4.2. Kenelerin Yaşam Döngüsü………..10
1.3.1.5. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü’nün Bulaşma Yolları………. 12
1.3.1.6. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’ne Mevsimin Etkisi………... 13
1.3.1.7. Risk Grupları……….. 13
1.3.1.8. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’nin Tanısı………... 14
1.3.1.8.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)………... 15
1.3.1.8.1.1. Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)………...15
1.3.1.9. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’nin Tedavisi………... 15
2. MATERYAL ve YÖNTEM……….. 16
2.1. Materyal………16
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler………. 16
2.1.2. Cihazlar………..16
2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu………... 18 2.1.3.5. Etidium Bromür………..18 2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue………18 2.1.3.7. Primerlerin Hazırlanışı………18 2.2. Yöntem………... 19 2.2.1. RNA Ekstraksiyonu………...19
2.2.1.1. Kenelerden Total RNA Ekstrasyonu……….. 19
2.2.1.2. Serumdan Total RNA Ekstraksiyonu………. 20
2.2.2. Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)………22
2.2.2.1. Thermal cycler’ın Program Ayarı……….. 23
2.2.3. Agaroz Jel Elektroforezi………23
2.2.4. Jelden DNA Saflaştırılması………... 24
2.2.5. DNA Dizi Analizi………..25
3. BULGULAR ve TARTIŞMA………... 26
3.1. KKKA Pozitif Örneklerin RT-PCR Yöntemi ile Tespiti ve PCR Ürünlerinin DNA Dizi Analizi………. 26
3.2. KKKA Pozitif Sonuç Veren Örneğin Amino asit Dizisi………..27
3.3. KKKA Pozitif Örneğin (GOU-OT07) Diğer KKKA S Segmentleriyle Benzerlik Analizi ve Soyağacı………. 27
4. SONUÇ………... 34
KAYNAKLAR………...36
vi SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama oC Santigrat Derece g Gram G1, G2 Yapısal Proteinler L Large L Litre M Medium M Molar N Viral Nükleokapsid S Small o Derece s Saniye
S1, S2, S3, S4 Örnek1, Örnek2, Örnek3, Örnek4
Kısaltmalar Açıklama Ark. Arkadaşları
AMV Avian Myeloblastosis Virus
Bç Baz Çifti
BFB Bromfenol Blue cDNA Komplamenter DNA
dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik Asit DMSO Dimetilsülfoksit
dNTP Deoksiribonükleosid Trifosfat DTT Ditiotrietol
EDTA Etilendiamintetraasetik Asit ELISA Enzim Bağlı İmmün Assay HCL Hidrojen Klorür
IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M
ml Mililitre mm Milimetre
mM Milimolar
MMLV Maloney Murine Leukemia Virus MW Moleküler Ağırlık
nmol Nanomol
Np Nükleokapsid Protein NSD Nairobi Sheep Disease PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RNA Ribonükleik Asit
RNase Ribonükleaz
Rpm Rotation Per Minute
RSHM Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi
RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu SSK Sosyal Sigortalar Kurumu
TAE Tris-Asetat EDTA TE Tris-EDTA
UV Ultraviyole µl Mikrolitre µM Mikromolar pmol Pikomol
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil 1.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı’nın Dünya’daki yayılışı ... 2
Şekil 1.2 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı’nın Türkiye’deki dağılımı... 3
Şekil 1.3 Bunyaviridae virionunun şematik kesiti ... 5
Şekil 1.4 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün replikasyonu ... 7
Şekil 1.5 Kan emmiş ergin kene ile kan emmemiş dişi ve erkek ergin kenelerin morfolojik görüntüleri... 11
Şekil 1.6 Kenelerin yaşam evrelerinin morfolojik görüntüleri ... 11
Şekil 1.7 Kenelerin konukçuya Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünü bulaştırması ... 12
Şekil 2.1 RT-PCR sonrası PCR ürünlerinin Agaroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanılarak görüntülenmesi ... 24
Şekil 3.1 KKKA pozitif örneğin (GOU-OT07) diğer KKKA virüsü S segmentleriyle benzerliklerinin soyağacı ile gösterilmesi ... 33
Çizelge 1.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi vaka ve ölümlerinin yıllara göre
dağılımı ... 4 Çizelge 1.2 Kanamalı virüs aileleri... 4 Çizelge 3.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün S segmentinin 1423 bç’lik
kısmının dizi analiz sonucu... 26 Çizelge 3.2 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün S segmentinin 1423 bç’lik
kısmının amino asit dizisi ... 27 Çizelge 3.3 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile
KKKA virüsü (AY277676.2) S segmentinin 1673 bç’lik kısmının
benzerliklerinin gösterilmesi... 28 Çizelge 3.4 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile
KKKA virüsü (DQ206447.1) S segmentinin (ROS/HUVLV-100
strain) 1673 bç’lik kısmının benzerliklerinin gösterilmesi ... 29 Çizelge 3.5 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile... KKKA virüsü (DQ206447.1) S segmentinin (Kosovo Hoti strain)
1. GİRİŞ ve LİTERATÜR ÖZETİ
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) hastalığı, insanlarda şiddetli kanamalar ve yüksek ateş gibi septomlarla seyreden, zoonoz karakterli bir hastalıktır. Kırım Kongo Kanamalı Ateşine neden olan etken, Bunyaviridae ailesinin Nairovirüs genusunda yer almaktadır. Bu virüs, negatif anlamlı, tek iplikçikli ve üç molekülden oluşan bir RNA virüsüdür (Nichol, 2001).
1.1. Tarihçe
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA); ilk olarak XII. yüzyılda Tacikistan’da kanama ile seyreden, idrarda, salivada, rektumda ve abdominal kavitede kanamalara yol açan kanamalı bir hastalık olarak tarif edilmiştir (Ergonul, 2006). Hastalık başlıca Hyalomma cinsi sert kenelerle bulaşmaktadır (Hoogstraal, 1979).
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi, klinik olarak ilk kez 1944-1945 yıllarında II. Dünya Savaşı esnasında Kırım’da, yaklaşık iki yüz Rus askerinin bölge köylülerine yardım ederken hastalanmaları ile görülmüş ve klinik bulgular doğrultusunda “Kırım Kanamalı Ateşi” olarak adlandırılmıştır. Daha sonra 1956 yılında Belçika Kongosu’nda görülen ateşli bir hastanın klinik örnekleri ile hastalığın etkeninin, 1969 yılındaki Kırım Kanamalı Ateşi ile aynı olduğu belirtilmiş ve bu tarihten itibaren ‘Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’ olarak adlandırılmıştır (Simpson, 1978).
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsü, ilk olarak 1967 yılında bir hastadan alınan kanın yeni doğan farelere intraserebral inokülasyonu sonucunda izole edilmiştir (Ergonul, 2006).
1.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı’nın Dünya’daki Epidemileri
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) hastalığı, ülkemizin de içinde bulunduğu geniş bir coğrafyada görülmektedir. Afrika, Asya, güneydoğu Avrupa ve
Ortadoğu’da bulunan 30 ülkenin üzerinde hastalığın ortaya çıktığı bildirilmiştir (Şekil 1.1) (Hoogstraal, 1979; Swanepoel, 1995).
Şekil 1.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı’nın Dünya’daki yayılışı (Anonim, 2007d)
1967 Özbekistan, 1976 Bağdat ve 2000 yıllarında Pakistan’da meydana gelen salgınlardan KKKA virüsünün çeşitli suşlarından küçük genomik RNA segmentlerinin tüm dizisi belirlenmiştir (Hewson ve ark., 2004; Ahmad, 2000).
Son yıllarda İran’da KKKA vakalarında artma olmuştur ve yapılan bir çalışmada 2002 yılında infekte olmuş 9 İran’lı hastadan KKKA virüsü izole edilmiş ve genetik olarak incelenmiştir (Chinikar, 2004; Mardani, 2002).
Suudi Arabistan’nın Mekke şehri dolaylarında 1989-1990 yılları arasında mezbaha çalışanları arasında 40 KKKA olgusu tanımlanmıştır ve sonrasında hayvanlardan toplanan farklı tür kenelerden virüs araştırılmış, herhangi bir sonuca ulaşılamamıştır. KKKA virüsünün koyun ithalatı ve enfekte keneler ile bölgeye girdiği düşünülmektedir (El-Azazy, 1997).
3
Bulgaristan’da 1960’lı yıllarda 14 sağlık çalışanından % 40’ı KKKA nedeniyle hayatını kaybetmiştir (Oldfield, 1991). Bu ülkede yapılan genetik çalışmalar sonucunda, KKKA virüsü “Rhipicephalus bursa” türü kenelerden izole edilmiştir (Papa, 2004).
Bunun yanı sıra; Kosova, Umman, güney Afrika, Estonya, Birleşik Arap Emirlikleri, Irak ve Çin’de de KKKA virüsünün varlığı ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Papa ve ark., 2002; Williams ve ark., 2000; Khan ve ark., 1997; Golovljova, 2004; Gear ve ark., 1982; Al-Tikriti ve ark., 1981).
Türkiye’de ise ilk kez 2002 yılı nisan ayında Tokat SSK Hastanesi’nde bir hemşirenin ölümünün ardından spekülasyonlar üzerine başlatılan araştırmalar, KKKA hastalığının tanınmasını sağlamıştır (Karti ve ark., 2004).
Şekil 1.2 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı’nın Türkiye’deki dağılımı (Anonim, 2006b)
KKKA hastalığı, ayrıca 2003 yılında Sivas, Çorum, Amasya, Yozgat, Gümüşhane, Bayburt, Erzurum, Erzincan ve çevresinde görülmüştür (Şekil 1.2). Ardından Kastamonu, Bartın, Ankara, Çankırı, Bolu, Balıkesir gibi illerde de vakaların ortaya çıkması ile hastalığın görüldüğü alan daha da genişlemiştir (Karti ve ark., 2004).
Yapılan bir çalışmada, KKKA hastalığının, Türkiye’de daha çok Kelkit vadisi ve çevresindeki kırsal alanlarda çiftçilik ve hayvancılıkla uğraşan kesimlerde görüldüğü belirtilmiştir (Karti ve ark., 2004). Özellikle Tokat ve çevresinde, hayvancılığın
yoğun olduğu bölgelerde, insanlarda KKKA seroprevalansının %20 civarında olduğu tespit edilmiştir (Tekin ve ark., 2008).
Çizelge 1.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi vaka ve ölümlerinin yıllara göre dağılımı (Türkiye, 2002-2006) (Anonim, 2007c)
Yıllar
Vaka Sayısı
Ölüm
2002
17
-
2003
133
6
2004
249
13
2005
266
13
2006
438
27
Sağlık Bakanlığı kayıtlarına göre ülkemizde 2002-2006 yılları arasında laboratuvar bazında tanısı doğrulanmış toplam 907 vaka bulunmaktadır (Çizelge 1.1) (Anonim, 2007c).
1.3. Kanamalı Virüsler
Kanamalı virüsler, vücutta ateş, kanama gibi şiddetli septomlar ile seyreden ileriki aşamalarda ölümle sonuçlanabilen, zoonoz karakterli hastalığa neden olan virüslere denir. Kanamalı virüsler 4 aileye mensuptur (Çizelge 1.2) (Le Guenno, 1995).
Çizelge 1.2 Kanamalı virüs aileleri
HEMORAJİK VİRÜS AİLELERİ
1-Flaviviridae 2-Bunyaviridae 3-Arenaviridae 4-Filoviridae
Sarı Humma Hanta Virüs Lassa Ateşi Marburg
Kanamalı Ateşi Dang Kanamalı
Ateşi
Rift Vadisi Ateşi Arjantin Kanamalı Ateşi Ebola Kanamalı Ateşi Kyasanur Ormanı Hastalığı Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Bolivya Kanamalı Ateşi
5
Bunyaviridae ailesine mensup RNA virüsleri 3 segmentli ve negatif poleriteli genoma sahip zarlı virüslerdir (Şekil 1.3). Bu virüsler, lipit ve deterjanlara dayanıksız olup hızla inaktive olabilmektedir. Konak haricinde ve ultraviyole (UV) ışınlarına maruz bırakıldıklarında ise ölürler. 56 oC’de 30 dakikada inaktive olan bu virüsler, 40 oC’de kanda 10 gün yaşayabilmektedirler. Ayrıca %1’lik hipoklorit, %2’lik glutaraldehilde ve ribavirine hassastır (Lerx ve ark., 1985).
Bunyaviridae ailesi birbirinden farklı beş cins içermektedir. Bunlar;
1. Bunyavirüs
2. Hantavirüs
3. Nairovirüs
4. Phlebovirüs
5. Tospovirüs’lerdir (Eliot ve ark., 2000).
Bu kategori içerisinde yer alan Nairovirüs’lerin, moleküler analizler sonucu negatif iplikli üç RNA segmenti içerdiği gösterilmiştir. Large (L) segmenti 4.1–4.9 x 106, medium (M) segmenti 1.5–1.9 x 106, small (S) segmenti ise 0.6–0.7 x 106 moleküler ağırlık içermektedir. L segmenti, viral polimerazı, M segmenti G1 ve G2 olarak
adlandırılan yapısal proteinleri, S segmenti ise viral nükleokapsidi (N) kodlamaktadır (Şekil 1.3) (Bishop, 1996).
Nairovirüs’ler; KKKA virüsü, Dera Ghazi Khan virüsü, Hughes virüs grubu, Nairobi Sheep Disease (NSD) virüs grubu, Qalyup virüs grubu, Sakhalin virüs grubu ve Thaifora virüs grubu (Clerx ve ark., 1981) olmak üzere yedi farklı serogruba ayrılmaktadır. Bunlar da 34 çeşit virüsü kapsamaktadır (Van Regenmorte ve ark., 2000).
Bu Nairovirüs’lerden, KKKA virüsü hayvanlarda enfeksiyon oluşturmasına rağmen ciddi belirtiler göstermezken insanlarda ölümle sonuçlanabilen yüksek septomlar gösterir. Buna karşın Nairobi Sheep Disease (NSD) virüsü ise koyun, keçi gibi hayvanlarda enfeksiyon oluştururken insanlarda böyle bir enfeksiyon gözlenmez (Clerx ve ark., 1981).
1.3.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü
KKKA virüsü; morfolojisi, replikasyonu ve fizikokimyasal özellikleri bakımından Bunyaviridae familyasının özelliklerini taşımaktadır (Whitehouse, 2004). 100 nm çapında negatif iplikli L, M ve S olmak üzere üç RNA segmenti içermektedir (Sanchez ve ark., 2002). L segmenti, viral polimerazı, M segmenti G1 ve G2 olarak
adlandırılan yapısal proteinleri, S segmenti ise viral nükleokapsidi (N) kodlamaktadır (Bishop, 1996).
RNA genomunun L, M ve S segmenti ribonükleokapsid yapısı oluşturmak amacıyla nükleoprotein ile birlikte paketlenmiştir. Nükleokapsid ve RNA’ya bağlı polimerazda G1 ve G2 olarak bilinen glikoproteinler içeren bir lipit zarf içinde
paketlenmiştir. Glikoprotein çıkıntıları içeren bu lipit zarfın altında viral genomun ve buna bağlı proteinlerin (nükleoprotein ve RNA polimeraz) saklandığı ‘kapsid’ adı verilen bir çekirdek bulunur (Schmaljohn ve ark., 2001).
7
1.3.1.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü’nün Replikasyonu
Viral glikoproteinlerin, duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Bu hücrelerdeki reseptörlere bağlanan virüsler, endositoz ile hücre içine alınırlar. Sitoplazmaya alınan virüsler, replike olduktan sonra tomurcuklanarak endoplazmik retikulumdan ayrılırlar ve Golgi bölgesinde sitoplazmik veziküller içerisine alınırlar. Bu bölgeden de füzyon işlemi ile virüs en dıştaki zarını da alarak hücre dışına çıkar (Şekil 1.4) (Donets ve ark., 1977; Ellis ve ark., 1981; Schmaljohn ve ark., 2001).
Şekil 1.4 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün replikasyonu (Schmaljohn ve ark., 2001)
1.3.1.2. Filogenetik Çalışmalar
KKKA virüsü 1970 yılında farklı coğrafyalarda saptanan virüsün antijenik yapılarının farklı olmadığı bildirilmiştir. Fakat nükleik asit dizi analizi tekniklerinin de gelişmesiyle genetik çeşitlilik ortaya çıktı ve buna göre 8 farklı genetik grup bulundu (Papa, 2004). Bundan dolayı Türkiye’den izole edilen KKKA virüs
izolatları güneydoğu Rusya ve Kosova suşlarına benzerlik gösterirken, İran’da 2002 yılında görülen salgındaki suşlardan farklıdır (Karti ve ark., 2004).
Balkanlarda KKKA virüsü ile yapılan bir çalışmada, ölümcül bir vakadan izole edilen virüsün bütün genom dizisi tanımlanmıştır. Virüsün toplam genomu 19.2 kb uzunluğunda olup, S segmentinde 1672, M segmentinde 5364 ve L segmentinde 12150 nükleotid içerdiği belirtilmiştir. KKKA virüsünün filogenetik analizleri Avrupa/Türkiye grubundaki Kosova suşlarının bütün genomları Rus izolatları ile yüksek benzerlik göstermiştir. Kosova suşları arasında ise %1.9 farklılık oranı bulundu. Bu da uzak virüs suşlarının yüksek endemik alanlarda bir arada bulunabileceğini işaret eder (Duh ve ark., 2008).
1985 yılında Özbekistan’daki kenelerden izole edilen KKKA virüsünün tüm S segment nükleotid dizileri belirlenmiş olup uzunluğunun 1672 ve 1674 nükleotid olduğu gösterilmiştir. S segmentlerinin amino asit ve nükleotid dizilerinin daha önce yayınlanan verilerle karşılaştırılması ile Özbekistan’dan elde edilen KKKA virüs suşunun Çin’den ve Stavropol bölgesi formlarından izole edilen suşlarla çok yakın olduğunu filogenetik araştırmalar neticesinde belirtilmiştir (Petrova ve ark., 2003).
Rusya’nın Avrupa kısmında KKKA virüs suşlarının genetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Hyalomma marginatum kene türü ile hasta kişilerin KKKA virüsünün M segment dizi analizi yapılmıştır. Rusya suşlarının M segment dizilerinin filogenetik analizleri sonucunda yakın bir akrabalığı olduğu gösterilmiştir (Yashina, 2003).
Bulgaristan ve Rusya’nın Rostov bölgesinden izole edilen 2 KKKA virüs suşlarının S segment nükleotid dizileri belirlenmiştir. Dünya’nın değişik bölgelerinden izole edilen KKKA virüs suşlarının S segment nükleotid dizilerinin analizleri, 1967 ve 2000 yıllarında güney Rusya’nın farklı bölgelerindeki kene ve insanlardan izole edilen KKKA virüsünün genetik olarak çok yakın olduğu ve temel Avrupa genetik grubunda bireysel alt grup oluşturduğunu göstermektedir (Seregin ve ark., 2006).
9
Çin’de yapılan bir çalışmada KKKA virusünün M segmentinin tüm dizisi belirlendi ve bunların, 5356-5377 nükleotid ve 1689-1697 amino aside karşılık gelen bir proteini kodladığı belirtilmiştir (Morikawa ve ark., 2002).
Batı ile güney Afrika, Orta doğu ve Yunanistan’da yapılan bir çalışmada 70 KKKA izolatlarının S segmentlerinin filogenetik analizleri yapıldı ve analizler sonucunda %18 farklılık olduğu gösterilmiştir (Burt ve ark., 2005).
KKKA virüsü ile ilgili yapılan bir çalışmada, KKKA virüsüne özgü oligonükleotidler ile, L segment dizisini belirleyerek virüsün genom karakterizasyonu tamamlanmıştır (Kinsella ve ark., 2004).
1.3.1.3. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü’nün Genetik Çeşitliliği
Artropodlardaki RNA virüsleri az genetik çeşitlilik göstermesine rağmen, Nairovirüs içerinde yer alan KKKA virüsü daha fazla genetik çeşitliliğe sahiptir. Protein işlevleri bakımından önemli bölgeler korunmuş olmasına karşın, L, M ve S segmentlerinin nükleotid ve amino asit kısımlarındaki değişiklik oranları sırasıyla %22, %31, %20 ile %10, %27, %8 şeklindedir.
KKKA virüsü, kenelerde uzun süre kalabilmekte ve bundan dolayı kenelerin birden fazla kökeni barındırma olasılığı genetik çeşitliliği kolaylaştıran bir durum haline gelebilmektedir. Virüsün M ve S segmentleri üzerinde yapılan filogenetik çalışmalar sonucunda bu durumu destekleyici kanıtlar elde edilmiştir (Hewson, 2007).
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün taşınmasında ve yayılmasında rol alan rezervuarlar domuz, tavşan, fare gibi küçük yabani kemirgen hayvanlar iken, KKKA virüsünün başlıca vektörü ise kenelerdir.
1.3.1.4. Keneler
Kutup bölgesi hariç dünyanın her bölgesinde yayılış gösterebilen, zorunlu kan emici Eklembacaklı (Artropod) olarak bilinen keneler, ülkemizde halk arasında sakırga, yavsı, kerni gibi isimlerle tanınmaktadır (Barker ve ark.,2004).
1.3.1.4.1. Kenelerin Morfolojik Özellikleri
Morfolojik olarak diğer artropodlardan farklılık gösteren, vücutları tek parçadan oluşan keneler; 3 mm boyunda, kahverengi ya da kırmızı renklerde olan yassı, oval biçimdeki parazitlerdir (Barker ve ark.,2004).
Keneler, Argasidae (Yumuşak Keneler) ve İxodidae (Sert Keneler) olmak üzere iki aile içerisinde incelenmektedir. Bu aileler kapsamında ise toplam 866 kene türü yer almaktadır (Horak ve ark., 2002). Bunlardan 30’u (2’si argasid, 28’i ixodid türü) KKKA virüsünün taşınmasına vektörlük etmektedir (Anderson ve ark., 2005). Ülkemizde kenelerin sistematik bakımından incelenmesine yönelik birçok çalışma yapılmaktadır (Özkan, 1978).
Türkiye’de Ambyolomma türleri dışında birçok kene türü KKKA virüsüne vektörlük etmektedir. Bu virüsün taşınmasında Hyalomma cinsinden özellikle de “Hyalomma marginatum marginatum’’ türleri rol oynamaktadır (Karaer, 1997).
1.3.1.4.2. Kenelerin Yaşam Döngüsü
Dişi ve erkek keneler kan emme sırasında konak üzerinde çiftleşir ve dişi keneler yumurtalarını bitki, toprak, taş veya mera gibi ortamlara birbirine yapışık şekilde bütün olarak bırakırlar (Şekil 1.5) (Balashov, 2005; Barker ve ark., 2004).
11
Şekil 1.5 Kan emmiş ergin bir kene ile kan emmemiş dişi ve erkek ergin kenelerin morfolojik görüntüleri
Keneler, yumurta döneminden sonra larva-nimf dönemlerine geçerek ergin olurlar (Şekil 1.6). Yumurtadan çıkan larvalar, gelişimlerini tamamlamak amacıyla konak ararlar. Buldukları ilk konukçu genellikle rodentlerdir (Barker, 1999).
Şekil 1.6 Kenelerin yaşam evrelerinin morfolojik görüntüleri
Konukçudan beslenmesini tamamlayan larvalar, konaktan ayrılarak kendilerini tekrar toprağa bırakırlar ve nimf haline dönüşürler. Nimfler de yeni bir ikinci konak (evcil ve yabani hayvan, insan) aramaya başlarlar ve kan emdikten sonra ergin forma dönüşürler (Aiello ve ark., 2004).
Dişi ergin keneler, kendilerine tekrardan konak bulurlar, kan emip çiftleşirler ve doyduktan sonrada konağı terk ederek toprağa geçerler. Toprağın uygun bir yerinde
yumurtalarını bırakır ve ölürler. Keneler, yaşam döngülerini bu biçimde devam ettirirler (Anonim, 2004a; Dohm ve ark., 1996; Faye ve ark., 1999; Vredevoe, 1997).
1.3.1.5. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü’nün Bulaşma Yolları
KKKA virüsü, özellikle Hyalomma, Amblyomma ve Rhipicephalus cinsi kenelerinin çiftlik hayvanları (Sığır, keçi vs.), yabani hayvanlar (Kurt, çakal vs.), kemirici hayvanlar (Tavşan, fare vs.) ve insanları ısırmaları sonucu bulaşmaktadır (Watts ve ark., 1988).
Keneler, beslenme esnasında enfekte hayvanlarda kan emerken virüsleri alırlar, gelişme dönemlerinde (larva-nimf-ergin) vücutlarında bulunan virüsü herhangi başka bir hayvana veya insana kan emme esnasında salgıladıkları ve dışkıları ile bulaştırırlar (Şekil 1.7) (Le Due, 1989).
Şekil 1.7 Kenenin konukçuya Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünü bulaştırması (A: Anüs, BG: Kan damarı, BL: Kan hücreleri, CU: Kütikula, EP: Epidermis, GO: Genital açıklık, MD: İçerisi kan hücreleri ile dolu mide, OV: Ovary, SP: Tükürük bezi) (Mehlhorn, 2004)
Enfekte kene virüsü, trans-ovarial ve trans-stadial olarak diğer kenelere bulaştırır. Bu keneler vektör olmanın yanında virüs için rezervuar özelliği de taşımaktadır. Bir çalışmada enfekte olmuş dişi bir kenenin yumurtalarının %3’nün enfekte olduğu bildirilmiştir (Whitehouse, 2004).
13
Enfekte hayvanların ve klinik hastaların sekresyon, kan ve doku sıvılarıyla teması sonucunda da virüs bulaşabilmekte ve bu şekilde insandan insana da geçebilmektedir (Elaldı, 2004). Bunun yanı sıra, hastalığın anneden çocuğa da geçtiği bildirilmiştir (Saijo ve ark., 2004).
Ayrıca göçmen kuşların bu virüsü, kıtalar arası geniş bir coğrafyaya yaydığı düşünülmektedir (Ergonul, 2006).
1.3.1.6. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’ne Mevsimin Etkisi
KKKA hastalığı mevsim özelliklerine göre farklılık göstermektedir. Bu farklılıklar da, kene populasyonunun artmasına neden olup buna bağlı olarak hastalığın görülmesini artıran etkilerden birisidir. Özellikle küresel ısınmanın kene populasyonunun artmasında etkin olduğu düşünülmektedir. Hastalık, genellikle haziran-eylül ayları arasında etkisini göstermesine rağmen, ülkemizde ise nisan-kasım ayları arasında daha çok etkili olmaktadır (Estrada-Pena, 2001).
1.3.1.7. Risk Grupları
Kene ile ilgili öyküsü olan (kene ısırığı, temas gibi) kişiler risk gruplarının başında yer almaktadır. Hayvan kesimi yapan mezbaha işçileri, veterinerler, hasta hayvanla teması olanlar, tarım çalışanları ve hayvancılıkla uğraşan kişiler hastalık riski taşımaktadır (Swanepoel ve ark., 1985; El-Azazy ve ark., 1997; Dunster ve ark., 2002). Bunların yanı sıra akut hastalarla temas durumunda olan kişiler, sağlık personeli, askerler ve kamp yapanlar da yüksek oranda risk altındadırlar (Bakir ve ark., 2005).
Yapılan bir çalışmada, Tokat çevresinde KKKA hastalığının hayvancılıkla uğraşanlar, kene ile ısırılanlar ve KKKA hasta yakınlarının seroprevalansı araştırılmış ve bu grupların KKKA risk potansiyeli belirtilmiştir. İnsan anti-KKKA IgG ELISA testlerinin sonuçlarına göre; hayvancılıkla uğraşanların KKKA
prevalansı %23.1, kene ısırığına maruz kalanların %10.4 ve hasta yakınlarının ise %22.8 olduğu saptanmıştır (Yüce, 2008).
1.3.1.8. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’nin Tanısı
KKKA hastalığının tanısında, kene (kene ısırığı gibi), hasta hayvan veya insan ile öyküsünün olması çok önemlidir. Hastalığın tanısında üç yöntem kullanılır. Bunlar:
1. Virüs Kültürü: Biyogüvenlik seviyesi 4 olan laboratuvarlarda, akut dönemdeki hastalardan alınan kan örneklerinden 2-5 gün içerisinde virüs izolasyonu yapılabilir. Bunun içinde Vero E6, BHK-21, SW 13, LLC-MK2 hücre kültürleri kullanılmaktadır. Bu şekildeki tanı hızlı olmasına karşın daha az duyarlıdır (Whitehouse, 2004).
2. Serolojik Tanı: Virüs antijenlerinin ve virüse karşı oluşmuş antikorların serolojik olarak gösterilmesi esasına dayanan bir yöntemdir. Hastalığın 6. gününden itibaren alınan kan örneklerinde virüse karşı oluşmuş IgG ve IgM antikorları hızlı bir biçimde ELISA yöntemi ile saptanabilmektedir. IgM antikorları 4. ayın sonunda serumda saptanamayacak kadar azalırken, IgG antikorları ise 5 yıla kadar saptanabilecek seviyede kalabilmektedir (Saijo ve ark., 2005).
3. Moleküler Tanı: Virüs, Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) veya Real Time Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu tekniği ile hastadan 16. güne kadar alınan serum örneklerinden saptanabilmektedir (Drosten ve ark., 2003).
Ülkemizde tanı; Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi (RSHM) Başkanlığı Viroloji laboratuvarında ELISA yöntemi (IgG ve IgM antikorlarının aranması) ve PCR yöntemi (virüs RNA’sının gösterilmesi) ile konulmaktadır (Bodur, 2007).
15
1.3.1.8.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
PCR, in vitro koşullarda herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’nın özgül bölgelerinin amplifikasyonunu sağlayan bir DNA sentez yöntemidir (Mullis, 1990). PCR, tıp, paleontoloji, biyoloji, moleküler araştırmalarda ve mikrobiyolojide (mikroorganizma tanısında) başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. PCR, çok az sayıdaki DNA’nın 1-5 saat içerisinde çoğaltılmasını sağlamaktadır.
1.3.1.8.1.1. Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
PCR çeşitlerinden biri olan RT-PCR’da kalıp olarak kullanılan RNA’dan Revers Transkriptaz enzimleri (AMV, MMLV) varlığında komplamenter DNA (cDNA) oluşması ve cDNA’dan da standart PCR yöntemi kullanılarak polimeraz enzimleri varlığında iki evrede DNA’nın çoğaltılması esasına dayanır. Thermus thermophilus gibi bakterilerden üretilen DNA polimerazlar hem RNA hem de DNA’yı kalıp olarak kullanabileceğinden dolayı RT-PCR işleminde tek başına kullanılabilmektedir (Mullis, 1990; Bardakcı ve ark., 2007).
PCR işlemi sonrasında PCR ürünleri, Etidium bromür varlığında Agaroz jelinde elektroforezle (Agaroz Jel Elektroforezi) koşturulduktan sonra bir UV transillüminatör yardımıyla görüntülenir (Osterman, 1984; Özerol, 2001).
1.3.1.9. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi’nin Tedavisi
Hastaların tedavisinde destekleyici bir tedavi yöntemi esas alınır. Destekleyici tedavi de hastaya trombosit, donmuş plazma ve eritrosit solüsyonlarının verilmesi ile gerçekleşir. Etki mekanizması tam olarak bilinmemesine karşın kullanılan Ribavirin, tek antiviral ilaçtır (Watts ve ark., 1989).
RSHM’nin, bağışık insan serumundan pasif koruma sağlayarak KKKA hastalığının tedavisine yönelik çalışmaları bulunmaktadır (Anonim, 2007e).
2. MATERYAL ve YÖNTEM
2.1. Materyal
Tokat ve Kelkit vadisi çevresindeki illerde (Ordu, Sivas, Amasya) 2005-2007 yılları arasında yapılan arazi çalışmaları sonucunda insan (sağlık kuruluşlarından gelen), sığır, koyun, keçi, köpek, domuz, kaplumbağa ve kirpilerden toplanan keneler, ve KKKA hastalığı öyküsü olan kişilerden alınan serum örnekleri, KKKA virüsü varlığı RT-PCR yöntemi kullanılarak test edilene kadar -80 0C’de muhafaza edilmiştir.
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler
Agaroz, Etidium bromür, Bromophenol blue (Sigma), Etanol, Glasiyal asetik asit (Merck), Sodyum asetat, HCI (Carlo Erba), Tris, EDTA, Gliserol, Xylene cyanol,
İsopropanol (Amresco), Sıvı azot, Moleküler ağırlık standartı (Vivantis), ccss-F2, ccss-R2 (İontek), chvgs 1667-F, chv CL2-R (IDT) primer seti, Viral RNA izolasyon kiti (Qiagen, Roche), RT-PCR kiti (İnvitrogen, Roche), Jel Ekstraksiyon kiti (Qiagen), Erlen, Beher, Cam Şişeler (100 ml, 500 ml, 1000 ml’ lik), Mezür, Bistüri, Forcep, Enjektör, Petri kapları (Isolab), Pipet uçları (Corning, Neptune, Eppendorf), Mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (Axygen) ile diğer laboratuvar malzemeleri kullanıldı.
2.1.2. Cihazlar
Thermal cycler (Peqlab), Santrifüjler (Eppendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), Yatay elektroforez (Scie-plas), Güç kaynağı (Consort), Hassas terazi (Acculab), pH metre (Hanna), Otomatik pipetler (Eppendorf, Brand), Manyetik karıştırıcılar, Vorteks (Ika), Buz makinesi (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (Memmert), Mikrodalga fırın (Arçelik), 4, -20 ve -80 oC’deki buzdolapları (Uğur,
17
Arçelik, U410 premium), Fotoğraf makinesi (Sony) ve Saf su cihazları (Mes mp minipure, Millipore) kullanıldı.
2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanışı
2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solüsyonu
16.81 g EDTA 90 ml H20 içerisinde manyetik karıştırıcı yardımı ile partiküller
tamamen çözününceye kadar karıştırıldı. pH:8.0’e ayarlandıktan sonra hacim 100 ml.’ye tamamlandı. Otoklavda 121 oC’de 20 dk. steril edildikten sonra, +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.2. 50X Tris Acetate EDTA (TAE) Tamponu
242 g Tris, 57.1 ml Glasiyal asetik asit ve 100 ml 0.5 M EDTA (pH:8) manyetik karıştırıcı yardımı ile partüküller çözününceye kadar karıştırıldı. Hazırlanan çözeltinin pH’ı Glasiyal asetik asitle 8.5’e ayarlandı ve toplam hacim distile su ile 1 L’ye tamamlandı. Steril edildikten sonra +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.3. 1X TE Tamponu
1.2 g 10 mM Tris HCI ile 0.37 g 1 mM EDTA, 900 ml distile su içerinde manyetik karıştırıcı yardımı ile çözüldü. pH:8’e ayarlandıktan sonra hacim 1000 ml’ye tamamlandı. Hazırlanan tampon steril edildikten sonra +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu
41 g Sodyum asetat, 90 ml distile su içerisinde çözüldü. pH:5.0’a ayarlandıktan sonra hacim 100 ml’ye tamamlanır. Otoklavda steril edilerek +4 oC’de muhafaza edildi.
2.1.3.5. Etidium Bromür
10 mg Etidium bromür, 10 ml distile su içerinde hazırlandı ve 4 oC’de muhafaza edildi.
2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue
15 ml Gliserol, 0.25 g Bromophenol blue ile 0.25 g Xylene cyanol; 100 ml distile su içerisinde çözününceye kadar karıştırılarak hazırlandı.
2.1.3.7. Primerlerin Hazırlanışı
ccss-F2 (5'-TGG ACA CCT TCA CAA ACT C-3') ve ccss-R2 (5'-GAC AAA TTC CCT GCA CCA-3') primerleri (İontek) ile chv CL2-R (5'-CAC TGG CAT TGC CCT TG-3'), ve chvgs 1667-F (5'-AAG AAA CAC GTG CCG CTT A-3') primerleri (IDT) (konsantrasyon ve miktarlarına göre) TE tamponu veya RNase free ddH2O
kullanılarak hazırlandı. Şöyle ki;
• ccss-F2:76.19 pmol/µl ve ccss-R2:73.52 pmol/µl olan oligolar, 10 µ M konsantrasyonunda,
• chv CL2-F:102,5 nmol ile chvgs 1667-R:90,2 nmol miktarında olan oligolar ise pmol’e çevrildikten sonra 10 µM konsantrasyonunda hazırlandı.
19
2.2. Yöntem
2.2.1. RNA Ekstraksiyonu
Kenelerden total RNA ektrasyonu için Qiagen’nin ‘QIAamp Viral RNA isolasyon’ kiti kullanılırken, serumdan total RNA’nın ekstraksiyonu için ise Roche’un ‘High Pure Viral RNA’ kiti kullanılmıştır. Viral RNA ekstrasyonu kit üreticilerinin prosedürüne göre yapılmıştır.
2.2.1.1. Kenelerden Total RNA Ekstrasyonu
-80 0C’den çıkarılan keneler sıvı azot içerisine alınır. Steril bir bistüri yardımı ile ortadan ikiye kesilen kenenin bütün dokuları (sadece dış iskeleti kalıcak şekilde) forcep yardımıyla mikrosantrifüj tüplerine alınır. Dokular, 500 µl RNase free ddH2O
ile sulandırıldıktan sonra 20’lik iğneden geçirilerek homojenize edilir. Oluşan homojenat 14 000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilerek, süpernatant kısmı alınır ve Qiagen kiti kullanılarak aşağıdaki şekilde total RNA izole edilir:
1. Carrier RNA içerisine 310 µl AWE Buffer eklenerek solüsyon hazır hale getirildi.
2. 56 µl carrier RNA, 5600 µl AWL Buffer içerisine karıştırıldı (10 numune için).
3. 560 µl hazırlanan karışımdan, 560 µl de etanolden alınarak her biri eppendorf tüplerine eklendi.
4. Hazırlanan karışımın üzerine ise dokunun süpernatant kısmından 280µl ilave edilerek vortekslendi.
6. 8 000 rpm’de 1 dk santifüj edilip, collection kısımları atıldı ve yerine yenisi yerleştirildi. Karışım bitene kadar bu işleme devam edildi.
7. Sonrasında her bir tüpe, 500 µl AW1 Buffer’ı eklendi.
8. 14 000 rpm’de 3 dk. santrifüj edilip, collection tüpleri atılarak yeni tüpler yerleştirildi.
9. Daha sonra 500 µl AW2 Buffer’ı eklendi.
10. 14 000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilip, collection tüpleri atılarak yeni tüpler yerleştirildi.
11. Sonrasında 1 dk. kadar tekrar santrifüj yapıldıktan sonra collection tüpleri atıldı ve yerine eppendorf tüpleri yerleştirildi.
12. Filtreli kısma 60 µl Elution Buffer ilave edilip 14 000 rpm’de 1 dk. santrifüj edildi.
13. Son basamakta ise, filtreli kolonlar atılarak eppendorf tüplerinde kalan ekstraksiyon ürünleri etiketlenerek -20 0C’ye kaldırıldı.
Bu yöntem sonucunda 245 kadar kenenin dokularından RNA izole edilerek KKKA varlığı RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir.
2.2.1.2. Serumdan Total RNA Ekstraksiyonu
-80 0C’den çıkarılan serumlar 14 000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilerek, süpernatant kısmı alınır ve Roche’un ‘High Pure Viral RNA’ kiti kullanılarak aşağıdaki şekilde total RNA izole edilir:
21
1. Poly(A) carrier RNA içerisine 400 µl Elution Buffer, Inhibitor Removal Buffer’a 20 ml, Wash Buffer’a ise 40 ml etanol ilave edilerek solüsyonlar hazırlandı.
2. 12 numune için, 5 ml Binding Buffer’a (4.5 M guanidine-HCI, 50 mM Tris-HCI, %30 Triton X-100, pH: 6.6) 50µl carrier RNA eklendi. Akabinde filtreli kolonlara her bir numune için 200 µl serum ile 400 µl Binding Buffer+carrier RNA ilave edildi.
3. 8 000 x g’de 15 s santrifüj edildi ve sonrasında collection tüpleri atılırak yeni tüpler kullanıldı.
4. Sonra, filtreli kolonlara 500 µl Inhibitor Removal Buffer (5 M guanidine-HCI, 20 mM Tris-guanidine-HCI, pH: 6.6) ilave edildi.
5. 8 000 x g’de 1 dk. santrifüj edildi ve collection tüpleri atılarak yerlerine yeni tüpler yerleştirildi.
6. Sonrasında her bir tüpe 450 µl Wash Buffer (20 mM NaCI, 2 mM Tris-HCI, pH: 7.5) eklendi ve 8 000 x g’de 1 dk. santrifüj edildikten sonra collection tüpleri atılırak yeni tüpler yerleştirildi.
7. Tekrar 450 µl Wash Buffer eklenerek 8 000 x g’ de 1 dk. santrifüj edildi.
8. Sonrasında 10 s kadar tekrar santrifüj yapıldıktan sonra collection tüpleri atıldı ve yerine eppendorf tüpleri yerleştirildi.
9. Filtreli kısıma 50 µl Elution Buffer (Nükleaz free saf su) eklenerek, 8 000 x g’de 1 dk. santrifüj edildi.
10. Son aşamada ise, filtreli kolonlar atıldı ve eppendorf tüplerindeki ekstraksiyon ürünleri etiketlenerek -20 oC’ye kaldırıldı.
2.2.2. Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
RNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen örneklerin, İnvitrogen ve Roche olmak üzere her iki kitlede RT-PCR’ı yapıldı.
• İnvitrogen Kitine göre RT-PCR;
2X Reaksiyon Mix 25 µl
Template RNA 1-5 µl
Sense primer (10 µM) 1 µl
Anti-sense primer (10 µM) 1 µl SuperScript III Taq DNA polymerase mix 2 µl
RNase free su 50 µl’ye tamamlandı.
• Roche Kitine göre RT-PCR; 1. Basamak: dNTP mix 2 µl DMSO 2,5 µl DTT 2,5 µl RNase Inhibitor 0,5 µl Upstream primer 1 µl Downstream primer 1 µl Template RNA 1-5 µl
RNase free su 25 µl’ye tamamlandı.
2. Basamak:
RNase free su 13 µl
5X RT-PCR buffer 10 µl
23
İki basamak sonucunda numunelerin toplam hacmi 50 µl’ye tamamlanacak şekilde hazırlandı.
RT-PCR işleminde, S1 ve S3 için ccss-F2 (5'-TGG ACA CCT TCA CAA ACT C-3'),ccss-R2 (5'-GAC AAA TTC CCT GCA CCA-3') primerleri kullanılırken, S2 ve S4 için ise chv CL2-R CAC TGG CAT TGC CCT TG-3'), chvgs 1667-F (5'-AAG AAA CAC GTG CCG CTT A-3') primerleri kullanıldı.
2.2.2.1. Thermal cycler’ın Program Ayarı
Thermal cycler’ın programı; Denatürasyon için 94 0C’de 2dk.’ya, 58 0C’de 15 s (annealing), 72 0C’de 1dk.’ya (extension) ve Final extension için ise 72 0C’de 5 dk.’ya ayarlandı.
2.2.3. Agaroz Jel Elektroforezi
RT-PCR işlemi sonucunda oluşan PCR ürünleri aşağıda açıklandığı şekilde %1’lik Agaroz jel elektroforezde koşturulmuş ve görüntülenmiştir. Kısaca, Agaroz 5 µl Etidyum bromür bulunan 50 ml TAE (pH’ı 7.5-8.5 olan yaklaşık 50 mM) tamponu içinde bir mikrodalga fırın kullanılarak tamamen çözdürülür ve tarak yerleştirilmiş bir elektroferez tankına dökülür. Jel katılaştıktan sonra tank 350 ml TAE tamponu ile doldurulur. 2 µl Bromfenol blue (BFB) ve 5 µl örnek karışımı jeldeki kuyucuklara yüklenir. Jelin ilk kuyucuğuna ise 2 µl MW (100 bp) standardı eklenir. Örnekler 100 mA’de yaklaşık 30 dakika koşturulur. Koşturma işleminden sonra Agaroz jel bir UV transillüminatör kullanılararak görüntülenir ve fotoğraflanır (Şekil 2.1).
Şekil 2.1 RT-PCR sonrası PCR ürünlerinin Agaroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanarak görüntülenmesi (MW: Moleküler ağırlık standart, NK: Negatif Kontrol, PK: Pozitif Kontrol ve S1, S2: Örnek1 ve Örnek2)
2.2.4. Jelden DNA Saflaştırılması
Dizi analizinde kullanmak üzere PCR ürünlerinin bir kısmı jelden Qiagen’nin ‘QIAquick Gel Extraction kiti’ kullanılarak saflaştırılmıştır. Kısaca, elde edilen ürün, % 2’lik agaroz jel elektroforezinde yürütülür, oluşan bantlar jelden kesilip çıkartıldıktan sonra mikrosantrifüj tüpüne alınır.
Qiagen kiti ile 4 örneğin aşağıda belirtildiği gibi jel ekstraksiyonu yapılmıştır:
1. Jelden alınan bantlara 900 µl Buffer QG eklenildi.
2. Sonrasında, 50 0C’de 10 dk. inkübasyon yapıldı (2-3 dk. da bir vorteks).
3. İnkübasyon bittikten sonra 10 µl 3M Sodyum asetat (pH:5.0) eklendi ve rengi sarıya dönüştükten sonra 300 µl İsopropanol ilave edildi.
25
5. 2 ml’lik filtreli kolonlara 800 µl hazırlanan karışımdan ilave edilerek, 13 000 rpm’de 1 dk. santrifüj edilir ve sonrasında collection tüpler atılıp yerine yeni tüpler yerleştirildi.
6. 500 µl Buffer QG (Guanidine thiocyanate) ilave edildi.13 000 rpm’de 1 dk. santrifüj edildikten sonra, collection tüpler atılıp yerine yeni tüpler yerleştirildi.
7. 750 µl Buffer PE (DMSO, Tween 20) ilave edildi. 13 000 rpm’de 1 dk. santrifüj edildikten sonra tüpler değiştirilmeden tekrar 1dk. santrifüj edildi. Collection tüpler atılıp yerine ependorf tüpler yerleştirildi.
8. Tüplere 50 µl Buffer EB (10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA, pH: 8.0) ilave edildi (DNA konsantrasyonunun daha yoğun olması için, 30 µl Buffer EB ilave edilir). 13 000 rpm’de 1 dk. santrifüj edildikten sonra filtreli kolonlar atıldı ve eppendorf tüplerinde kalan ekstraksiyon ürünü etiketlenerek -20 0C’ye kaldırıldı.
2.2.5. DNA Dizi Analizi
Jel ekstraksiyonu sonucunda elde edilen saf DNA’nın nükleotid dizilerini belirleyebilmek için numuneler, primerler ve gerekli bütün bilgiler İontek firmasına gönderildi. 1-2 hafta içinde çift zincirli DNA nükleotid dizileri belirlendi.
3. BULGULAR ve TARTIŞMA
3.1. KKKA Pozitif Örneklerin RT-PCR Yöntemi ile Tespiti ve PCR Ürünlerinin DNA Dizi Analizi
Bu çalışmada RT-PCR yöntemi kullanılarak elde edilen PCR ürünlerinin DNA dizi analizi yaptırılarak, PCR ürününün dizi konfirmasyonu yapılmıştır. Aşağıda KKKA pozitif sonuç veren örneklerden birinin DNA dizisi (1423 bç) verilmiştir. Buna göre bu örnekten elde edilen Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) virüsünün (GOU-OT07) S segmentinin (Nükleokapsid proteini) 1423 bç’lik kısmının dizi analizi aşağıda gösterildiği gibidir (Çizelge 3.1).
Çizelge 3.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün S segmentinin 1423 bç’lik kısmının dizi analiz sonucu 1 caggttctctgagtgtctgcaatggaaaacaagatcgaggtgaacagcaa 50 51 agatgagatgaacaaatggtttgaggagtttaaaaagggaaatggactta 100 101 tggacactttcacaaactcctactccttttgtgagaatgtaccaaatctg 150 151 gataagtttgtgttccagatggccagcgccacggatgatgcacagaagga 200 201 ctccatctatgcatcggctctagtggaagcaaccaagttctgtgccccca 250 251 tatatgaatgtgcttgggtcagctctactggcattgtgaagaaggggctt 300 301 gagtggttcgagaagaattcaggaaccatcaaatcttgggatgagaacta 350 351 tgctgagctgaaggttgatgttcccaaaatagaacaacttgccaattacc 400 401 aacaggctgctctcaagtggaggaaggacataggtttccgtgtcaacgca 450 451 aacacggcagccttaagcaacaaagtccttgcagaatacaaagtccctgg 500 501 tgaaattgtgatgtccgttaaagaaatgctgtcagacatgattagaagga 550 551 ggaatctaattctcaacaggggcggtgatgaaaatccacgcggcccagtg 600 601 agccgtgaacatgtggagtggtgcagggaatttgtcaaaggcaagtacat 650 651 catggctttcaatccaccttggggagacatcaacaaatcaggtcgttcgg 700 701 gaatagcacttgttgcaacaggccttgccaagcttgcagagaccgagggg 750 751 aaaggagtttttgacgaagctaagaagaccgtggaggctctcaatgggta 800 801 tttggacaaacacagggacgaagttgacaaagcaagtgctgacagcatga 850 851 taacaaacctcctaaagcacattgccaaagcacaggagctttataaaaat 900 901 tcatctgctcttcgtgcacaaggtgcacagattgacacccctttcagctc 950
27
Çizelge 3.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün S segmentinin 1423 bç’lik kısmının dizi analiz sonucu (devamı) 951 gttttactggctctacaaggccggtgtgactccagagaccttcccaacca 1000 1001 tctcacagttccttttcgaactggggaagcagccaagggggaccaaaaaa 1050 1051 atgaaaaaggcactcctgagcactccaatgaagtgggggaagaaacttta 1100 1101 tgagctctttgctgatgactctttccagcagaacagaatctacatgcacc 1150 1151 ctgctgtgttgacagccggtagaatcagtgaaatgggtgtctgctttgga 1200 1201 acaatccctgttgccaatcctgatgatgctgctcagggatctggacatac 1250 1251 caagtccattctcaaccttcggacaagcacagagaccaacaatccatgcg 1300 1301 ccaagacaattgtcaaattatttgaaatccaaaaaacaggatttaacata 1350 1351 caggacatggacattgtggcctctgagcacttgctgcaccaatcccttgt 1400 1401 ggcaagcattcctccaacacgcc 1423
3.2. KKKA Pozitif Sonuç Veren Örneğin Amino asit Dizisi
Yukarıda verilen ve DNA dizisi yapılmış 1423 bç’lik nükleotid dizisi EXPASY bilgi bankasından (www.expasy.ch/translate) ‘translate’ opsiyonu kullanılarak amino asit dizisine transle edilmiştir. Buna göre GOU-OT07 örneğinin amino asit dizisi (467 amino asit) aşağıda belirtildiği gibidir (Çizelge 3.2).
Çizelge 3.2 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi virüsünün S segmentinin 1423 bç’lik kısmının amino asit dizisi MENKIEVNSKDEMNKWFEEFKKGNGLMDTFTNSYSFCENVPNLDKFVFQMASATDDAQKDSIY ASALVEATKFCAPIYECAWVSSTGIVKKGLEWFEKNSGTIKSWDENYAELKVDVPKIEQLANYQ QAALKWRKDIGFRVNANTAALSNKVLAEYKVPGEIVMSVKEMLSDMIRRRNLILNRGGDENPR GPVSREHVEWCREFVKGKYIMAFNPPWGDINKSGRSGIALVATGLAKLAETEGKGVFDEAKKT VEALNGYLDKHRDEVDKASADSMITNLLKHIAKAQELYKNSSALRAQGAQIDTPFSSFYWLYKA GVTPETFPTISQFLFELGKQPRGTKKMKKALLSTPMKWGKKLYELFADDSFQQNRIYMHPAVLT AGRISEMGVCFGTIPVANPDDAAQGSGHTKSILNLRTSTETNNPCAKTIVKLFEIQKTGFNIQDMD IVASEHLLHQSLVASIPPTR
3.3. KKKA Pozitif Örneğin (GOU-OT07) Diğer KKKA S Segmentleriyle Benzerlik Analizi ve Soyağacı
Elde ettiğimiz 1423 bç’lik nükleotid dizisi ile diğer çalışılmış nükletid dizileri arasındaki benzerlikler aşağıda belirtildiği gibidir (Çizelge 3.3).
Çizelge 3.3 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile KKKA virüsü (AY277676.2) S segmentinin 1673 bç’lik kısmının benzerliklerinin gösterilmesi
Query 1 CAG-GTTCTC-TGAGTGTCTGC--AATGGAAAACAAGATCGAGGTGAACAGCAAAGATGA 56 ||| |||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 31 CAGTGTTCTCTTGAGTGTCTGCAAAATGGAAAACAAGATCGAGGTGAACAGCAAAGATGA 90 Query 57 GATGAACAAATGGTTTGAGGAGTTTAAAAAGGGAAATGGACTTATGGACACTTTCACAAA 116 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 91 GATGAACAAATGGTTTGAGGAGTTTAAAAAGGGAAATGGACTTATGGACACTTTCACAAA 150 Query 117 CTCCTACTCCTTTTGTGAGAATGTACCAAATCTGGATAAGTTTGTGTTCCAGATGGCCAG 176 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 151 CTCCTACTCCTTTTGTGAGAATGTACCAAATCTGGATAAGTTTGTGTTCCAGATGGCCAG 210 Query 177 CGCCACGGATGATGCACAGAAGGACTCCATCTATGCATCGGCTCTAGTGGAAGCAACCAA 236 |||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 211 CGCCACTGATGATGCACAGAAGGACTCTATCTATGCATCGGCTCTAGTGGAAGCAACCAA 270 Query 237 GTTCTGTGCCCCCATATATGAATGTGCTTGGGTCAGCTCTACTGGCATTGTGAAGAAGGG 296 ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 271 GTTCTGTGCACCCATATATGAATGTGCTTGGGTCAGCTCCACTGGCATTGTGAAGAAGGG 330 Query 297 GCTTGAGTGGTTCGAGAAGAATTCAGGAACCATCAAATCTTGGGATGAGAACTATGCTGA 356 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 331 GCTTGAGTGGTTCGAGAAGAATTCAGGAGCCATCAAATCTTGGGATGAGAACTATGTTGA 390 Query 357 GCTGAAGGTTGATGTTCCCAAAATAGAACAACTTGCCAATTACCAACAGGCTGCTCTCAA 416 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 391 GCTGAAGGTTGATGTTCCCAAAATAGAACAACTTGCCAATTACCAACAGGCTGCTCTCAA 450 Query 417 GTGGAGGAAGGACATAGGTTTCCGTGTCAACGCAAACACGGCAGCCTTAAGCAACAAAGT 476 |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 451 GTGGAGGAAGGACATAGGTTTCCGTGTCAATGCAAACACGGCAGCCTTAAGCAACAAAGT 510 Query 477 CCTTGCAGAATACAAAGTCCCTGGTGAAATTGTGATGTCCGTTAAAGAAATGCTGTCAGA 536 |||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 511 CCTTGCAGAATATAAAGTCCCTGGCGAAATTGTGATGTCTGTTAAAGAAATGCTGTCAGA 570 Query 537 CATGATTAGAAGGAGGAATCTAATTCTCAACAGGGGCGGTGATGAAAATCCACGCGGCCC 596 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| Sbjct 571 CATGATTAGAAGGAGGAATCTAATTCTCAACAGGGGCAGTGATGAAAATCCACGCGGCCC 630 Query 597 AGTGAGCCGTGAACATGTGGAGTGGTGCAGGGAATTTGTCAAAGGCAAGTACATCATGGC 656 |||||||| |||||||||||| |||||||| |||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 631 AGTGAGCCATGAACATGTGGAATGGTGCAGAGAATTTGTCAAAGGCAAGTATATCATGGC 690 Query 657 TTTCAATCCACCTTGGGGAGACATCAACAAATCAGGTCGTTCGGGAATAGCACTTGTTGC 716 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 691 CTTCAATCCACCTTGGGGAGACATTAACAAATCAGGTCGTTCGGGAATAGCACTTGTTGC 750 Query 717 AACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGACCGAGGGGAAAGGAGTTTTTGACGAAGCTAAGAA 776 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 751 AACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGACCGAGGGGAAAGGAGTTTTTGACGAAGCTAAGAA 810 Query 777 GACCGTGGAGGCTCTCAATGGGTATTTGGACAAACACAGGGACGAAGTTGACAAAGCAAG 836 ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 811 GACCGTGGAGGCTCTCAATGGGTATTTGGACAAGCACAGGGACGAAGTTGACAAAGCAAG 870 Query 837 TGCTGACAGCATGATAACAAACCTCCTAAAGCACATTGCCAAAGCACAGGAGCTTTATAA 896 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 871 TGCTGACAGCATGATAACAAACCTCCTAAAGCACATTGCCAAAGCACAAGAGCTTTATAA 930 Query 897 AAATTCATCTGCTCTTCGTGCACAAGGTGCACAGATTGACACCCCTTTCAGCTCGTTTTA 956 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 931 AAATTCATCTGCTCTTCGTGCACAAGGTGCACAGATTGACACCCCTTTCAGCTCATTTTA 990 Query 957 CTGGCTCTACAAGGCCGGTGTGACTCCAGAGACCTTCCCAACCATCTCACAGTTCCTTTT 1016 |||||||||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 991 CTGGCTCTACAAAGCCGGTGTGACTCCAGAGACTTTCCCAACCATCTCACAGTTCCTTTT 1050
29
Çizelge 3.3 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile KKKA virüsü (AY277676.2) S segmentinin 1673 bç’lik kısmının benzerliklerinin gösterilmesi (devamı)
Query 1017 CGAACTGGGGAAGCAGCCAAGGGGGACCaaaaaaatgaaaaaGGCACTCCTGAGCACTCC 1076 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1051 CGAACTGGGGAAGCAGCCAAGGGGGACCAAAAAAATGAAAAAGGCACTCCTGAGCACTCC 1110 Query 1077 AATGAAGTGGGGGAAGAAACTTTATGAGCTCTTTGCTGATGACTCTTTCCAGCAGAACAG 1136 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1111 AATGAAGTGGGGGAAGAAACTTTATGAGCTCTTTGCTGATGACTCTTTCCAGCAGAACAG 1170 Query 1137 AATCTACATGCACCCTGCTGTGTTGACAGCCGGTAGAATCAGTGAAATGGGTGTCTGCTT 1196 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1171 AATCTACATGCACCCTGCTGTGTTGACAGCCGGTAGAATCAGTGAAATGGGTGTCTGCTT 1230 Query 1197 TGGAACAATCCCTGTTGCCAATCCTGATGATGCTGCTCAGGGATCTGGACATACCAAGTC 1256 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1231 TGGAACAATCCCTGTTGCCAATCCTGATGATGCTGCTCAGGGATCTGGACATACCAAGTC 1290 Query 1257 CATTCTCAACCTTCGGACAAGCACAGAGACCAACAATCCATGCGCCAAGACAATTGTCAA 1316 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1291 CATTCTCAACCTTCGGACAAGCACAGAGACCAACAATCCATGCGCCAAGACAATTGTCAA 1350 Query 1317 ATTATTTGAAATCCAAAAAACAGGATTTAACATACAGGACATGGACATTGTGGCCTCTGA 1376 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 1351 ATTATTTGAAATCCAAAAAACAGGATTTAACATACAGGACATGGACATTGTAGCCTCTGA 1410 Query 1377 GCACTTGCTGCACCAATCCCTTGT-GGCAAGCATTCCTCCA 1416 |||| ||||||||||||||||||| |||||||| || |||| Sbjct 1411 GCACCTGCTGCACCAATCCCTTGTCGGCAAGCAATC-TCCA 1450
Bulgaristan’da çalışılmış KKKA virüsünün (AY277676.2) S segment nükleotid dizisi ile verimiz arasında %97’lik (1390/1421 nükleotid oranı) bir benzerlik bulunmaktadır.
Çizelge 3.4 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile KKKA virüsü (DQ206447.1) S segmentinin (ROS/HUVLV-100 strain) 1673 bç’lik kısmının benzerliklerinin gösterilmesi Query 1 CAG-GTTCTC-TGAGTGTCTGC--AATGGAAAACAAGATCGAGGTGAACAGCAAAGATGA 56 ||| |||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 31 CAGTGTTCTCTTGAGTGTCTGCAAAATGGAAAACAAGATCGAGGTGAACAGCAAAGATGA 90 Query 57 GATGAACAAATGGTTTGAGGAGTTTAAAAAGGGAAATGGACTTATGGACACTTTCACAAA 116 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 91 GATGAACAAATGGTTTGAGGAGTTTAAAAAGGGAAATGGACTTATGGACACTTTCACAAA 150 Query 117 CTCCTACTCCTTTTGTGAGAATGTACCAAATCTGGATAAGTTTGTGTTCCAGATGGCCAG 176 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 151 CTCCTACTCCTTTTGTGAGAATGTACCAAATCTGGATAAGTTTGTGTTCCAGATGGCCAG 210 Query 177 CGCCACGGATGATGCACAGAAGGACTCCATCTATGCATCGGCTCTAGTGGAAGCAACCAA 236 |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| Sbjct 211 CGCCACTGATGATGCACAGAAGGACTCCATCTATGCATCGGCTCTGGTGGAAGCAACCAA 270 Query 237 GTTCTGTGCCCCCATATATGAATGTGCTTGGGTCAGCTCTACTGGCATTGTGAAGAAGGG 296 ||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 271 GTTCTGTGCACCCATATATGAATGTGCCTGGGTCAGCTCTACCGGCATTGTGAAGAAGGG 330 Query 297 GCTTGAGTGGTTCGAGAAGAATTCAGGAACCATCAAATCTTGGGATGAGAACTATGCTGA 356 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 331 GCTTGAGTGGTTCGAGAAGAATTCAGGAACCATCAAATCCTGGGATGAGAACTATGCTGA 390 Query 357 GCTGAAGGTTGATGTTCCCAAAATAGAACAACTTGCCAATTACCAACAGGCTGCTCTCAA 416 ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||| sbjct 391 GCTGAAGGTTGATGTTCCCAAAATAGAACAACTCGCCAATTACCAGCAGGCTGCTCTCAA 450
Çizelge 3.4 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile KKKA virüsü (DQ206447.1) S segmentinin (ROS/HUVLV-100 strain) 1673 bç’lik kısmının benzerliklerinin gösterilmesi (devamı) Query 417 GTGGAGGAAGGACATAGGTTTCCGTGTCAACGCAAACACGGCAGCCTTAAGCAACAAAGT 476 |||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| || Sbjct 451 GTGGAGGAAGGACATAGGTTTCCGTGTCAATGCAAACACGGCAGCCTTAAGCAACAAGGT 510 Query 477 CCTTGCAGAATACAAAGTCCCTGGTGAAATTGTGATGTCCGTTAAAGAAATGCTGTCAGA 536 |||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 511 CCTTGCAGAATATAAAGTCCCTGGCGAAATTGTGATGTCTGTTAAAGAAATGCTGTCAGA 570 Query 537 CATGATTAGAAGGAGGAATCTAATTCTCAACAGGGGCGGTGATGAAAATCCACGCGGCCC 596 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 571 CATGATTAGAAGGAGGAATCTAATTCTCAACAGGGGCGGTGATGAAAATCCGCGCGGCCC 630 Query 597 AGTGAGCCGTGAACATGTGGAGTGGTGCAGGGAATTTGTCAAAGGCAAGTACATCATGGC 656 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 631 AGTGAGCCGTGAACATGTGGAGTGGTGCAGGGAATTTGTCAAAGGCAAGTACATCATGGC 690 Query 657 TTTCAATCCACCTTGGGGAGACATCAACAAATCAGGTCGTTCGGGAATAGCACTTGTTGC 716 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| Sbjct 691 CTTCAATCCACCTTGGGGGGACATCAACAAATCAGGCCGTTCGGGAATAGCACTTGTTGC 750 Query 717 AACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGACCGAGGGGAAAGGAGTTTTTGACGAAGCTAAGAA 776 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 751 AACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGACCGAGGGGAAAGGAGTTTTTGACGAAGCCAAGAA 810 Query 777 GACCGTGGAGGCTCTCAATGGGTATTTGGACAAACACAGGGACGAAGTTGACAAAGCAAG 836 ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 811 GACCGTGGAGGCTCTCAATGGGTATTTGGACAAGCACAGGGACGAAGTTGACAAAGCAAG 870 Query 837 TGCTGACAGCATGATAACAAACCTCCTAAAGCACATTGCCAAAGCACAGGAGCTTTATAA 896 ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 871 TGCTGACAGCATGATAACAAACCTCCTGAAGCACATTGCCAAAGCACAAGAGCTTTATAA 930 Query 897 AAATTCATCTGCTCTTCGTGCACAAGGTGCACAGATTGACACCCCTTTCAGCTCGTTTTA 956 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 931 AAATTCATCTGCTCTTCGTGCACAAGGTGCACAGATTGACACCCCTTTCAGCTCGTTTTA 990 Query 957 CTGGCTCTACAAGGCCGGTGTGACTCCAGAGACCTTCCCAACCATCTCACAGTTCCTTTT 1016 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 991 CTGGCTCTACAAGGCCGGTGTGACTCCAGAGACCTTCCCAACTATCTCACAGTTCCTTTT 1050 Query 1017 CGAACTGGGGAAGCAGCCAAGGGGGACCaaaaaaatgaaaaaGGCACTCCTGAGCACTCC 1076 ||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1051 CGAACTGGGGAAGCAACCAAGGGGGACCAAGAAAATGAAAAAGGCACTCCTGAGCACTCC 1110 Query 1077 AATGAAGTGGGGGAAGAAACTTTATGAGCTCTTTGCTGATGACTCTTTCCAGCAGAACAG 1136 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1111 AATGAAGTGGGGGAAGAAACTTTATGAGCTCTTTGCTGATGACTCTTTCCAGCAGAACAG 1170 Query 1137 AATCTACATGCACCCTGCTGTGTTGACAGCCGGTAGAATCAGTGAAATGGGTGTCTGCTT 1196 |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1171 AATCTACATGCACCCTGCTGTGTTAACAGCCGGTAGAATCAGTGAAATGGGTGTCTGCTT 1230 Query 1197 TGGAACAATCCCTGTTGCCAATCCTGATGATGCTGCTCAGGGATCTGGACATACCAAGTC 1256 |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1231 TGGAACAATCCCTGTTGCCAATCCTGATGACGCTGCTCAGGGATCTGGACATACCAAGTC 1290 Query 1257 CATTCTCAACCTTCGGACAAGCACAGAGACCAACAATCCATGCGCCAAGACAATTGTCAA 1316 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1291 CATTCTCAACCTTCGGACAAGCACAGAGACCAACAATCCATGCGCCAAGACAATTGTCAA 1350 Query 1317 ATTATTTGAAATCCAAAAAACAGGATTTAACATACAGGACATGGACATTGTGGCCTCTGA 1376 ||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 1351 ATTGTTTGAAATCCAAAAAACAGGATTTAACATACAGGACATGGACATTGTAGCCTCTGA 1410 Query 1377 GCACTTGCTGCACCAATCCCTTGT-GGCAAGCATTCCTCCA 1416 |||| ||||||||||||||||||| |||||||| || |||| Sbjct 1411 GCACCTGCTGCACCAATCCCTTGTTGGCAAGCAGTC-TCCA 1450
31
Rusya’nın Rostov bölgesinde çalışılmış KKKA virüsünün (DQ206447.1) S segment nükleotid dizisi ile verimiz arasında %97’lik (1385/1421) bir benzerlik bulunmaktadır.
Çizelge 3.5 KKKA virüsü (GOU-OT07) S segmentinin 1423 bç’lik kısmı ile KKKA virüsü (DQ133507.1) S segmentinin (Kosovo Hoti strain) 1673 bç’lik kısmının benzerliklerinin gösterilmesi Query 1 CAG-GTTCTC-TGAGTGTCTGC--AATGGAAAACAAGATCGAGGTGAACAGCAAAGATGA 56 ||| |||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 31 CAGTGTTCTCTTGAGTGTCTGCAAAATGGAAAACAAGATCGAGGTGAACAGCAAAGATGA 90 Query 57 GATGAACAAATGGTTTGAGGAGTTTAAAAAGGGAAATGGACTTATGGACACTTTCACAAA 116 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 91 GATGAACAAATGGTTTGAGGAGTTTAAAAAGGGAAATGGACTTATGGACACTTTCACAAA 150 Query 117 CTCCTACTCCTTTTGTGAGAATGTACCAAATCTGGATAAGTTTGTGTTCCAGATGGCCAG 176 ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 151 CTCCTACTCCTTTTGCGAGAATGTACCAAATCTGGATAAGTTTGTGTTCCAGATGGCCAG 210 Query 177 CGCCACGGATGATGCACAGAAGGACTCCATCTATGCATCGGCTCTAGTGGAAGCAACCAA 236 |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| Sbjct 211 CGCCACTGATGATGCACAGAAGGACTCCATCTATGCATCGGCTCTGGTGGAAGCAACCAA 270 Query 237 GTTCTGTGCCCCCATATATGAATGTGCTTGGGTCAGCTCTACTGGCATTGTGAAGAAGGG 296 ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 271 GTTCTGTGCACCCATATATGAATGTGCTTGGGTCAGCTCTACTGGCATTGTGAAGAAGGG 330 Query 297 GCTTGAGTGGTTCGAGAAGAATTCAGGAACCATCAAATCTTGGGATGAGAACTATGCTGA 356 |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 331 GCTTGAGTGGTTTGAGAAGAATTCAGGAACCATCAAATCTTGGGATGAGAACTATGCTGA 390 Query 357 GCTGAAGGTTGATGTTCCCAAAATAGAACAACTTGCCAATTACCAACAGGCTGCTCTCAA 416 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 391 GCTGAAGGTTGATGTTCCCAAAATAGAACAACTTGCCAATTACCAACAGGCTGCTCTCAA 450 Query 417 GTGGAGGAAGGACATAGGTTTCCGTGTCAACGCAAACACGGCAGCCTTAAGCAACAAAGT 476 |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 451 GTGGAGGAAGGACATAGGTTTCCGTGTCAATGCAAACACGGCAGCCTTAAGCAACAAAGT 510 Query 477 CCTTGCAGAATACAAAGTCCCTGGTGAAATTGTGATGTCCGTTAAAGAAATGCTGTCAGA 536 |||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 511 CCTTGCAGAATATAAAGTCCCTGGCGAAATTGTGATGTCTGTTAAAGAAATGCTGTCAGA 570 Query 537 CATGATTAGAAGGAGGAATCTAATTCTCAACAGGGGCGGTGATGAAAATCCACGCGGCCC 596 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 571 CATGATTAGAAGGAGGAATCTAATTCTCAACAGGGGCGGTGATGAAAATCCACGCGGCCC 630 Query 597 AGTGAGCCGTGAACATGTGGAGTGGTGCAGGGAATTTGTCAAAGGCAAGTACATCATGGC 656 ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 631 AGTGAGCCGTGAACATGTGGAGTGGTGCAGGGAGTTTGTCAAAGGCAAGTACATCATGGC 690 Query 657 TTTCAATCCACCTTGGGGAGACATCAACAAATCAGGTCGTTCGGGAATAGCACTTGTTGC 716 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||| Sbjct 691 CTTCAATCCACCTTGGGGGGACATCAACAAATCAGGCCGTTCAGGAATAGCACTTGTTGC 750 Query 717 AACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGACCGAGGGGAAAGGAGTTTTTGACGAAGCTAAGAA 776 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||| Sbjct 751 AACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGACCGAGGGGAAAGGAGTCTTTGACGAAGCAAAGAA 810 Query 777 GACCGTGGAGGCTCTCAATGGGTATTTGGACAAACACAGGGACGAAGTTGACAAAGCAAG 836 ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 811 GACCGTGGAGGCTCTCAATGGGTATTTGGACAAGCACAGGGACGAAGTTGACAAAGCAAG 870 Query 837 TGCTGACAGCATGATAACAAACCTCCTAAAGCACATTGCCAAAGCACAGGAGCTTTATAA 896 ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 871 TGCCGACAGCATGATAACAAACCTCCTAAAGCACATTGCCAAAGCACAAGAGCTTTATAA 930
