MANYETİK NANOPARTİKÜLLER KULLANILARAK YÜZEYDE GÜÇLENDİRİLMİŞ RAMAN SPEKTROMETRİSİ İLE İMMUNOASSAY
SİSTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ
Mustafa Ersin PEKDEMİR
Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Prof. Dr. Muzaffer CAN
2011
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİMDALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
MANYETİK NANOPARTİKÜLLER KULLANILARAK YÜZEYDE
GÜÇLENDİRİLMİŞ RAMAN SPEKTROMETRİSİ İLE
İMMUNOASSAY SİSTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ
Mustafa Ersin PEKDEMİR
TOKAT 2011
i
MANYETİK NANOPARTİKÜLLER KULLANILARAK YÜZEYDE GÜÇLENDİRİLMİŞ RAMAN SPEKTROMETRİSİ İLE İMMUNOASSAY
SİSTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ Mustafa Ersin PEKDEMİR Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Muzaffer CAN
Bu çalışmada, yüzeyi güçlendirilmiş Raman spektrometrisi (SERS) ile Staphylococcal Enteretoksin B (SEB)’ in ultrahassas tayini için basit ve oldukça seçici bir homojen sandviç immünoassay sistemi geliştirilmiştir. Analizde SEB yakalama aracı olarak basit bir mıknatısla toplanabilen, antikorla etkileştirilmiş manyetik altın nanoçubuk partikülleri kullanılmıştır. Örnek matriksinden SEB ayrıldıktan sonra, altın nanoçubuk partiküllerinin yardımıyla spesifik antikor-antijen çifti kullanılarak sandviç forma getirilmiştir. Altın nanoçubuk partikülleri SERS aktif molekülü (5-5’-Ditiobis (2-Nitrobenzoik asit), DTNB) ile tek tabaka halinde modifiye edilmiş ve DTNB’ nin karboksil grupları uygun antikor problarıyla eşleştirilmiştir. SERS sinyali ve SEB konsantrasyonu arasındaki ilişki 0,3 µM ile 3 fM lineer aralığında olduğu bulunmuştur. Homojen assay sistemi için tayin limiti 2×10-11
mg/mL (ca. 768 aM, 9250 SEB molekülü / 20 µL örnek hacmi) olarak bulunmuştur. Geliştirilen metot daha sonra yapay olarak kontamine edilmiş sütte SEB tayini için değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu metot bovin serum albumin (BSA) ve avidin üzerinde SEB spesifikliğini incelemek için de kullanılmıştır.
2011, 69 sayfa
Anahtar Kelimeler: SERS, Altın kaplı manyetik nanoçubuk, Altın nanoçubuk,
ii
DEVELOPMENT OF MAGNETIC NANOPARTICLE BASED IMMUNOASSAY SYSTEM VIA SURFACE ENHANCED RAMAN SPECTROSCOPY
Mustafa Ersin PEKDEMİR Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry
Supervisor : Prof. Dr. Muzaffer CAN
In this study, simple and highly selective homogeneous sandwich immunoassay was developed for ultrasensitive detection of Staphylococcal Enterotoxin B (SEB) using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) probe. The assay uses polyclonal-antibody functionalized magnetic gold nanorod particles as capture probes for SEB, which can be collected via a simple magnet. After separating SEB from the sample matrix, they are sandwiched by using binding specific antibody-antigen pairs with the help of gold nanorod particles. Gold nanorod particles are bifunctional by design and contain self – assembled monolayers (SAMs) of SERS tag molecule (5,5 – Dithiobis (2–Nitrobenzoic acid), DTNB) and carboxylic functionalities of DTNB for coupling with suitable antibody probes. The correlation between the SEB concentration and SERS signal was found to be linear within the range of 3 fM to 0.3 µM. The limit of
detection for homogeneous assays was determined to be 2 x 10-11 mg/mL (ca. 768 aM,
9250 SEB molecules / 20 µL sample volume. The developed method was further evaluated for detecting SEB in artificially contaminated milk. Besides, the method was also used for investigating the SEB specificity on bovine serum albumin (BSA) and avidin.
2011, 69 pages
Keywords: SERS, Gold coated magnetic nanorod, Gold nanorod, DTNB, SEB,
iii
yardımını esirgemeyen, bana desteğiyle yüksek lisans yapma fırsatı sunan kıymetli hocam Sayın Prof. Dr. Muzaffer CAN’ a teşekkürlerimi sunarım.
Yüksek lisans tezini planlayıp yöntem, bilgi ve tecrübesi ile çalışmalarıma yön veren, tezimin her aşamasında yanımda olan değerli hocam Sayın Doç. Dr. Uğur TAMER’ e teşekkürlerimi sunarım.
Çalışma kapsamında kullanılan nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu konularında yardımlarından dolayı Kimyager Adem ZENGİN, Arş.Gör. Hilal Torul’ a teşekkür ederim.
Her türlü destek ve dostluklarından dolayı Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Öğretim Üyelerine teşekkür ederim.
Çalışmalarım boyunca manevi destekleriyle hep yanımda olan değerli hocam Arş.Gör. Recep TAŞ’ a, can dostum Arş. Gör. Fatih BİRYAN’ a, değerli abim Kimyager Kasım AKSOY’ a çok teşekkür ederim.
Her türlü desteklerinden ötürü başta Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI olmak üzere, Arş. Gör. Ceyda DUDAK ŞEKER, Arş. Gör. Nazife Nur YAZGAN, Arş. Gör. Burcu GÜVEN, Kimyager Erhan TEMUR ve burada isimlerini tek tek sıralayamadığım H.Ü. Gıda Mühendisliği Bölümüne teşekkürlerimi sunarım.
Projemizi kabul eden ve proje süresince maddi desteklerini esirgemeyen TÜBİTAK’ a teşekkürlerimi borç bilirim.
Hayatım Boyunca maddi ve manevi her konuda bana destek olan, hayattaki en değerli varlıklarım; annem Saime PEKDEMİR, babam Kamil PEKDEMİR, kardeşlerim Esra ve Zeynep PEKDEMİR’ e sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Bu tez TÜBİTAK tarafından 108T794 proje numarası ile desteklenmiştir.
Mustafa Ersin PEKDEMİR Tokat, 2011
iv ÖZET ……….. i ABSTRACT ………... ii TEŞEKKÜR ………... iii ŞEKİLLER DİZİNİ ………... vi ÇİZELGELER DİZİNİ ……….. viii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ……….... ix 1. GİRİŞ ... 1 2. GENEL BİLGİLER ... 3 2.1. Nanopartiküller ... 3
2.1.1. Nanopartiküllerin Kullanım Alanları ... 5
2.1.2. Nanopartiküllerin avantaj ve dezavantajları ... 6
2.2. Manyetik Partiküller... 6
2.2.1. Ferrosıvılar ... 6
2.2.2. Manyetik Nanopartiküller ... 7
2.3. Antikor ... 8
2.4. Staphylococcus Enteretoksin B (SEB) ... 10
2.4.1. SEB Semptomları ... 11
2.4.2. Biyolojik Silah Olarak SEB ... 11
2.5. Raman Spektroskopisi ... 12
2.6. Yüzeyi Güçlendirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS) ... 16
2.6.1. Biyolojik Uygulamaları ... 17
2.6.2. SERS Substratı Olarak Kullanılan Nanopartiküller ... 18
2.7. Fe3O4 – Au Manyetik Nanoçubuklar ... 21
2.8. Literatür Özetleri ……….23
2. MATERYAL ve METOD ... 26
3.1. Materyal ... 26
3.1.1. Kimyasal ve Biyokimyasal Malzemeler ... 26
3.1.2. Kullanılan Cihazlar ... 27
3.1.2.1. Santrifüj Aleti ... 27
3.1.2.2. Ultrasonik Banyo ... 27
3.1.2.3. SERS Ölçüm Düzeneği ... 28
3.1.2.4. UV-Visible Spektrofotometre Düzeneği ... 29
3.1.2.5. Geçirgenli Elektron Mikroskopu Ölçüm Düzeneği ... 29
3.2. Metot ... 30
3.2.1. Demir Nanopartiküllerin Sentezi ... 30
3.2.2. Küresel Yapıda Altın Kaplı Fe3O4 Nanopartiküllerin Sentezi ... 31
3.2.3. Altın Kaplı Manyetik Nanopartiküllerden Altın Kaplı Nano-çubuk Sentezi ……….32
3.2.4 Altın Nanoçubuk Sentezi ………..34
v
3.2.10. SEB Toksininin Hazırlanması ve Partiküle Bağlanması ………...38
3.2.11. Sandviç immunoanaliz için Yapının Tamamlanması ………...38
4. BULGULAR ... 41
4.1. Nanopartiküllerin Karakterizasyonu ... 41
4.2. Sandviç Yapısının Tamamlanmasından Sonra SERS ile SEB Tayini ... 49
4.3. Geliştirilen Metodun Validasyonu ... 51
4.4. Kontrol Deneyleri ... 51
4.4.1. Avidin ... 51
4.4.2. Bovin Serum Albumin (BSA) ... 53
4.5. Gerçek Süt Örneklerinde SEB Tayini ... 54
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 57
6. KAYNAKLAR ... 59
vi
Şekil 2.2. Antikor - Antijen ilişkisi ... 9
Şekil 2.3. Üzüm şekilndeki Staphylococcal aureus kümecikleri ... 10
Şekil 2.4. SEB’ in üç boyutlu yapısı... 11
Şekil 2.5. Stokes ve anti-Stokes türü Raman saçılması olaylarının molekül enerji diyagramı ile açıklanması ... 13
Şekil 2.6. Stokes ve anti-Stokes hatları ... 14
Şekil 2.7. CO2 molekülüne ait polarlanabilirlik ... 14
Şekil 3.1. Ultrasonik Banyo... 27
Şekil 3.2. Delta Nu Raman mikroskop ... 28
Şekil 3.3. Agilent UV-Visible Spektrofotometre ... 29
Şekil 3.4. Nanopartiküllerin sentez aşamalarının şematik gösterimi A)Demir nanopartiküllerinin B)Manyetik altın kaplı nanokürelerin sentezi 32 Şekil 3.5. Manyetik altın kaplı nanoçubukların sentezi ... 34
Şekil 3.6. Altın nanoçubukların kimyasal sentezi ... 35
Şekil 3.7. 3-merkapto propiyonik asit ve 11-merkapto undekanoik asit yapısı ………..36
Şekil 3.8. 5-5’Ditiobis merkapto Nitrobenzoik asit kimyasal yapısı ………....36
Şekil 3.9. DTNB ile altın nanoçubuk modifikasyonunun gösterimi ………...37
Şekil 3.10. Altın kaplı manyetik nanoçubuk ve altın nanoçubuk partikülleri yardımıyla SEB toksinine dayalı analiz sistemi ………..………39
Şekil 4.1.Fe3O4 ve Fe3O4 - Au nanopartiküllerine ait UV-Vis Spektrumları ... 41
Şekil 4.2.Kimyasal olarak sentezlenen demir nanopartiküllerinin SEM görüntüsü ... 42
Şekil 4.3. Demir nanopartiküllerinin TEM fotoğrafları ... 43
Şekil 4.4. Altın kaplı Fe3O4 nanopartiküllerinin TEM fotoğrafı ... 44
Şekil 4.5. Demir altın nanopartiküllerinin yüksek çözünürlüklü TEM fotoğrafları ... 44
Şekil 4.6. Dış manyetik alan olmadığı ve dış manyetik alan uygulandığında demir-altın nanopartiküllerin çözeltiden toplanması ... 45
vii
Şekil 4.9. Sentezlenen manyetik demir altın nanoçubukların TEM görüntüsü ... 48 Şekil 4.10. Dış manyetik alan olmadığı ve dış manyetik alan uygulandığında çubuk şeklindeki demir altın nanopartiküllerin çözeltiden toplanması ... 48
Şekil 4.11. DTNB’nin 10-1
-10-13 mg/ml SEB derişimleri arasında manyetik
altın nanoçubuklar ve altın nanoçubuklar varlığında gösterdiği simetrik NO2 gerilme pikleri a) SEB yok b) 10-13 mg/ml, c) 10-11 mg/ml,
d) 10-9 mg/ml, e) 10-7 mg/ml, f) 10-5 mg/ml, g) 10-3 mg/ml,
h) 10-1 mg/ml ………49
Şekil 4.12. Farklı SEB derişimleri varlığında elde edilen kalibrasyon eğrisi………..50
Şekil 4.13. DTNB’ nin 10-1
-10-3-10-5-10-7 mg/ml avidin derişimleri ile
manyetik altın nanoçubular ve altın nanoçubuklar varlığında gösterdiği simetrik NO2 gerilme pikleri……...52
Şekil 4.14. Farklı avidin derişimleri varlığında elde edilen kalibrasyon
eğrisi ...52
Şekil 4.15. DTNB’ nin 10-1
-10-3-10-5-10-7 mg/ml BSA derişimleri ile manyetik altın nanoçubular ve altın nanoçubuklar varlığında
gösterdiği simetrik NO2 gerilme pikleri ………...………..53
Şekil 4.16. Farklı BSA derişimleri varlığında elde edilen kalibrasyon
eğrisi ………...54 Şekil 4.17. DTNB’ nin farklı derişimlerde SEB içeren süt örneği ile manyetik
alan nanoçubuklar ve altın nanoçubuklar varlığında gösterdiği
simetrik NO2 gerilme pikleri a) SEB yok b) 10-11 mg/ml, c) 10-9 mg/ml,
d) 10-7 mg/ml, e) 10-5 mg/ml, f) 10-3 mg/ml, g) 10-1 mg/ml ………...55 Şekil 4.18. Farklı derişimlerde SEB içeren süt örneklerinin partikül-partikül
viii
Çizelge 2.1. Geçiş metalleri ve metal oksitlerin manyetik özellikleri……….8 Çizelge 4.1. 10-6
ve 10-10 mg/mL derişimlerinde SEB içeren süt örneğinden
ix µg mikrogram
nm nanometre µL mikrolitre
rpm dakikadaki devir sayısı K Kelvin
µm mikrometre mg miligram
Kısaltmalar Açıklama
SAM Kendiliğinden Düzenlenen Tabaka TEM Geçirgenli Elektron Mikroskobu SEM Taramalı Elektron Mikroskobu
SERS Yüzeyi Güçlendirilmiş Raman Spektroskopisi SEB Staphylococcus Enterotoksin B
CTAB Heksadesiltrimetil-amonyum bromür
EDC (1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid Hidroklorid) NHS N-Hidroksisülfosüksinimid sodyum tuzu
DTNB 5,5-Ditiobis(2-Nitrobenzoik asit) IMA İmmünomanyetik ayırım
1. GİRİŞ
Nano yapıların optik, elektronik manyetik, termal özelliklerin değişmesi ve yüzeylerinin hacimlerine göre oldukça büyük olmasından dolayı, nanopartiküllerle ilgili deneysel ve teorik çalışmalar günümüzde potansiyel olarak daha yararlı yeni malzemelerin sentezi olarak devam etmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, nanoboyutta sentezlenen malzemelerin çeşitli araştırma alanlarında özellikle tıp, ilaç, elektronik gibi uygulamaya dönük olarak yapılmaktadır. Metal nanopartiküllerin yapısı, boyutu, şekilleri ve yüzey özellikleri uygun kimyasal yöntemlerle kontrol edilebilir. Ayrıca yüzeylerine farklı fonksiyonel kimyasal gruplar takılarak yeni özellikler kazandırılabilir.
Manyetik nanopartiküller manyetik rezonans görüntüleme, veri depolama, ilaç dağıtımındaki potansiyel uygulamalarından dolayı geniş bir etki alanına sahiptir. Ayrıca manyetik nanopartiküller kanser hücreleri için manyetik rezonans ve floresans görüntüsü olarak kullanılmaktadır. Metal nanopartiküllerin analitik amaçlı kullanım alanları yüzeyde güçlendirilmiş raman saçılması ve floresans özellikte biyolojik etiketler olarak sayılabilir.
Yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektrometrisi (SEB)‟ in keşfinden beri, nanomalzemeler ayarlanabilir optik özelliklerinden dolayı SERS substratları olarak önemli ilgi çekmişlerdir. Bu amaç için altın ve gümüş kullanılarak özel substratlar yapılmıştır. Altın ve gümüş partiküllerden yapılan SERS substratları mikroorganizma, protein ve nükleotidleri algılamak için kullanılmıştır.
Proteinler Botulinum, Staphylococcus enterotoxin B (SEB) gibi insan sağlığına zararlı nörotoksinler içerebilirler. Bu nedenle protein tanıma sistemlerinin ve hassas spektroskopik tekniklerin birleştirildiği yeni tayin stratejilerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmuştur.
Yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (Surface Enhanced Raman Spectroscopy SERS) diğer metotlar ile karşılaştırıldığında en az numune hazırlama, ucuz reaktiflerin kullanıldığı, kolay, hızlı ve güvenilir bir biyoanaliz tekniğidir. Biyolojik ajanların belirlenmesi için, elektrokimyasal olarak hazırlanmış poröz altın ve gümüş metal yüzeyleri gibi SERS aktif yüzeyler ile birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte bu tekniklerle hazırlanan yüzeylerde sinyal tekrarlanabilirliğinin eksikliği düzenli SERS sonuçları eldesini zorlaştırmaktadır. Alternatif olarak gümüş veya altın kaplı
nanoyapıda partiküllerin kullanımı biyolojik tayinlerde tekrar edilebilir ve hassas SERS sinyali eldesi sağlayacaktır.
İmmunomanyetik ayırım (IMA) yöntemi, tayin edilmek istenen maddenin, yüzeyi antikor ile kaplı manyetik nanaopartiküllere bağlanmasına ve manyetik alan uygulamasıyla karışımdan ayrılmasına dayanmaktadır. İMA, hedef maddenin karışık bir ortam içerisinden seçici olarak ayrılmasını ve konsantre edilmesini sağlamaktadır (Cudjoe, 2000).
Bu çalışma da, SEB tayininin hızlı ve seçici bir şekilde tayini için manyetik nanopartiküller kullanılarak SERS tabanlı bir sandviç immunoassay sisteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Nanopartiküller
Terim olarak nanopartikül 1-100 nm arasındaki bir boyuta sahip olan partikülü tanımlamak için kullanır. Bir materyalin dolayısıyla bu materyali oluşturan her bir molekülün ve atomun özellikleri, partikül için tanımlanan boyut aralığında, nanopartikülerin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerinin değişmesi ile belirlenir. Nanopartiküller farklı kimyasal yapıya sahip materyallerden üretilebilirler. Bu materyallerden genel olarak kullanılanları metaller, metal oksitler, silikatlar, organik ve karbon materyaller ile biyomoleküllerdir. Morfolojik olarak ise nanopartiküller genel olarak küre, silindir, tüp şeklinde olabilirler. Nanopartiküller genellikle, spesifik uygulamalara uygun yüzey modifikasyonlarının kolaylıkla gerçekleştirilebilmesi için uygun şekilde dizayn edilirler. Nanopartiküller kimyasal yapılarındaki bu büyük çeşitlilik, şekil ve morfolojileri, bulundukları ortama uygunlukları ve ortamda dağılma şekilleri (şekil 2.1) nedeniyle bilim dünyasında önemli uygulama alanlarında aktif olarak kullanılmaktadır.
Farklı materyaller kullanılarak sentezlenen, özellikleri birbirinden farklı olan çeşitli nanopartiküller; kimyasal bileşiklerin sentezini, analizini ve karakterizasyonunu nano boyutta gerçekleştirdiği için nanokimyanın vazgeçilmez ilgi odağı olmuştur (Nagarajan ve ark., 2008).
Şekil 2.1. Nanopartiküllerin doğası ve sahip olabileceği özellikler
Nanopartikül yapıları son otuz yıl içerisinde daha fazla ilgiyi üzerine çekmiştir. Bununla birlikte blok yapıların çeşitliliği, raporlanmış tasarımlar ve yapılandırma teknikleri etkileyici olmuştur. Bu araştırmalar kolloitlerin sentezlenmesine, yeni maddeler ve yeni yüzey fonksiyonlarına dayanmaktadır. İki boyutlu kolloid dizilerin yapısı iyice belirlendikten sonra bu yapılardan yola çıkarak üç boyutlu sistemlere geçilmiştir. Son zamanlarda ise kolloit yapıları dışına çıkılarak özel nanopartiküller, nanomalzemeler ve nanoyapılar sentezlenmeye başlanmıştır. Nanopartiküller oldukça kararsızdır ve bu yüzden kümeleşme oluşturmalarını ve çözelti içinde çökmelerini engellemek için özel önlemler alınır. Cam örtü, ayıraç çözeltiler, çözücüler ve yüzey aktif maddeler kümeleşme olmasını engelleyen çözümlerdir. Bazen de çözüm olarak stabilizör ajanlar kullanılmıştır. Stabilizör ajanlar partiküllerin yüzeyleriyle ilişkide olup ve
Nanopartiküller
Dağılma durumu yönünden: Ayrı ayrı dağılmış, tersinmez olarak kümelenmiş, Tersinir olarak topaklanmış ve düzenli yapılar Şekil yönünden: Küre, küp, silindir, çubuk, oyuk küreler, oyuk tüpler, çekirdek-kabukKimyasal doğası:
Metaller, metal oksitler, yarı iletkenler, polimerler, karbon ve biyomoleküller. Dağılma ortamı: Gazlar (aerosol), sıvılar, katı matriks ve jel. Yüzey Modifikasyonu:
Üretildiği gibi kullanım, tiyol grupları üzerinden, polimerler üzerinden, DNA, enzim ve diğer
biyomoleküllerin bağlanması ile, yüzey kaplama ile gerçekleştirilen modifikasyonlar.
nanopartiküller süspanse haldeyken onların yük ve kararlılık özelliklerini koruyarak partiküllerin kümeleşmesini engellemektedir (Doron, 1995).
Kolloit nanopartiküllerin sentezlenmesi için bilinen birkaç yöntem vardır: a) Koloit metallerin indirgenme sentezi
b) Yarı geçirgen nanopartiküllerin sentezi
c) Elektro depozite veya direkt olarak yüzey üzerinde sentezlenmekte yada
Langmuir-Blodget‟in kendiliğinden yerleşme tabakalarıyla oluşmaktadır(Andrew, 2000).
2.1.1. Nanopartiküllerin Kullanım Alanları
Nanopartiküller aşağıda belirtilen birçok alanda uygulama şansı bulmuştur:
Nanomalzeme: Günümüzde özellikle bitkisel yağların biyoyakıtlara ve endüstriyel çözeltilere dönüştürülmesinde ihtiyaç duyulacak olan nano-katalizörlerin geliştirilmesi buna en önemli örnektir. Giyenin sağlık ve fiziki durumuna göre kendini havalandıran veya ısıtan akıllı kumaşlar da örnek olarak verilebilir.
Mikro-Akışkan Bilimi: Akışkanların nano boyuttaki özelliklerine bağlı olarak hastalıkların teşhisi, ilaç etkileşimlerinin belirlenmesi, vücuda alınan gıda maddeleri ve sıvıların izlenmesi gibi işlemler yapılacaktır(Chen, 2003).
Akıllı Taşıyıcı Sistemler: Nano boyutta kodlanmış paketlerin vücudun ilgili bölgesine ulaştırılmasına imkan sağlayacaktır(Liu ve ark., 2008).
Biyomikroelekromekanik-Biyonanoelektromekanik ve Biyoçipler: Son yıllarda
mikroelektromekanik (MEM) sistemlerde önemli aşamalar olmuştur. Örneğin; mikro düzeyde pompalar, motorlar… Ayrıca posta pulundan daha küçük biyoçipler nano düzeye indirilmeye çalışılmaktadır.
Nükleik Asit Biyomühendisliği: Nanomembran benzeri yapıların DNA molekülleri kullanılarak geliştirilmesi düşünülmektedir.
Biyoselektif yüzeyler: Çeşitli kimyasal ve biyolojik etkileşimlerin meydana geldiği yüzeyler üzerinde çeşitli organizmaların veya moleküllerin tutunabilmesi veya bağlanabilmesini sağlayan biyoselektif yüzeylerdeki gelişmeler biyomoleküllerin ayrıştırılması ve saflaştırılması ile ilgili gelişmeler bağlıdır.
Nano-Biyoproses: Mikropların hızlı bir şekilde tanımlanabilmesini sağlayacak kitler örnek olarak verilebilir.
Biyoanalitik Nanosensörler: Tarım ve gıda sistemlerinde çok düşük miktarda olan ve tayini kolay olmayan kimyasal kontaminasyon, patojen ve virüsler bulunmaktadır.
Bunların tayini için nanosensörler yapılmaktadır(Park ve ark., 2007).
2.1.2. Nanopartiküllerin avantaj ve dezavantajları
Nanopartikül yapımı Merkle‟ nin benzetimine göre, ellerimizde boks eldivenleriyle lego yapmaya benzemektedir. Zamanla nanopartikül üretimin yaygınlaşması bize bu eldivenleri çıkarma olanağı sağlayacaktır ve istediğimiz şekilde yapma olanağı sağlayacaktır. Nanopartiküllerin bu şekilde kolayca, ucuz bir biçimde ve hemen her şekilde düzenlenmesi avantajlarındandır. Bu sayede yeni nesil ürünlerin doğaya daha az zarar vererek üretilebilmesi ve bunların aynı zamanda daha dayanıklı, daha hafif ve
daha hassas özelliklerle donatılmış olması mümkün olacaktır(Link ve ark., 1999).
Nanopartiküllerin kararsız olması yığın halinde bulunma olasılıklarını artırmaktadır. Kendiliğinden manyetik olan nanopartiküller birbirlerini çekerek topaklanmaya sebep olurlar. Buda nanopartiküllerin yüzey alanını azaltmaktadır. Uygulanabilir yüzey alanının azalması da yapılan çalışmalarda duyarlılığı azaltmaktadır.
2.2. Manyetik Partiküller 2.2.1. Ferrosıvılar
Bir taşıyıcı sıvı içinde dağıtılmış süperparamanyetik partiküller ferrosıvılar (ferrofluid) olarak adlandırılmaktadır. Kararlı bir ferrosıvı süperparamanyetik partiküller, bir taşıyıcı sıvı ve bir yüzey aktif madde içermektedir. Ferrosıvılar doğal olarak bulunmazlar ve ilk olarak 1960 yılında tanımlanmışlardır. Ferrosıvıların kararlı dispersiyonu manyetik çekim kuvvetleri, yerçekimi kuvveti ve London dispersiyon yada van der Walls kuvvetleri olmak üzere üç temel çekim kuvvetleri dengelenerek sağlanmaktadır. İki manyetik dipol arasındaki manyetik çekim enerjisi (UA mag), m1 ve m2 dipol momentlerininin ve partiküller arası uzaklığın bir fonksiyonudur (Rosenweig, 1985). Partiküller arası uzaklık azalırken etkileşim enerjisi artar ve bir yüzey aktif maddeyle korunmadığından topaklanma oluşur. Ayrıca bir manyetik alanda partiküllerin manyetik dipolleri birbirini çeker. Derişik bir manyetik sıvı dispersiyonuna bir manyetik alan uygulandığında partiküller sıvı ile birlikte uygulanan alan yönünde
hareket ederler. Kolloidal kararlılığı korumak ve partiküller arası etkileşim enerjisini yenmek için partiküllerin yeterince küçük ve süperparamanyetik olması gerekmektedir. En önemlisi partiküller süperparamanyetik olduğunda sistemde partiküller arası manyetik etkileşim azalmaktadır. Çünkü termal enerji, partiküllerin manyetik momentlerinin serbest dönmelerine sebep olmaktadır. Brownian hareketi partiküllerin dağılmasını sağlarken yerçekim kuvveti partikülleri aşağıya çeker. Rosensweig tipik bir ferrofluid‟deki nanopartiküllerin kararlılığı üzerine yerçekimi etkisinin çok az olduğunu tayin etmiştir. Partiküllerin büyük yüzey alanının hacme oranının artmasıyla nanopartiküllerin yüzey enerjisi (≥100dyn/cm) artmaktadır. Bu büyük yüzey enerjisini düşüren çekim kuvvetleri topaklanmayı kolaylaştırmaktadır. Bir partikül diğerinden uzaklaşırken bu çekme kuvveti azalır. Van der walls çekme kuvvetleri önemli bir faktördür ve kararlı kolloidal dispersiyonlar hazırlamak için bu çekme kuvvetlerinin engellenmesi gerekir. Elektrostatik veya sterik itme kuvvetleri partikül topaklanmasını önlemek ve çekme kuvvetlerini dengelemek için kullanılan iki mekanizmadır. Partikül yüzeyinin elektrostatik stabilizasyonu bir yük taşımasıyla oluşturulmaktadır ve partiküllerin birbirine yakınlığı belli bir uzaklığın altına düştüğünde partiküller birbirini geri iter. Elektrostatik stabilizasyon pH duyarlı bir metot ve özellikle biyomedikal uygulamalarda kullanımı sınırlıdır. Sterik itme metodu genellikle uzun zincirli yüzey
aktif maddelerini kullanarak oluşturulmaktadır(Kim, 2001).
2.2.2. Manyetik Nanopartiküller
Bir sıvı içerisinde süperparamanyetik dispersiyonlar oluşturan manyetik nanopartiküller 1‟den 100 nm boyutlarına kadar değişen boyutlarda metal ve metal oksitlerden oluşmaktadır. Bu metal ve metal oksitler Ni, Co, Fe, Fe3O4 ve Fe2O3 „den oluşmaktadır.
Manyetik partiküllerde diyamanyetik bir tabaka nanopartikülün manyetik çekirdeğinin
manyetik özelliklerini azaltabilir (Ban ve ark., 2005). Manyetik partiküllerin
süperparamanyetik özelliğe sahip olması, partiküllerin manyetik momentlerinin serbest hareket etmesine neden olur ve bu sayede partiküller arasındaki manyetik etkileşim azalmaktadır.
Manyetik partikülleri aynı şekil ve boyutta sentezlemenin çoğu uygulamalarda avantajları vardır. Çünkü farklı şekil ve boyuta sahip nanopartiküller kullanıldığında farklı manyetik özellikler gözlenmiştir (Gupta, 2005). Ancak aynı fiziksel özelliklere
sahip nanopartikülleri üretmenin zorlukları vardır ve yüksek sıcaklıkta demir tuzlarının
borhidrür ile indirgenmesini veya Fe(CO)5‟ in ayrışmasını içeren birçok metot vardır
(Chen,1999). Manyetik partiküllerin kimyasal olarak sentezi basittir ve
nanopartiküllerin şekil, boyut ve bileşiminin kontrolü kullanılan Fe2+
ve Fe3+ tuzlarının oranı, ph ve iyonik güçle sağlanır.
Çizelge 2.1. Geçiş metalleri ve metal oksitlerin manyetik özellikleri Maddeler Doygunluk Mıknatıslığı Curie (Ms) (emu/cm3) 298 K Sıcaklığı (K) Ni 485 631 Co (Kübik) 1400-1422 1404 Fe (Kübik) 1700-1714 1043 Fe2O3 394 820-986 Fe3O4 480-500 858 2.3. Antikor
İmmunoglobulin olarakta bilinen antikor, bakteri ve virüs gibi yabancı nesneleri nötralize etmek ve tanımlamak için bağışıklık sistemi tarafından kullanılan geniş Y-şeklindeki proteindir. Antikor yabancı olan hedef maddenin antijen denilen parçasını tanımlar. Bir antikorun Y ucu paratope denilen kilite benzer yapı ve anahtara benzeyen epitop yapısını içerir ve bu iki yapının birbirine bağlanmasına izin verir. Bu bağlama mekanizmasını kulanarak bir antikor mikrobu veya bağışıklık sisteminin diğer parçaları etkilenmiş olan virüslü hücreyi etkileyebilir yada doğrudan hedefi yok edebilir. Antikorların üretimi insan bağışıklık sisteminin ana işlevidir.
Antikorlar kan hücresi denilen beyaz kan hücrelerinin bir türüyle üretilir. Antikorlar iki fiziksel şekilde ortaya çıkabilirler. İlki hücreden salgılanan çözünür formdur. İkincisi ise bir B hücresinin yüzeyine bağlı olan membrana bağlı formudur. Bu şekil aynı zamanda B hücresi alıcısı (BCR) olarakta adlandırılır.
Şekil 2.2. Antijen-antikor ilişkisi (Pier ve ark., 2004)
Antikorlar immunoglobulin ailesine ait glikoproteinlerdir. Antikorlar her biri iki büyük ağır zincir ve iki küçük hafif zincir içeren basit temel birimlerden oluşmuştur. Antikorların ağır zincirlerinin farklı türleri vardır ve sahip oldukları ağır zincirlere bağlı olarak farklı izotipler şeklinde gruplandırılan antikorlarında farklı türleri vardır. Farklı rolleri üstlenen ve karşılaştıkları yabancı cismin her birine en uygun bağışıklık yanıtını veren 5 farklı antikor izotipinin memelilerde olduğu bilinmektedir.
Antikorların genel yapıları benzer olmasına rağmen, proteinin ucundaki küçük bir bölge aşırı değişkendir. Bu bölgede farklı uç yapıları ve antijen bağlanma yerleri bulunan milyonlarca antikor vardır. Bu bölge hiperdeğişken olarak bilinir. Bu varyantların her biri antijen olarak bilinen farklı bir hedefe bağlanabilir. Antikorların bu muazzam çeşitliliği çok çeşitli antijenleri tanımlamak için bağışıklık sistemine izin verir. Antikorların bu geniş ve çeşitli populasyonu çeşitliliğin oluşmasını sağlayan antikor geninin bu bölgede rastgele mutasyonlarıyla takip edilen farklı antijen bağlama sitelerini kodlayan bir dizi gen segmentlerinin rastgele kombinasyonlarıyla oluşturulur. Antikor genleri ayrıca spesifik antijen bölgesini koruyan bir antikorun farklı bir izotipini oluşturarak ağır zincirin temel yapısını değiştiren sınıf geçiş denilen bir süreci organize edebilir. Bu da tek bir antikorun bağışıklık sisteminin farklı birçok parçasında kullanılmasına izin verir.
2.4. Staphylococcus Enterotoxın B (SEB)
Stafilokokal gıda zehirlenmeleri, enterotoksijenik Staphylococcus türlerinin gıdalarda üremeleri sırasında sentezledikleri, sindirim sistemi üzerine etkili enterotoksinlerin meydana getirdiği gıda kaynaklı intoksikasyonlardır. Yapılan epidemiolojik çalışmalar gıda zehirlenmelerinde enterotoksijenik stafilokokların önemli derecede rol oynadığını göstermektedir. Süt ve süt ürünlerinin de sorumlu gıdalar arasında ilk sıralarda yer aldığını ortaya koymaktadır (Moldenhauer ve Yvon, 2005). Enterotoksin üreten stafilokok türleri içerisinde gıdalar için en önemli tür Staphylococcus aureus‟tur.
Staphylococcus aureus, sekiz farklı ekzotoksin üretmektedir.
Şekil 2.3. Üzüm şeklindeki Staphylococcal aureus kümecikleri (Moldenhauer ve Yvon,
2005)
Staphylococcal Enterotoxin B (SEB) Staphylococcus aureus bakterisi tarafından üretilen ekzotoksinlerden birisidir (Efrima ve ark.,2009). 0,8 ile 1,2 μm boyutları arasında hareketsiz, spor oluşturmayan ne oksijenli ne de oksijensiz solunum yapan bir bakteri türüdür. SEB tersiyer yapısı nedeniyle (Şekil 2.4), sıcaklığa, proteolitik enzimler ile (tripsin, kimotripsin, papain) parçalanmaya ve pH değişimine (pH 4-10) dayanıklıdır. Bu bakteriler normalde hem insan hem hayvan mukus membranları içinde, deri üzerindedirler ama küflenmiş yiyeceklerde ve çevrede de bulunabilirler.
Şekil 2.4. SEB‟in üç boyutlu yapısı (Efrima ve ark.,2009)
2.4.1. SEB semptomları
Çoğunlukla sindirim sistemi üzerinde etkili olan ve pirojenik etki gösteren bu toksinin, 0.0004 µg/kg gibi çok az miktarı bile insanlarda etkisini göstermektedir. SEB‟in gıda zehirlenmesine bağlı olarak ağız yoluyla alınması durumunda, şiddetli kusma, ishal, 41ºC‟ye ulaşan ateş ve bazı durumlarda öldürücü şoklara neden olmaktadır. İntoksikasyon gıdanın alınmasından 6 saat sonra kendini göstermeye başlamakta 48 saat içerisinde ise tüm etkilerini göstermektedir. Doğal yapısını koruyabilmesi, hastalık oluşturabilme kapasitesinin, intoksikasyon etkisinin yüksek olması ve kolay bulaşılabilir olması SEB‟in biyolojik silah olarak seçilmesini neden olmuştur ve SEB, Hastalık Kontrolü ve Koruma Merkezleri (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) tarafından B grubu toksinler listesine eklenmiştir (Skoog,1998). Bu özellikleri ile SEB aerosol halinde biyolojik silah olarak kullanılabileceği gibi, gıda veya su kaynaklarına yönelik sabotaj girişimlerinde de kullanılabilmektedir.
2.4.2. Biyolojik Silah Olarak SEB
1960‟larda USA biyolojik bir savaş programına sahipti ve SEB savaşta askerleri güçsüz duruma getirmek için kullanılacak olan bir biyolojik silahtı. Bu etkileyici bir silahtı çünkü laboratuarda sentezlenen kimyasallarla karşılaştırıldığında askerler üzerinde
istenilen zayıflığı sağlamak için düşük miktarlar yeterliydi(Campion ve ark.,1998).
Ülkenin güvenlik departmanının kurulmasıyla 11 eylül 2001 saldırısından sonra ülke güvenlik departmanındaki yönetimle ilgili sorumlular biyoteröristlerin saldırılarını
gerçekleştirmek için hiç silah kullanmadıklarının farkına vardılar. Alışılmadık insan ve hayvan hastalıklarının nadir olan semptomlarına dikkat edilmesi ve mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde yerel güvenlik otoritelerine onları bildirmesi önemliydi. Biyoterörizmin geç farkına varılması ve rapor sonuçlarının gecikmesi binlerce insanın ve hayvanın yaşamlarını tehlikeye atabilirdi.
Çoğu biyolojik silah ve toksinler insanlarda hastalığa neden olabilir fakat hepsi büyük oranda tıbbi altyapıyı gerektirmez ve halk sağlığını etkilemez. Halk sağlığı altyapısı biyolojik ve kimyasal saldırılardan kaynaklanan krizleri hızlı bir şekilde çözmek için donanımlı olmalıdır. Toksinler, yaşayan organizmalar tarafından sentezlenen kimyasal bileşikler molekül ağırlığı, kaynağı, mekanizmaları ve vücuttaki tercih edilen hedeflerine göre sınıflandırılabilir. Birçok faktör kütle imha silahı olarak bunların kullanılmalarını sınırlandırır. Bu faktörler üretim, dağıtım ve çevresel kararlılıktır (Robinson ve ark., 2000). SEB‟ in teröristler tarafından kullanılması ile yiyeceklerin ve suyun kasıtlı olarak kirletilmesi de mümkün olan şeylerden biridir.
2.5. Raman Spektroskopisi
Teknik, moleküllerin şiddetli bir monokromatik ışın demeti ile etkileşmesi sırasında oluşan saçılmanın dedektör tarafından takibi prensibi üzerine kuruludur. Işık saçılması sırasında saçılan ışığın büyük bir kısmının enerjisi madde ile etkileşen ışığın enerjisine eşit olur ve bu tür elastik saçılma olayına Rayleigh saçılması denir. Elastik saçılma olayının yanı sıra saçılan ışığın çok az bir kısmı ise molekül ile etkileşmeye giren ışığın enerjisinden daha farklı enerjiler ile saçılır. Bu tür elastik olmayan saçılma olayı ise Raman saçılması adını alır. Raman saçılması sırasında saçılan ışığın enerjisinde, molekül ile etkileşen ışığınkine göre oluşan fazlalık veya azlık, ışıkla etkileşen molekülün titreşim enerji düzeyleri arasındaki enerji farkları kadardır. Bu nedenle Raman saçılmasının spektroskopik incelenmesi ile moleküllerin titreşim enerji düzeyleri hakkında bilgi edinilebilir. Bu tür bir spektroskopik yöntem Raman spektroskopisi adını alır(Safarik ve ark., 2005).
Şekil 2.5‟de Raman saçılması olayının ortaya çıkışının molekülün titreşim enerji düzeyleri ile ilişkisi görülmektedir.
Şekil 2.5. Stokes ve anti-Stokes türü Raman saçılması olaylarının molekül enerji
diyagramı ile açıklanması(Smith ve ark., 2005)
Enerjisi ho olan bir foton, molekül ile etkileştiğinde saçılmadan önce çok az sayıda
foton, enerjilerinin bir kısmını moleküllere aktarır veya moleküllerde çok az sayıda fotona bir miktar enerji aktarılır. Bu enerji aktarımı olayı sonucu moleküller fotonla etkileştikten sonra farklı titreşim enerji düzeylerinde bulunurlar. Enerji aktarımı nedeni ile molekül, fotonla etkileşmeden önce temel titreşim enerji düzeyinde iken, etkileşmeden sonra uyarılmış bir titreşim düzeyine geçiyorsa fotonun enerjisinde azalma ve molekülün titreşim enerjisinde ise artma olur. Bu olay sonunda saçılan ışımalar Stokes hatları olarak adlandırılır. Fotonun enerjisinin saçılma sonrası arttığı durumlarda ise, molekül fotonla etkileşmeden önce uyarılmış bir titreşim düzeyinde iken, etkileşme sonrası temel titreşim düzeyine döner ve böylece molekülden fotona, molekülün uyarılmış enerji düzeyi ile temel titreşim düzeyi arasındaki fark kadar bir enerji aktarılmış olur. Bu durumda gözlenen Raman kaymalarına anti-Stokes hatları adı verilir (Safarik ve ark., 2005).
Şekil 2.6. Stokes ve anti-Stokes hatları (Skoog ve ark., 1998)
Boltzman dağılım yasasına göre, fotonla etkileşmeden önce uyarılmış enerji titreşim düzeylerinde bulunan moleküllerin sayısı, temel titreşim enerji düzeylerinde bulunan moleküllerin sayısında çok daha az olduğundan, anti-Stokes türü Raman saçılmasının meydana gelme olasılığı Stokes türününkine göre çok daha azdır.
O C O O C O
Şekil 2.7. CO2 molekülüne ait polarlanabilirlik (Safarik ve ark., 2005).
Bir molekülün Raman türü saçılma etkileşmesine girebilmesi için molekülün titreşimi sırasında etkileştiği fotonun frekansına eşit frekanslı olarak polarlanabilmesi yani geçici bir dipol momentinin olması gerekmektedir. Şekil 2.7‟ de doğrusal CO2 molekülünün
simetrik ve asimetrik gerilme ve eğilme titreşimleri sırasında molekülün dipol momentinde ve polarlanabilmesinde oluşan değişimler görülmektedir(Safarik ve ark., 2005).
Raman spektrumları bir molekül için İnfrared spektrumları ile birlikte değerlendirildiğinde o moleküle ait hemen hemen bütün titreşimlerin görülmesini
mümkün kılıp molekülün kimyasal yapısının veya nitel analizinin daha güvenilir gerçekleşmesini sağlar. Fakat biyolojik çalışmalarda IR yöntemi su varlığında kuvvetli absorplama özelliği gösterdiği için sorun teşkil etmektedir. Biyolojik çalışmalar için IR spektroskopinin geri planda kalması, Raman spektroskopiyi oldukça ön plana taşımıştır. IR‟nin aksine Raman spektroskopinin en büyük avantajlarından birisi olan sulu ortamda bulunan numune analizinin gerçekleştirilmesi daha kolay olmaktadır. Böyle bir teknik ile biyolojik olarak çeşitlilik gösteren canlıların parmak izi bölgeleri çalışılarak tanımlama gerçekleştirilebilmektedir. Bu tarz bir durumda çalışma sonrası elde edilen
spektrumun hücresel bileşen tabanlı olduğu söylenebilir(Lombardi ve ark., 1986).
Diğer yandan; normal Raman spektroskopi (NRS) sulu ortamda çalışmaya olanak sağlamasına rağmen, düşük şiddet ve hassasiyetle çalışıyor olmasından dolayı, zamanla yerini Rezonans Raman Spektroskopiye (RRS) bırakmıştır. RRS, floresans girişiminin daha az olduğu spektrumların eldesinde, konjuge aromatik yapılara karşı verdiği cevap ve elde edilen sinyallerin daha net olması bakımından NR ye göre oldukça üstün
bulunmuştur (Freire, 2000). Rezonans Raman saçılım olayı, bir analitin elektronik
absorpsiyon pikine oldukça yaklaşan dalga boyları ile uyarılması sonucu Raman şiddetlerinin büyük ölçüde güçlendiği bir durumdur. Bu koşul altında çoğu Raman piklerinin şiddetleri 102
ile 106 kat kadar kuvvetlenir. Bunun sonucunda rezonans
Raman spektrumları 10-8
M‟ a kadar düşürülebilen analit derişimlerinde kullanılabilir. Bu duyarlılık düzeyi, çoğunlukla 0,1 M‟dan daha yukarı derişimlerle sınırlı normal Raman çalışmaları ile çelişkilidir. Rezonans kuvvetlendirmesi, kromofor ile ilgili Raman bantları ile kısıtlanmış olduğundan rezonans Raman spektrumları genellikle sadece birkaç çizgiden oluşur. Bunun da ötesi, rezonans Raman spektrumları oldukça seçimli olarak elde edilebilirler. Çünkü uyarma, spesifik absorpsiyon bantlarına hedeflenebilir(Alexander ve ark., 2003).
Bir diğer Raman yöntemi olan yüzeyde kuvvetlendirilmiş Raman saçılması (SERS) ise geliştirilip NR ve RRS‟nin önüne taşınmıştır. Özellikle mikroorganizma çalışmalarında, tanımlamaya yönelik sonuçların NR ve RRS ile elde edilebilmesine karşılık, bu sonuçlarla birlikte üç problem de hala süregelmektedir. Bu problemler;
hassasiyet,
miktar ve spektral data üzerinde seçicilik ile sıkışıklık problemleri,
bunların dışında bir diğer önemli husus ise cihazın fiyatı(Sockalingum ve ark., 1999,
Arcangeli ve ark., 2000).
SERS bu problemleri çözmekte oldukça başarılı bir teknik olup bakteri tanımlanmasında ve diğer çalışmalarda uygun genel bir yöntem haline gelmiştir. Ayrıca SERS-aktif substratların floresansı sönümlemesi ölçümlerde S/N oranını da arttırmaktadır. Bu şekilde elde edilen kuvvetlendirme ile spektrumlarda oluşan sıkışıklık giderilmiş olup daha hassas ölçümlerin SERS substratları ile gerçekleştirilmesi mümkün kılınmıştır(Freire, 2000; Schuster ve ark., 2000).
2.6. Yüzeyi Güçlendirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS)
Moleküllerdeki titreşimler üzerine çalışan temel teknikler, infrared absorpsiyonu ya da Raman saçılmasının prensibi üzerine kuruludur. Bu teknikler, kimyasal yapılar ve fiziksel formlar üzerinden; karakteristik spektral modellerden (fingerprinting) maddenin tanımı ve kantitatif veya yarı kantitatif bir biçimde örneğin içindeki madde miktarının tayini için bilgi sağlamada kullanılır. Örneklerin, bütün fiziksel hallerde incelenmesi mümkündür. Örneğin, katı, sıvı, buhar, sıcak veya soğuk haller, viskoz yapılar, mikroskopik partiküller veya yüzey katmanları olarak bütün örnekler bu teknik ile incelenebilir(Piot, 2001).
Raman spektroskopisi; sulu çözeltilerde, cam küvetler içerisinde, hiçbir hazırlık yapılmaksızın örnek analizlerinde hızlı uygulama imkanları ile kendi imkanlarını geliştirip diğer teknikler arasında yerini almıştır(Piot, 2001).
Temel olarak SERS, Raman sinyallerinin kuvvetlendirilmiş biçimidir. Söz konusu kuvvetlendirme ise SERS substratları ile sağlanmaktadır. SERS substratları için kullanılan yüzeyler, altın, gümüş gibi iletken metallerin nanoboyuttaki parçacıklarından oluşmaktadır. Geniş ölçekli bir kuvvetlendirme yüzeylerde oluşturulan nano ölçekli (10-100 nm) pürüzlü yapılar ile sağlanmaktadır. Bu yüzeyler elektrot üzerinde indirgenme-yükseltgenme döngüsünün birkaç kere tekrarlanması ile, cam yüzeyler üzerine partikülleri film olarak kaplamak ya da ada şeklinde biriktirmekle, agrege olmuş koloidler, litografik teknikler v.b. kullanılarak hazırlanmaktadır (Matsi ve ark., 2000). SERS‟deki bu sinyal artışı metaller ile ışığın elektromanyetik etkileşiminden
gelmektedir. Metaller bu etkileşim sırasında plazmon rezonans olarak bilinen, lazerin düştüğü alanda, ikincil bir elektromanyetik alan oluştururlar ve ışık kaynağı ile metaller tarafından oluşturulan bu alan rezonansa girerek metal yüzeyinde- örneğin bulunduğu
ortamda- bir “elektromanyetik kuvvetlendirme” gerçekleştirmiş olur. Bu
kuvvetlendirmeden yararlanabilmek için moleküller metal yüzeyine adsorbe olmalı ya
da metal yüzeyine çok yakın (10-15 nm) bulunmalıdır(Schuster ve ark., 2000).
Elektromanyetik kuvvetlendirme dışında, oluşan kuvvetlendirmeyi açıklamak için bir diğer teori ise “kimyasal kuvvetlendirme” olarak bilinmektedir. Bu kuvvetlendirme sıklıkla eşleşmemiş elektron çiftleri içeren moleküller üzerinden açıklanmıştır. Analitin yüzeye adsorbe olarak yüzeyle etkileşmesi sonucu oluşmaktadır. Bu durumda kimyasal kuvvetlendirme yüzeye kemisorblanan tür ile metal yüzey arasında kurulan yük transferi ile oluşmaktadır. Bu kuvvetlendirmenin bazı özel durumlarda ve muhtemelen
elektromanyetik kuvvetlendirmenin gerçekleştiği koşullarda elektromanyetik
kuvvetlendirme ile gerçekleştiği sanılmaktadır(Matsi ve ark., 2000).
Özetle SERS‟in adını aldığı harfleri inceleyerek yönteme bakarsak; kelime kelime SERS:
Surface (S): SERS bir yüzey spektroskopi tekniğidir; moleküller yüzey üzerinde ya da yüzeye yakın olmalıdırlar. Bu SERS uygulamalarında temel noktadır.
Enhanced (E): Sinyal kuvvetlendirmesi metal substratlarda plazmon rezonans ile sağlanır.
Raman (R): Moleküllerin (SERS prob veya analit) Raman sinyallerini ölçen bir tekniktir. Raman spektroskopi elastik olmayan ışık saçılmasına dayanır.
Son olarak SERS kodlamasındaki son “S”, “Scattering” ya da “Spectroscopy” kelimelerine dayanır.
2.6.1. Biyolojik Uygulamaları
Raman spektroskopi biyolojik moleküller ile çalışma sırasında bir takım avantaj ve dezavantajlari beraberinde getirir. Avantajları arasından ön plana çıkan, in situ çalışmalarda sulu sistemlerde kullanılabilme kabiliyetidir. Dezavantajlarından biri ise oldukça kuvvetli lazer tarafindan uyarılan örnek dokularının zarar görmesidir. Fakat; Raman spektroskopi tekniğine uygun çalışabilecek biyolojik örnekler için oldukça geniş
ölçekte sistemler geliştirilmiş durumdadır(Moskovits, 1985). Polar gruplar; karboniller, aminler ve amidlerin Raman spektrumları oldukça zayıftır. Bu Raman spektroskopide dezavantaj olarak görünen bir durumdur. Buna rağmen -S-S-, -SH, -CN, -C=C- ve aromatik halkalar spesifik karakterizasyonlar için ayırıcı kuvvetli bandlar gösterirler. Karbonat ve fosfat gibi diğer gruplar da ayrım sağlayabilecek Raman bandları verirler. Raman ile fiziksel formlardaki değişiklikleri tespit etmek mümkündür.
Literatürde geçen çoğu çalışma kimyasal bağlanma, genomikler, proteomikler, protein etkileşimleri, katı faz sentez çalışmaları ile DNA, protein analizi ve hücre çalışmalarına dayanmaktadır. Ayrıca gıda ve biyomedikal alanlarında yayınlanmış birçok çalışma da mevcuttur. SERS‟in yaygın bir teknik olarak kullanıldığı alanlara birkaç örnek vermek gerekirse: Amino asit kristallerindeki geçişleri (Zheng ve ark., 2002), tek hücreli
bakteriler (Manfait ve ark., 2000), bakteri sporları (Gole ve ark., 2008),
mikroorganizmaların karakterizasyonu (Wang ve ark., 2009), fungi (Lyon ve ark.,
1998), hububat karışımları(Elaissari, 2008), lipozom kompleksleri (Feldheim ve ark.,
2002), küf(Bruchez ve ark., 1998), iyi huylu ve kötü huylu tiroid dokularında meydana
gelen oluşumlar(Hayatt, 1989) üzerine çalışmalar oldukça yaygındır. Raman saçılması
üzerine SERS; tıp alanında ve in situ çalışmalarda türlerin tayini, kromofor gruba sahip birçok biyolojik molekül ile çalışılma uyumluluğu açısından yararlı bir teknik olmuştur.
2.6.2. SERS Substratı Olarak Kullanılan Nanopartiküller
Yüzeyde Kuvvetlendirilmiş Raman Saçılma (SERS) etkisinin keşfi, fizik ve optik alanlarında metal nanopartiküllerle ilgili yeni bir tartışmanın da başlangıcı olmuştur. Özellikle elektromanyetik kuvvetlendirme ve plazmon rezonans süreçleri arasındaki bağlantının keşfi, küre nanopartiküllerden farklı şekillere sahip partiküllerle çalışma dürtüsünü hem deneysel hem de teorik olarak arttırmıştır. 1970‟lerin ortalarında başlayıp 1980‟lerin ortalarına kadar birçok kişinin öncelikli olarak SERS etkisi ile ilgilenmeleri, SERS etkisinden çok metal nanopartiküllerin temel optik özelliklerinin
önemli ölçüde kavranmasını sağlamıştır(Rich ve ark., 2000).
Metal nanopartiküllerde bazı yeni sentetik ve teorik ilerlemeler, yarı iletken partikül sistemlerinde boyut belirlemeye yönelik çalışmalara ilham kaynağı olmuştur. Ayrıca, fotokatalizler ve elektronik cihazlar ile gerçekleştirilen uygulamaların son on yıl
içerisindeki artışı da metal nanopartiküllerin kullanımı için itici bir güç olmuştur(Rich ve ark., 2000).
Biyolojik alanda ise metal nanopartiküllerdeki bu ilerleyişi; 1960‟lı yıllarda keşfedilen, yüksek duyarlılığa sahip olan ve bu nedenle biyolojik ölçümlerde bir devrim gözüyle bakılan radyoimunoanalizin (RIO) popülaritesini yitirdiği 1990‟lı yıllarda doruk noktasına ulaşmıştır. Fakat; biyoölçümler için ilk nanopartikül uygulamaları, 1970‟lerde 5-50 nm çaplı kolloidal altın kullanımı ve elektron mikroskop için immunositokimyasal
prob kullanımı ile başlamıştır (Klar, 1998). 1990‟lı yıllara doğru RIA‟nın
zayıflamasındaki temel neden ise potansiyel radyoaktif tehlike varlığı taşıyor olması ve radyoaktif atıkların özel olarak yok edilmesi gibi dezavantajlardan kaynaklanmaktadır. Bunun yanında floresans aktifleştirciler ve metal atomları gibi radyoaktif olmayan aktifleştiricilerin keşfi, bu metodu etkisiz kılmış ve biyolojik ölçümlerde keşfedilen bu aktifleştiriciler ile metaller kullanılmaya başlanmıştır. Bu süreçten itibaren
araştırmacılar nanopartiküllere yönelmeye başlamışlardır (Canziani ve ark., 1999;
Mullett ve ark., 2000).
Nanopartiküller 100 nm‟den küçük ve boyutlarına özgül özellikler (elektron tutucu etki, geçici mıknatıslık özelliği, yüzey plazmon rezonansı gibi) taşımaları nedeniyle biyolojik sistemlere kolayca entegre olabilirler. Günümüzde nanopartiküller biyoölçümlerde
farklı amaçlarla kullanılmaktadır(Kubitschko ve ark., 1997).
Nobel metallerde, iletkenlik bandındaki elektronların toplam osilasyon hareketi yüzeyde büyük bir elektrik alanı oluşturur ve bu alan altın veya gümüş nanopartikül elektromanyetik radyasyonla rezonansa girdiğinde nanopartikülün ışığı absorplama ve saçılma özelliği büyük ölçüde artmaktadır. Bu olay nanopartikülün absorpsiyon özelliğini en kuvvetli absorplama olan moleküllerden onlarca kat daha fazla olmasını sağlar. Aynı şekilde nanopartikülün ışık saçılma özelliği en yaygın saçılma veren
organik boyalardan çok daha fazla olmaktadır (Hao, 2004). Böylece bu partiküller
güçlendirilmiş absorpsiyon ve saçılma özelliklerinden dolayı optik tayin için sensor ve görüntüleme konstrat ajanı olarak kullanılabilirler.
Metal nanopartiküller plasmon resonans frekanslarında kuvvetli olarak ışığın absorbsiyon ve saçılması ile parlak renkler verirler. Saçılmanın absorbsiyona oranı partikülün boyutu ile değişir. Büyük nanopartiküller ışığı daha etkin saçarken küçük nanopartiküllerin rengi absorpsiyondan kaynaklanır. Renkli organik boyalarda görülen
parlak renk, absorbsiyondan dolayı saçılma ihmal edilebilecek düzeydedir ve 30 nm çapın üzerine sahip metal nanopartiküllerde saçılma önem kazanmaktadır. Ayrıca saçılma kuantum verimi partikül çapının artmasıyla önemli ölçüde artar. Örneğin 20 nm çaplı partikülde çok az miktarda iken 150 nm çaptaki partikülde oldukça yüksektir. Yüzey plasmon özelliği hem metal (porosite, buruşukluk) hemde ortamın dielektriğine (kırılma indisi) bağlıdır. Lokalize olmuş kuvvetli elektromanyetik enerji metal-dielektrik arayüzey boyunca küçük yapılar içerisinde ışığın yönlendirilmesinde
kullanılabilir (Gluodenis ve ark., 1999). Bir sıvının dielektrik ortamı olarak
kullanılmasıyla ara yüzeye yakın dielektriğin kırılma indisindeki değişim ile kimyasal bağlanma ve bu bağlanmanın kinetiği hakkında bilgi edinilebilir. Çözeltide analit bulunduğu zaman metal-dielektrik yüzeyine bağlanır ve ara yüzeyde kırılma indisin değişmesiyle yüzey plasmon özelliklerinde ölçülebilir bir değişime neden olur. Bu metal yalnızca bağlanma olaylarının tayin etmek için değil ayrıca bağlanma kinetiklerini takip etmek için de kullanılır(Hao ve ark., 2004; Hunyadi ve ark., 2005). Partikül plasmonun resonans frekansı çevrenin (kırılma indisi) polarlanabilmesine hassastır. Partikül plasmonun şimdiye kadar olan sensör uygulamalarında büyük partikül yapıları kullanılmıştır (Link ve ark., 1999; Nie ve ark., 1997). Bu durumlarda partikül plasmon sensörler düzlemsel metal yüzeylerdeki yüzey plasmon resonans teknikleriyle karşılaştırıldığında duyarlılıkları ve kullanım kolaylıkları iyi değildir (Niemeyer, 2001). Bu tip nanopartiküllerin sensor olarak kullanımları için yoğun çaba
sarfedilmesi gerekmektedir(Moskovits, 1985).
Plasmon mod ile ilgili çalışmalar yirminci yüzyılın başına kadar uzanmasına rağmen, günümüzde entegre elektronik devreler, optik uygulamalar, sensör ve görüntüleme yöntemleri gibi birçok alanda yarıiletken malzemelere olan ihtiyacın artması nanoboyuttaki bu yapıların karakterizasyonu ve sentezi oldukça popüler hale gelmiştir. Özellikle farklı şekillerdeki altın ve gümüş nanopartiküller içerisinde nanoçubukların yüzey plasmon alanı güçlendirilmeleri en kuvvetlidir(Kim ve ark., 2001, Qiu ve ark., 2010). Altın nanopartikülünün şeklinin altın çubuk şekline değiştirilmesiyle absorpsiyon ve saçılma dalga boyu görünür bölgeden NIR bölgesine değişir ayrıca absorpsiyon ve saçılma kesiti verimliliği büyük ölçüde artar. NIR bölgesinde istenilen absorpsiyon dalga boyu altın nano çubuğun çeşitli boy/çap oranlarında kolaylıkla sentezlenebilir (Zhu ve ark.,2011; Babak ve ark., 2003). Partikül çevresindeki kuvvetli elektromanyetik
alan partikül plasmon frekansındaki uyarıcı ışığın alanından çok daha fazla büyük olabilir ve yüzeyde güçlendirilmiş Raman saçılması (SERS) gibi doğrusal olmayan optik etkilerin artırılması için kullanılır(Oyelere ve ark., 2007; Lin-Vien ve ark., 1997). Biyoölçümler için kullanılan yapılardan biride altın nanopartiküller dışında çekirdek-kabuk yapıya sahip nanopartiküllerdir. Özellikle süperparamanyetik yapılar kullanılan biyouyumlu materyallerin kaplanması ile biyoloji, biyoteknoloji ve diğer biyomedikal disiplinler arasında oldukça işlevsel özellik kazanıp ilgi görmektedir (Culka ve ark., 2010; De Gelder ve ark., 2007). Bu çalışmalara örnek olarak, manyetik çekirdek-kabuk Fe3O4@Au nanopartiküller camsı karbon elektrot üzerine tutturularak miyoglobinin immobilizasyon/adsorpsiyonu sonrasında oluşan biyofilm üzerinden elektrokimyasal olarak ölçümü gerçekleştirilmektedir (Masai ve ark., 1990). Bir diğer çalışma ise manyetik çekirdek-kabuk Fe3O4@Au nanopartiküller kullanılarak protein bağlanma reaktivitesi üzerinden bioanaliz çalışmasına yöneliktir.
2.7. Fe3O4-Au Manyetik Nanoçubuklar
Bugüne kadar floresans silika kaplı altın nanoçubuklar ve manyetik nano kristallerin optik ve manyetik özellikleri bulundu. Murphy ve arkadaşları da Fe3O4 kaplı altın
nanoçubuklarını buldu (Yguerabide ve ark., 1998). Basitçe, Fe3O4 nanopartikülleri
içeren altın nanoçubuklar sentezlenmiş ve kanser hücreleri için manyetik rezonans ve floresans görüntüsü olarak kullanılmıştır.
Nanoçubuklar enleri yaklaşık 10-20 nm uzunlukları ise birkaç yüz nm civarına kadar olan nanopartiküllerdir. Altın veya gümüş nanoçubuklar elektrokimyasal veya kimyasal olarak sentezlenebilirler. Partikül şekli partikül plasmonu üzerinde kuvvetli bir etkiye sahiptir. Kimyasal sentezle üretilen nanoçubuklar farklı boyutlarda homojen olarak yüksek verimle elde edilebilir. Sentezin suda kolay gerçekleşmesi ve toksik kimyasal içermemesi nedeniyle nanoçubukların optik özelliklerine ilgi artmıştır. Uyarılma ışığının polarizasyonu nano çubuğun uzun eksenine göre değiştirilmesiyle farklı optik özellikler ve saçılma verimliliği gözlenir. Örnek olarak polarizasyon nanoçubuğun uzun eksenine paralel bir biçimde olduğu zaman gözlenen rezonans kırmızıya ( düşük enerji) kaymış yüksek intensiteli ve dar bir hatta sahiptir. Eğer polarizasyon kısa eksene paralel ise gözlenen resonans çok zayıf, geniş ve yüksek enerjili bölgeye kaymış durumdadır. Nanoküresel yapıya göre nanoçubukların saçılma verimliliği oldukça yüksektir.
Nanoçubuklarda boy-en orani arttıkça ışımasız durulma azalmakta ve saçılma verimliliği artmaktadır.
Yüksek ışımalı kuantum verimi, yüksek saçılma verimi, dar hat özelliği partikül plasmon özelliğine dayanan optik uygulamalarda nanoçubuklar önem kazanmaktadır. Düzlemsel olmayan optik uygulamaya örnek olarak yüzeyde güçlendirilmiş Raman saçılması (SERS) verilebilir. Partikülün çevresindeki elektromanyetik alanın artmasıyla SERS verimi artmaktadır. Nanoçubuklar ayrıca yüksek polarlanabilme özelliğine sahiptir ve yüksek saçılma etkinliği gözlemleri hızlı ve kolay yapmaktadır.
Metal ve yarıiletken nanoçubukların sentezi için birçok sentetik protokol vardır. Nanoçubuklar elektrokimyasal ve kimyasal yoldan farklı boyutta sentezlenebilir. Membranlar gibi katı temptletler içerisindeki nanoboyuttaki porlarda metal-yarıiletken iyonlar reaksiyona sokulur veya indirgenir (Moldenhauer ve ark., 2005; Anonim). Bu şekilde yapılan sentezlerde templetin boyutu değiştirilerek istenilen boyutta nanoçubuk sentezlenebilir. Nanoçubukların sentezi için çekirdek mediated büyüme ve elektrokimyasal metotlar ile yönlendirme ajanı olarak yüzey aktif maddelerin kullanıldığı kolloid sentez mekanizmaları geliştirilmektedir (Campion ve ark., 1998; Freire, 2000).
Altın nanoçubukların kolloidal sentezi için çekirdek mediated sentezinde ilk olarak boyutu 3-4 nm olan altın çekirdek altın tuzunun kaplama ajanı (sitrat) varlığında indirgenmesiyle elde edilir. Bu çekirdekler altın nanoçubukların anizotropik büyümesi için çekirdeklenme merkezleri olarak görev alır. Daha sonra bu çekirdekler daha çok metal tuzu, zayıf indirgenme ajanı (askorbik asit) ve büyüme ajanı olarak yüzey aktif maddenin olduğu çözeltiye konur. Bu şekilde yürütülen bir sentez yoluyla yüksek verimle, kararlı nanoçubuklar elde edilebilir. Ayrıca yüzey aktif maddenin yapısının değiştirilmesiyle çekirdek derişiminin değiştirilmesiyle farklı boy/çap oranlarında altın nanoçubuklar sentezlenebilir.
Nanoçubuğun uygun boyutu oldukça ufaktır ve ilaç dağılım, gen terapisi gibi uygulamalarda potansiyel olarak uygulaması mümkündür. Ek olarak metalik altının biyogüvenirliliği çok iyi bilinmekte ve 1950‟ lerden günümüze in vivo çalışmalarda kullanılmaktadır (Krenn ve ark., 2001).
Burada altın nanoçubuk ve Fe3O4‟un etkileşiminden oluşan fark edilebilir manyetik ve
çekirdek nano yapıları sentezledik. Manyetik altın nanoçubuk sentezlemek için, tohum araçlı sentetik metot gerçekleştirildi. Bu nanopartiküllerin manyetik seperasyonu kolaylıkla gerçekleşti ve elde edilen nanopartiküller SEM, TEM ve UV-Vis ile karakterize edildi ve nanopartiküllerin manyetik özellikleri araştırıldı.
2.8. Literatür Özetleri
Au nanopartiküller, kontrol edilebilir partikül boyutları, kolay sentezleri, uzun süreli kararlılıkları ve iyi eşlenebilirliği (Masai ve ark., 1990; Mann ve ark., 2000; Taton ve ark., 2000; Levit-Binnun ve ark., 2003; Alivisatos ve ark., 1996; Elghanian ve ark., 1997) gibi özellikleri sayesinde yakın zamanda en popüler SERS substratı olmuşlardır. Antijen ve antikorların immobilizasyonu için etkili ve çok yönlü kullanılan Au nanopartiküllerin sadece metal yüzeyinde tutunan antijen ve antikor sayısını artırmadığı, ayrıca immüno aktifliği de koruduğu görüldü (Rembaumand Dreyer, 1980; Cai ve ark., 2001; Chen ve ark., 1998; Xiao ve ark., 1999; Zhao ve ark., 1992).
Yüksek duyarlılığa ve piko molden femto mole kadar algılama yeteneğine sahip yeni bir yöntem olan Yüzeyi güçlendirilmiş Raman Spekroskopisi (SERS) tabanlı immüno analiz yöntemi protein belirlemek için güçlü bir algılama aracıdır.
SERS tabanlı immüno analiz yönteminin yanıt verme kabiliyeti, altın nanopartiküllerin
boyutuyla yakından ilişkilidir(Zhu ve ark., 2004; Rosi and Mirkin, 2005). Krug ve ark.,
(1999)izole edilmiş altın nanopartikülün yüzey güçlendirebilme özelliğini araştırmış ve
ortalama 25 nm boyutundaki bir tek partikülün aktifleştiricinin Raman sinyalini
artırmak için yetersiz olduğunu bulmuştur. Benzer bir şekilde, substrat olarak küçük
altın nanopartikül kullandığında da sinyal görememiştir (Li ve ark., 2008a).Bunun tersi
olarak, daha büyük altın nanopartiküller daha yüksek SERS sinyalleri verecektir. Ama partiküller Raman aktifleştiriciler ile modifiye edildiğinde, kararlılıkları da artan boyutlarıyla belirli oranda azalabilir (Krug ve ark., 1999). Bu yüzden araştırmacılar daha yüksek kararlılık isterlerse, küçük altın nanopartiküllerle SERS tabanlı immüno analiz yapmalıdırlar. Bu arada daha yüksek duyarlılıkla immüno analiz sağlamak için SERS aktivasyonu için ilave bir işlem gerçekleştirilmelidir (Cao ve ark., 2003; Xu ve ark., 2004; Manimaran and Jana, 2007; Han ve ark., 2008; Li ve ark., 2008b; Su ve ark., 2009; Yang and Wang, 2009).
Ni ve ark., (1999) iki analit içeren sandviç immüno analiz çalışmasında okuma metodu
olarak SERS aktifleştirici moleküllerini kullandı. Aktifleştirici moleküller altın
kolloidler üzerinde antikorlarla immobilize edildi. İki farklı immüno altın kolloidin (keçi-anti-sıçan IgG ve keçi-anti-tavşan IgG) üzerinde ayrı ayrı etiketlenmiş iki farklı aktifleştirici molekülün (tiyofenol ve 2-naftalintiyol) karakteristik SERS örnekleri kullanılarak iki farklı antikor (sıçan IgG ve tavşan IgG) tespit edildi. Duyarlılığı artırmak için, yüksek Raman aktifliğine sahip, tiyollü işaret molekülünün tek tabakasını altın nanopartiküllerle kaplayarak immüno analiz gerçekleştirildi.
Yeh ve ark., (2010) sandviç immüno analizini Ag nanopartikül etiketlerini kullanarak gerçekleştirdi (3 tabakalı). Örnek olarak ise kullanışlı ve yüksek spesifikliğinden dolayı Protein A (S. Aeureus türünden) ve antikor (insandan) (ıgG) seçildi. Renk farklılığının ve partikül boyutunun artmasını sağlayan metalik gümüş içeren güçlendirilmiş çözeltideki gümüş iyonlarının indigenmesini hızlandırmak için hedef olarak IgG-AgNP bileşiği kullanıldı.
SERS tabanlı immüno analiz yöntemlerinin gelişimi Au veya Ag nanopartiküller üzerinde ve immüno tanıma moleküllerinden oluşan Raman etiketlerinin bir adlayerı ve hedef analiti immobilize eden katı yüzey SERS aktif substratlardan oluşan sandviç analizi üzerine yoğunlaştı. Bu çalışmanın ilk örneği, Grubisha ve ark., ( 2003) insan serumunda spesifik prostat antijeni (PSA) için 1 pg/mL lik bir algılama limiti rapor etti. Anti-PSA antikorlarını içeren Au kaplanmış lam üzerinde toplanan PSA molekülü, SERS sinyal cevabını kolaylaştıran ve ikincil bir anti-PSA antikoruyla üretilen Raman
etiketlerine bağlanması gösterildi. Bu tanıma platformunun daha düşük algılama
yeteneğine sahip değişik şekilleri çalışıldı. Örneğin; hücre kültüründe bozulmamış feline calicavirusvirions tanınması (Driskell ve ark., 2005), Mycobacterium avium‟un
bozulmamış bakterisi, hücre yüzey antijeni ( Yakes ve ark., 2008a,b) ve insan IgG(Han
ve ark., 2009b ) için gerçekleştirildi.
Lin ve ark., ( 2008) çalışmasında ise Staphylococcus Aureus türünün spesifik bir yüzey antijeni olan protein A‟nın tanınması için SERS tabanlı bir immüno analiz yöntemi kullanıldı. İki fonksiyonlu analiz yapabilen sistem, altın nanopartiküller(AuNP) üzerine antikorun(IgG) kemisorpsiyonu ve ardından IgG-AuNP yüzeyine SERS aktifleştirici olarak bilinen 5,5-ditiobis (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) molekülünün bağlanmasıyla
gerçekleştirildi. Adsorbe edilen DTNB molekülleri hem elektromanyetik hem de kimyasal güçlenme sayesinde daha güçlü Raman sinyalleri verdiği görüldü.
Aktifleştiricinin bağlanması ve antijeni tanıyarak partikülün yakalanması insan serumunda 10 pg/mL lik bir SERS algılama duyarlılığı ve çözeltiden manyetik ayırma ile alınan bir sandviç immünokompleks sağlamıştır. Konuyla ilgili diğer bir çalışma da, Chon ve ark., (2009) akciğer kanseri proteini aktikleştiricisi olan spesifik bir antikor ve Raman etiketiyle üretilen Au nanoküreler hazırlanmıştır. Her bir Au nanoküre üzerindeki adsorplanmış hedef antijenin tayini Au nanokürelerin yüzey deliklerinde oluşan elektromanyetik „hot spot‟ denilen yapılara benzetildi.
Diğer bir araştırmacı olan Neng ve ark., (2010) ise, SERS substratı olarak Doğu Nil Virüsünün protein kılıfıyla kaplanmış Au nanopartiküllerini kullanarak antikor tayini için nanopartikül tabanlı sandviç immüno analiz yöntemini tanımladı.
3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal
3.1.1. Kimyasal ve Biyokimyasal Malzemeler
Demir (III) klorür (FeCl3)
Demir sülfat penta hidrat (FeSO4.7H2O)
Sodyum Hidroksit (NaOH)
Perklorik asit (HClO4)
Hidrojen tetrakloro aurat (HAuCl4)
Sodyum borhidrür (NaBH4)
Etanol
Heksadesiltrimetil-amonyum bromür (CTAB)
L-Askorbik asit (AA)
Gümüş Nitrat (AgNO3)
11-merkapto undekonik asit (11-MUA)
3-merkaptopropionik asit (3-MPA)
N- (3-Dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodimid hidroklorür (EDC)
N-Hidroksisülfosüksinimid sodyum tuzu (NHS)
Fosfat Tamponu (PBS)
Etanolamin
DTNB (5,5 ditiobis (2-nitrobenzoik asit)
Tavşandan üretilmiş anti-SEB poliklonal antikorlar
(Massachusetts. USA).
Staphylococcus enterotoxin B (SEB)
HEPES tamponu
Bütün çözeltiler
3.1.2. Kullanılan Cihazlar 3.1.2.1. Santrifüj aleti
Sigma Soğutmalı santrifüj: nanopartikülleri sentezlerken ortamda aşırı miktarda olan bazı maddeleri, örneğin nanoçubuk sentezinde yüzey aktif maddesi olan CTAB‟ın aşırısını ortamdan uzaklaştırmak için, santrifüj işlemi gerçekleştirildi.
3.1.2.2. Ultrasonik Banyo
Manyetik nanopartiküllerin en önemli sorunu agregasyondur. Şekil 3.1 deki ultrasonik banyo kullanılmasının nedeni iyonik etkileşimlerle ilgili (yığılma), birikme problemlerinden kaçınmak ve homojen bir şekilde partiküllerin oluşmasını sağlamaktır.
Şekil 3.1. Ultrasonik banyo
J.P. SELECTA ULTRASONS ısıtma kapasitesi : 0-80°C Hacmi: 5 litre
paslanmaz çelik hazne Süre: 0-60 dakika
3.1.2.3. SERS Ölçüm Düzeneği
DeltaNu Examiner Raman Mikroskop (Deltanu Inc., Laramie, WY) 785 nm lazer kaynağı, mikroskop için hareketli lamel-numune- tutma haznesi ve CCD dedektor ile birlikte SEB tayini için kullanılmıştır. Cihaz parametreleri ise 20x objektif, 112 mW lazer gücü, 30 saniye veri toplama süresi olarak ayarlanmıştır. (Şekil 3.2)
3.1.2.4. UV-Visible Spektrofotometre Düzeneği
Sentezlenen manyetik demir-altın nanopartiküllerin absorpsiyon spektrumları fotodiyot analiz dedektörüne sahip şekil 3.3 deki Agilent 8453 UV-Visible spektrofotometre (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ile kaydedilmiştir.
Şekil 3.3. Agilent UV-Visible Spektrofotometre
3.1.2.5. Geçirgenli Elektron Mikroskop (TEM) Ölçüm Düzeneği
TEM ölçümleri JEOL 2100 HRTEM (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) ile gerçekleştirilmiştir. TEM örnekleri TEM haznesi üzerine pipetle 10 μL nanopartikül eklenerek 10 dakika bekleme süresi sonunda ölçüme hazır hale getirilmiştir.
