Salmonella’da strese yanıt gen ifadelerinin elektroforetik tiplendirilmesi

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

TIBBİ MİKROBİYOLOJİ

ANABİLİM DALI

SALMONELLA’DA STRESE YANIT GEN

İFADELERİNİN ELEKTROFORETİK

TİPLENDİRİLMESİ

(Uzmanlık tezi)

Dr. Demirhan GÜVEN

TEŞEKKÜR

Uzmanlık eğitimimde ve tez çalışmamda yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen sayın hocam Doç. Dr. Neşe Akış’a, sayın hocalarım Prof. Dr. Murat TUĞRUL’a, Prof. Dr. Şaban Çavuşlu’ya, Doç. Dr. Nermin ŞAKRU’ya, Doç. Dr. Şaban GÜRCAN’a, asistan arkadaşlarıma ve laboratuvar personeli arkadaşlarıma teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

TARTIŞMA

SONUÇLAR

ÖZET

SUMMARY

KAYNAKLAR

EKLER

KISALTMALAR

Amp: Ampicillin

ATCC: American Type Culture Collections BHIB: Brain Heart Infusion Broth

BSA: Bovine Serum Albumin CFU: Colony Forming Unit Cip: Ciprofloxacin

EMB: Eosine Methylene Blue MHB: Muller Hinton Broth

MIC: Minimum Inhibitory Concentration PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBP: Penisilin Bağlayan Protein

PBS: Phosphate Buffered Saline SDS: Sodium Dodesil Sülfat

1

GİRİŞ VE AMAÇ

Bakterinin yaşamını sürdürebilmesi ve neslinin devamını sağlayabilmesi için yaşadığı ortamın kimyasal durumu ve fiziksel şartları hakkında sürekli bilgi alması ve değişen duruma göre davranışlarını yeniden düzenlemesi gerekir. Bakteriler çevreden gelen bilgilere adapte olarak yaşamını sürdürür veya strese karşı geliştirdiği mutasyonlarla yaşamını düzenler. Bakteri evrimi boyunca birçok stres ortamı ile karşılaşmış, karşılaştığı streslere karşı adaptif yanıt ile sonuç alamadığında mutasyon yanıtı geliştirerek kazanımlarını genomuna işlemiş ve böylece soyunun devamını sağlamıştır. Değişik besin ortamı, değişen yaşam koşulları, farklı konakların savunma sistemi gibi çeşitli streslerle karşılaşma durumlarında etkene özgü yanıtların çoğu genomda hazırdır ve bu bilgiler genomdan okunarak ilgili protein ürünleri sentezlenir (1).

Yanıtı genomda henüz hazır bulunmayan ve mevcut stres genleri ile adapte olunamayan stresler karşısında bakterinin seçeneği mutasyonlara başlayarak yeni duruma karşı yeni gen kazanma girişimidir. Bu süreçte bakterilerin çoğu doğrudan stres faktörünün etkisiyle veya kendilerine zarar veren mutasyonlar nedeniyle yok olurken, nadiren doğru gen kazanabilen bakteriler ortaya çıkar. Sürecin etkin olabilmesi için bakterilerde adaptif yanıt ve mutasyonun rastgele gen bölgelerinde değil ama bir yönlendirme altında olması beklenir, böylece, stres yanıtı ve mutasyon makinası doğru gen adasına yönlendirilerek enerji ve zamandan tasarruf sağlanır. Bir gen adasına yönlendirme yapılabilmesi için stresin tipinin kategorize edilmesi, bir başka deyişle, hangi gen adasında muhtemel stresle başa çıkabilecek genlerin bulunabileceği öngörülmelidir. Bakteriler evrimleri boyunca stres yanıtı geliştirme

2

pratiği kazandığından, stresin kategorize edilmesi ve doğru operona yönlendirme yapılmasında ustalaşmışlardır (2).

Bakteri hücre membranı dış ortamdaki olumsuz kimyasal ve fiziksel şartlara karşı bakteriyi koruyan bir kalkandır. Ayrıca, bakterinin dış dünyadaki değişiklikleri algılamasını sağlayan reseptörleri, virülansda kullandığı istila ve toksik savunma proteinlerini, membran tamir ve transportunda rol oynayan enzim ve porları, stresi bildiren ve karşı direnç sağlayan molekülleri barındıran bir bölümdür (3,4). Bakteri stres yanıtı geliştirdiğinde ifade edilen yeni gen ürünlerinin önemli bir kısmı dış membrana yerleşir, böylece membrandaki ifade profili değişir. Bakterinin stres karşısında dış membranına yerleştirdiği proteinleri incelemek, bakterinin yanıt biyolojisi hakkında değerli bilgiler elde edilmesi ve yeni hedef genlerin keşfedilmesine olanak sağlar (5).

Antibiyotikler zehir etkileriyle bakteriler için önemli stres kaynağıdır. Antibiyotik stresine karşı bakterinin yanıt ürünleri ve direnç kazandığında bazı mutasyon ürünleri, bakteri membranındaki ifade profil değişimiyle izlenebilir ve analiz edilebilir. Böylece, ilk savunmada kullanılan ve sonradan dirençli suşların ortaya çıkışını sağlayan genler hakkında değerli bilgiler edinilir, bu genlerin aktivitesini durduracak yeni drug tasarımı mümkün olabilir. Bu yolla geliştirilebilecek muhtemel ilaçların enfeksiyona karşı antibiyotiklerle kombine kullanılması söz konusu olabilir ve halk sağlığı açısından önemi yararlar vaad edebilir (6-9).

Bu çalışma, antibiyotiğe maruz kalarak stres algılayan bakterinin izlediği gen kullanım davranışını dış membran ifadesi düzeyinde anlamak için tasarlanmıştır. Çalışma modeli olarak

Salmonella enteritidis bakterisi ve etkilendiği antibiyotikler seçilmiştir. Bu bakterinin seçilme

nedeni, insanlarda ve hayvanlarda hastalık etkeni olması, gıda ve su kaynaklı salgınlara yol açması ve ayrıca, genomik yapısının tanımlanmış olmasıdır. Patojenin yol açtığı sistemik enfeksiyonların tedavisinde kullanılan ampisilin ve siprofloksasinin bakteride dirence yol açmasından bakteri için stres kaynağı olduğu anlaşılmaktadır. Çalışmanın amacı, antibiyotik duyarlı Salmonella enteritidis bakterisinin ampisilin veya siprofloksasine maruz kaldığında dış membranında yeni ifade ettiği gen ürünlerini bulmaktır.

Dünya suşlarında coğrafi adaptasyon nedeniyle büyük gen değişiklikleri rapor edildiğinden, farklı bölgelerde bulunan Salmonella enteritidis suşlarının aynı antibiyotiğe maruz kaldıklarında farklanmış stres yanıtı geliştirmesi söz konusu olabilir. Bu nedenle çalışma kaynakları ve antibiyotik duyarlılıkları farklı Salmonella enteritidis suşlarının karşılaştırmalı analizi şeklinde planlanmıştır (10).

3

Çalışmanın in vivo enfeksiyon ortamını temsil eden modelde yapılması istenmiş, bunun için sıvı besiyerinde çoğaltılmış bakterilerin doğrudan antibiyotiğe maruz bırakılması planlanmıştır. Çalışmanın hipotezi, ’’ampisilin ve siprofloksasinin klinik dozuna maruz kalan

Salmonella enteritidis bakterileri savunma yapmak ve direnç geliştirmek için ortak ve ayrıca

genetik ard alanları dolayısıyla farklı stres genleri ifade eder’’ iddiasıdır.

4

GENEL BİLGİLER

Mikroorganizmaların öldürücü ortamlarda nasıl yaşadıkları ve stresli ortamlarda ortaya çıkan adaptasyon mekanizmalarının özellikleri, uzun yıllar araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Çeşitli araştırmacılar tarafından, bakterilerin stres faktörüne karşı geliştirdiği stres yanıtı ve adaptasyon mekanizmaları laboratuvar ortamlarında incelenmiş ve bu çalışmalar, bakterilerin hem davranış modelleri hakkında hem de genomik ve proteomik yapısı hakkında çok önemli bilgilerin elde edilmesini sağlamıştır.

İnsanda hastalık etkeni olan bakteriler kimyasal (antibiyotikler, dezenfektanlar gibi) ve fiziksel (sıcaklık, osmotik basınç) streslerle, eskiye nazaran günümüzde daha fazla kaşılaşmaktadır. Tüm bu artan stres faktörleriyle karşılaşan bakteriler, geliştirdikleri çeşitli yanıt mekanizmaları ile stres faktörüne karşı direnç kazanırlar ve bu kazanımlarını genomik yapılarına da işleyebilirler. Ayrıca strese yanıt için kazandıkları bu genomik yapılar onların başka bir stres faktörüne karşı korunmasını da (çapraz koruma) sağlayabilmektedir. Örneğin, Salmonella ile yapılan çalışmalarda aside karşı dirençli hale getirilen Salmonella suşlarının aynı zamanda yüksek ısı, osmolarite, oksidatif streslere karşı da tolerans kazandığını ortaya çıkarmıştır (11). Ortaya çıkmış olan bu durum bakterilerin dış ortama uyumu yanı sıra enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde kullanılan antibiyotiklere karşı çapraz dirence yol açacak ve bu patojenlerin sebep olduğu enfeksiyonların tedavisini zorlaştıracaktır.

BAKTERİ VE STRES

Stres, bakterinin karşılaştığında olumsuz/zararlı olarak algıladığı dış bir faktör olarak tanımlanabilir. Stres faktörü, bakteri hücresinde bazen tek bir fonksiyonu etkilediği gibi bazen

5

de birden fazla fonksiyonunu etkileyebilir. Stres faktörünün algılanması tek tek hücreye bağlı olduğundan stres için evrensel bir tanım yapmakta zordur. Ancak, yine de bir tanım yapmak gerekirse, üreme oranında azalmayla sonuçlanan optimal üreme koşullarından herhangi bir sapmaya yol açan zararlı faktöre veya ortama stres denir (12,13).

Bakteri hücresi karşılaşmış olduğu stresin şiddetine bağlı olarak farklı yanıtlar verebilir. Örneğin, hafif şiddetteki stres bakteri sayısında bir azalmaya neden olmadan üreme düzeyinde durma veya azalmaya sebep olurken, orta şiddette bir stres ise mikrobiyal gelişim düzeyinde durmanın yanında, bakterilerin yaşama kabiliyetlerinde azalmaya da neden olmaktadır. Ancak, ağır şiddetteki bir stres durumunda ise bakteri hücreleri için ölümcül bir durum oluşturmakta ve bu duruma adapte olamadığı için de bakteri populasyonunda önemli kayıplarla sonuçlanmaktadır (13).

Bakteriler yaşadığı ortamdaki doğal koşullar nedeniyle veya insan kaynaklı müdahaleler sonucunda stres faktörlerine maruz kalabilirler. Bu stres faktörleri bakteri hücresinde bazen tüm hücre aktivitelerini olumsuz yönde etkilerken bazen de sadece özel bir hedefi etkileyebilmektedir. Bakteriler için stres faktörlerini aşağıdaki başlıklar altında toplayabiliriz:

a. Fizikokimyasal ve kimyasal parametreler; sıcaklık, basınç, turgor basıncı, irradyasyon, pH, osmolalite (tuz konsantrasyonu), oksijen ve redoks durumu

b. Besin yetersizliği; karbon, fosfat, nitrojen, amino asit ve su gibi temel kaynakların eksikliği veya yokluğu

c. Toksik maddeler; toksinler, antibiyotikler, ağır metaller ve mutajen maddeler d. Diğer hücrelerle etkileşimler; enfeksiyon sırasında konak savunma hücreleri,

konak florası ve yüksek hücre yoğunluğu (14,15).

Stres Sinyalinin Algılanması

Çevresel stresin çeşitli tiplerine karşı koymak için bakteri hücrelerinin etkili ve iyi adapte olmuş mekanizmaları geliştirmiş olması büyük önem taşımaktadır. Hem zaman hem de eylem tipi bakımından, doğru stres yanıtının oluşturulabilmesi için, hücrenin çevresinde olup bitenler hakkında gerekli bilgileri alması gerekir (16). Bunun için bakteriler, belirli uyaranları algılayan ve yanıt oluşturan karmaşık stres sinyalizasyon sistemleri geliştirmişlerdir. Bu

6

sistemler hücrenin değişen çevresel koşulları zamanında algılamasını sağlar, böylece, gerekli yanıtın oluşturulması için bakteriye fırsat kazandıracaktır (17).

Stres uyaranının membran boyunca transferinden sorumlu olan en iyi çalışılmış mekanizmalar, iki komponentli sistemler (örneğin, membran bağlı histidin kinazlar) ve kemotaksis sistem bileşenleridir (örneğin, membran bağlı kemoreseptörlerdir) (18,19). Dış stres uyaranlarının bakteri hücre membranında bulunan reseptörler tarafından algılanması, bu sinyalin hücre içindeki ilgili stres yanıt faktörlerini aktiflemesi ve sonuçta hücrede meydana gelen stres yanıtı Şekil 1’de gösterildi.

Şekil 1. Bakteri hücresinde stres faktörünün algılanması ve yanıt şeması (20)

Stresle Mücadele Etme Stratejileri

Çeşitli stres faktörleri ile karşılaşan bakteriler gelişim süreçlerinde kazandıkları çeşitli mekanizmalarla stres etkeniyle mücadele etmeye çalışır. Dayatılan strese karşı yanıt, stresin zararlı etkileri ile mücadele etmek için gerekli olan ürünleri kodlayan genlerin ifade motiflerindeki değişikliklerle gerçekleştirilir. Stres yanıt genlerinin uyarılması, gen ifadesini koordine eden Ribonükleik asit (RNA) polimeraz enzimi ile etkileşen transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuyla sağlanır (21). Bakteri hücresinde stres yanıtının hem özgül olmayan (ısı, asit, peroksitler) hem de özgül stres faktörleriyle (antibiyotikler gibi) karşılaştıktan sonra dakikalar içinde başladığı yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Bakterilerde tanımlanmış stres yanıt yöntemleri (22):

7

a. Stres faktörünün bertaraf edilmesi; bakteri hücresi hücre içi osmolarite ayarı yaparak, yeni besin kaynakları arayarak, toksik maddeleri parçalayarak veya hücre dışına atarak stres etkeniyle mücadele eder.

b. Hücredeki hasarın tamir edilmesi; deoksiribonükleik asit (DNA) tamiri yaparak, sitoplazmadaki veya hücre duvarında bulunan proteinlerin tamirini yaparak strese karşı yanıt oluşturur.

c. Stres durumundan kaçma; kemotaktik hareketle ortamdan uzaklaşarak, spor veya biofilm tabakası oluşturarak, direnç geliştirme veya morfolojik adaptasyon yapmak süretiyle stres faktöründen kurtulmaya çalışır (12,13).

Bakteri hücresi yukarıda bahsedilen yöntemlerden bazen bir tanesini bazen de birden fazlasını kullanabilme yeteneğine sahiptir. Bakterinin hangi savunma yöntemini kullanacağını belirleyen faktör stresin türüdür. Bu savunma yöntemlerini kullanabilme yeteneğine sahip olan bakteriler yeni ortama uyum sağlayabilecektir.

Stres Yanıt Faktörleri ve Mekanizma

Bakterilerin stres yanıtının moleküler düzeylerde araştırıldığı çalışmalar sonucunda birçok stres yanıt faktörlerinin (SOS, sigma faktör, RpoS, PhoP gibi) sentezlendiği tespit edilmiştir. Bu stres yanıt faktörleri bazen doğrudan stres etkeninin zararlı etkileriyle mücadele ederken bazen de bakterideki ilgili stres yanıt genlerini aktive ederek hücrede tamir, transport, direnç sağlayan proteinlerin sentezini sağlar. Böylece, bakteri sentezlediği proteinlerle maruz kaldığı stres ile baş edebilecek düzeye ulaşabilmektedir.

Acil yanıt faktörü: Bakterilerde DNA hasarına sebep olan stres etkenlerine karşı acil yanıt geliştiren sistemidir (SOS). Bu sistemin uyarılmasıyla içerisinde çoğu DNA tamirinde rol oynayan ve aralarında Arc, Mrc ve sigma faktörün olduğu yaklaşık 20 adet genin transkripsiyonunu arttırır. Yapılan çalışmalarda, Escherichia coli’nin yaşlanmış kolonilerinde oluşan mutasyonlarda, açlık stresi yanıtında, Salmonella’da siprofloksasinin indüklediği direnç mutasyonları ve safra tuzlarına gösterilen direnç mutasyonları için SOS yanıtının gerekliliği gösterilmiştir (23).

Sigma faktörü: Stres yanıt faktörleri arasında en çok çalışılmış ve hakkında en fazla bilgi edinilen faktördür. Bakteride gen ifadesindeki değişiklikler genellikle bakteri hücresindeki mevcut RNA polimerazın katalitik merkezi ve farklı sigma faktörleri (σ)

8

arasındaki etkileşimler yoluyla transkripsiyonal düzeyde kontrol edilir. Yeni proteinleri çevirebilen RNA polimeraz, özel çevresel koşullar altında uygun genleri tanıma ve mesajcı Ribonükleik asit (mRNA) transkriptinin oluşturulmasından sorumlu enzimdir (21,24). Sigma faktör, prokaryotik RNA polimerazın birbirine uymayan altbirimidir. RNA polimeraz, gen dizisinden önce gelen promotor alanlar olarak adlandırılan iyi korunmuş DNA motiflerini tanıyan holoenzimdir. Sigma faktörü, ayrıca, transkripsiyon başlamasında kritik bir adım olan DNA zincir ayrılmasında katkıda bulunur (Şekil 2).

Şekil 2. Sigma faktörünün (σS) çeşitli stres uyaranları tarafından farklı basamaklarda düzenlenmesi (25)

Transkripsiyonun başlamasından kısa bir süre sonra RNA polimeraz kor enziminden ayrışan sigma subüniti, böylece, tekrar birleşme için kullanılabilir hale gelir. Tek bir sigma faktör tarafından kontrol edilen gen kümesi yüzlerce sayıda olabildiği gibi, sigma faktör çok sayıda prokaryotik genin eş zamanlı düzenlenmesi için de etkili mekanizmalar sağlar (1,26).

Sigma faktörleri yapısal olarak birbiriyle ilgisiz iki aileye ayrılır; σ54 ve σ70 aileleri. σ54 ailesini oluşturan alt birimleri genellikle σN olarak da adlandırılır. σN, Legionella

pneumophila, Pseudomonas spp, Enterococcus faecalis, Campylobacter jejuni, ve Listeria monocytogenes’i kapsayan çeşitli bakteri türlerinde saptanmıştır. Bir takım organizmanın

nitrojen metabolizmasını düzenlemeye ek olarak, σN-bağımlı genler ayrıca, metabolik süreçlerin çeşitli kısımlarına katkıda bulunur (27,28).

Sigma 54 ailesinden daha büyük ve daha farklı olan σ70 ailesi, primer dizileri ve yapılarının korunmasına göre dört gruba ayrılır (29,30). Grup 1 sigma proteinleri, primer

9

sigma faktörleridir ve ayrıca, bakteriyel üreme ve metabolizma için önemli genlerin transkripsiyonunu doğrudan yönlendirdiğinden ifadesi değişmeyen temel sigma faktörü olarak da adlandırılır. Kalan gruplardaki sigma faktörleri alternatif sigma faktör olarak da adlandırılır ve sıklıkla sporulasyon gibi özel fizyolojik süreçleri düzenler. σS (RpoS) ve σB (Sig B) sırasıyla gram negatif ve gram pozitif bakterilerdeki genel stres yanıtında alternatif sigma faktör olarak tespit edilmiştir (31).

Eksponensiyal üreme koşullarından ayrılan ve stasyoner faza geçen hücrelerde hücre canlılığını korumak için gerekli çok sayıda genin ifadesini aktive eden σS, grup II sigma faktör olarak hem Escherichia coli hem de Salmonella typhimurium’da tespit edilmiştir. Stasyoner faza girişle ilişkilendirildiği gibi çeşitli çevresel stres koşullarına yanıtta E. coli ve

S. typhimurium’a yardımcı olmanın yanı sıra, σS ayrıca, virülansla ilişkili genlerin ifadesine de katkıda bulunur (32,33).

Sigma B tarafından kodlanan grup III sigma faktör, ilk olarak Bacillus subtilis’de tespit edildi (34,35). Ayrıca, L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis ve

Bacillus licheniformis’de tespit edilmiştir. B. subtilis’de σB-bağımlı genel stres regülonu

büyüktür; sıcaklık, asit, etanol, tuz stresi, stasyoner faza girişte, glukoz, oksijen veya fosfat açlığına bakteriyel maruziyeti takiben 200 kadar geni aktive eder (36,37). Yapılan çalışmalarda, B. subtilis’da sigB bozulmasının organizmada spor oluşturma ve üreme kabiliyeti üzerinde belirli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. σB mutasyonları, bakteriyi oksidatif strese karşı duyarlı hale getirmiş ve ayrıca, etanol içinde üremeyi ve aşırı pH’da hayatta kalmayı azaltmıştır (38,39).

Ekstrasitoplazmik fonksiyonlu grup IV sigma faktörleri, hem gram pozitif hem de gram negatif türlerde korunmuştur ve σ70 ailesi içinde filogenetik olarak farklı büyük bir alt aile içerir (40). İlk olarak, E. coli’de bir ısı şok sigması olarak tanımlanan ekstrasitoplazmik fonksiyonlu sigma faktör, periplazmadaki yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine karşı yanıt oluşturur (41). Ekstrasitoplazmik fonksiyonlu alt ailenin üyeleri, membran, periplazma veya hücre dışı ortamdaki koşullara karşı algılama ve tepki verme dahil fonksiyonların geniş bir yelpazesini düzenleyen σ70 ailesinin geri kalanından farklıdır (42). Hücre dışı ortamın algılanması aynı kökten gelen bir iç membran bağlı anti-sigma faktör bağlı olan ekstrasitoplazmik fonksiyonlu sigma faktörün de içinde bulunduğu bir sinyal iletim mekanizması aracılığıyla gerçekleşir (43).

10

Alternatif sigma faktörü: Alternatif bir sigma faktörü olan RpoS, ilk olarak E. coli ve S. typhimurium’da tespit edilmiştir. Bazı gram negatif bakterilerde, besin kısıtlaması, oksidatif stres ve osmotik stres gibi koşullarda indüklenen çeşitli genlerin ifadesini kontrol ederek çeşitli streslere karşı direnç artışı kazandıran genel bir stres regülatörüdür. Ayrıca, artmış osmolariteye maruz kalan eksponensiyal üreme fazındaki hücrelerde önemli rol oynar.

E. coli ve S. typhimurium’da çeşitli streslere karşı yanıtta otuzdan fazla genin ifadesini

indükler. E. coli, S. typhimurium ve Shigella flexineri dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde virülans için gerekli genleri aktive eder. RpoS, ayrıca, S. tyhpimurium enfeksiyonu sırasında önemli bir rol oynar ve makrofaj içine giriş sonrası aktive olur (44).

Bazı stres yanıt genlerinin çeşitli stres faktörleri ile olan ilişkisi Tablo 1’de gösterildi. Tablo 1. Salmonella bakterisinin konak içinde ve konak dışında karşılaşmış olduğu

stres çeşitleri, strese yanıt olarak aktiflenen genler ve sonuçları (45)

Çevre Stres Faktörü İndükleyen gen Sonuç

Konak dışı ortam Soğuk, aşırı asit pH rpoS, csp Genel stres direnci rpoS, fur,

ompR

PhoP, safra direncini indükler

Mide Asit düşük pH

phoP RpoS, kısa zincirli yağ asidi direncini indükler

Doudenum Safra _phoP Membran modifikasyonu, invazyonu baskılar

Oksijen azalması _{fnr, arcA}

Aerobik ortamda

üreyebilme özelliğinden anaerob ortamda üreyebilme özelliğine geçiş

SCFA _rpoS

SCFA karşı asidin

indüklediği çapraz direnç, SCFA’nın indüklediği CAMP direnci

Bakteriyosinler _{??? ????}

İnce bağırsak

Bağırsak florası,

quorum sensing sdiA, luxS

virülansın regülasyonu, asit stresi

Bağırsak epiteli CAMP _phoP LPS _{modifikasyonlar, makrofaj} yapısında CAMP’ne karşı direnç İkinci konak dışında Soğuk, oksijen, besin yetmezliği, yeniden oksijen soluma rpoS, csp, fnr, arcA, oxyR, soxRS

11

İki komponentli düzenleyici sistem: PhoP, PhoQ ile birlikte fonksiyon gören iki komponentli bir regülatuvar sisteminin parçasıdır. PhoP stres sinyalinin algılanması ve iletiminde rol alır. İnorganik ve organik asit stresine karşı S. typhimurium’un asit toleransının araştırıldığı çalışmalarda PhoP’nin önemli bir stres düzenleyicisi olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu stres yanıt faktörünün antimikrobiyal peptidlerin varlığındaki üremeler sırasında indüklendiği tespit edilmiştir (45).

SALMONELLA ENTERITIDIS

Salmonella enfeksiyonları gelişmekte olan ülkelerde olduğu kadar gelişmiş ülkelerde de ciddi sağlık sorunudur. Evcil ve yabani hayvanların gastrointestinal sisteminde flora bakterileri içerisinde yer alan bu tür, doğada yaygın olarak bulunur, insanlarda ve hayvanlarda çeşitli hastalıklara neden olmaktadır (46).

Bu bakterilerde son yıllarda antibiyotik direncinin yanı sıra virülans özelliklerinde de artış meydana gelmiştir. İnsanda tedavi amaçlı kullanılan pek çok antimikrobiyal ajan, hayvancılıkta 1940’lı yıllardan itibaren tedavi amaçlı ve 1950’li yıllardan beri de büyümeyi hızlandırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun, özellikle hayvanlarda dirençli suşların seleksiyonuna ve bu dirençli suşların insanlarda yayılmasına neden olduğu düşünülmektedir. Tifo dışı Salmonella türlerinde ortaya çıkan antibiyotik direncinin en önemli nedenlerinden biri de hayvanlarda antibiyotik kullanımıdır (47).

Doğada yaygın olarak bulunması, global gıda zincirinde artan prevalansı ve virülansı nedeniyle Salmonella enteritidis tüm dünyada, halk sağlığını tehdit eden tıbbi sorunlara ve ekonomik kayıplara yol açmaktadır. İnsanlarda, tifo dışı Salmonella infeksiyonlarında en sık izole edilen etkenler S. typhimurium ve S. enteritidis’dir. Son yıllarda birçok ülkedeki gıda kaynaklı Salmonella gastroenteritlerinden sorumlu ajanın S. enteritidis olduğu bildirilmiştir (48,49).

Morfoloji

Morfolojik yapısı diğer enterobakterilere benzer. Salmonella enteritidis gram negatif boyanan, fakültatif anaerobik, sporsuz, hareketli, 2-5 µm boyunda ve 0,7-1,5 µm eninde basillerdir. Peritrik kirpikleri ile hareket ederler (48).

Gram negatif hücre duvarı; fosfolipid, lipopolisakkarid, lipoprotein ve yüzey proteinlerinden oluşan dış membran ve ince bir peptidoglikan iç tabakadan oluşur (Şekil 3).

12

Şekil 3. Gram negatif bakteri hücre duvarı yapısı (50) Kültür ve Biyokimyasal Özellikleri

Ortam sıcaklığı 37°C ve pH: 7,4 olan besiyeri en ideal üreme koşullarını oluşturur. Üreme ortamında kan, serum, glukoz gibi zenginleştirici maddelere gereksinim duymadan en basit besiyerinde bile çok iyi ürerler. Adi agarda ve kanlı agarda 2-3 mm çapında, yuvarlak, hafif konveks, kenarları düzgün ve nemli görünümde koloniler oluşturur. Salmonella-Shigella (SS) agarda ve üç şekerli demirli besiyerinde H2S oluştururlar (51,52).

Glukoz, maltoz, mannitol ve sorbitolu fermante ederek gaz ve asit oluştururlar. Laktoz ve sakkarozu fermante etmediğinden, Mac Conkey ve EMB agarda renksiz koloniler oluştururlar. Lizin dekarboksilaz ve ornitin dekarboksilaz enzimi bulundurdukları için bu iki amino asidi dekarboksile ederler. İndol oluşturmaz, üreyi hidrolize edemezler ve fenilalanil deaminaz enzimi bulunmadığında fenilalanili deamine edemezler. Metil kırmızısı reaksiyonu pozitif ve Voges-Proskauer reaksiyonu ise negatiftir (52).

Sınıflama

Taksonomik sınıflandırmada, hücreli organizmaların Bacteria modülü, Proteobacteria şubesi, Gammaproteobacteria sınıfı, Enterobacteriales takımı, Enterobacteriaceae ailesi, Salmonella cinsi, Salmonella enterica türünün alt türüdür. Bu alttür, Bergey’in güncellenmiş 2010 baskısında 30 bakteri şubesindeki fakültatif anaerop grubunda bulunur.

Günümüzde Salmonella cinsi, biyokimyasal reaksiyonlar ve DNA hibridizasyon çalışmaları ile yapılan sınıflandırmaya göre iki türe ayrılır; Salmonella enterica ve Salmonella

13

houtenae ve indica) (53). Klinik olarak önemli serotiplerin %99’ü, alttür I’e (Salmonella

enterica subspecies enterica) aittir. Bu sınıflamaya göre, Salmonella cinsinin tür dağılımı

Tablo 2’de gösterildi. Salmonella enteritidis, Salmonella enterica subs. enterica alttüründe yeralır.

Tablo 2. Salmonella cinsinin biyokimyasal ve deoksiribonükleik asit hibridizasyon farklılıklarına göre yapılan sınıflaması (54)

Salmonella türü Salmonella alt türü Habitat

enterica (I) Sıcak kanlı hayvanlar

salamae (II) Soğuk kanlı hayvanlar

arizonae (IIIa) Soğuk kanlı hayvanlar

diarizonae (IIIb) Soğuk kanlı hayavanlar

hountenae (IV) Soğuk kanlı hayvanlar

Salmonella enterica

indica (VI) Soğuk kanlı hayvanlar

Salmonella bongori bongori (V) Soğuk kanlı hayvanlar

Orta sütünda parantez içinde Salmonella alt türlerinin numaraları, son sütünda bu alt türlerin doğal yaşam alanları verilmiştir.

Salmonella cinsinin lipopolisakkarit yapısındaki O (somatik) ve protein yapısındaki H (kirpik) antijenlerinin faklılık temeline dayanılarak düzenlenen Kauffmann-White şemasına göre 2400’den fazla serotipe ayrılır. Kauffmann-White şemasına göre D1 serogrubunda yer alan Salmonella enteritidis’in, O antijenlerinden 1, 9 ve 12 (+), H antijenlerinden g ve m (+) dir (55).

Epidemiyoloji

İnsanlarda, tifo dışı Salmonella infeksiyonları genellikle gıda kaynaklıdır. Et, tavuk, yumurta ve süt ürünleri gibi hayvan kaynaklı yiyecekler, hastalık kaynağıdır. Çiğ veya iyi pişmemiş yiyecekler infeksiyona karşın su kaynaklı salgınlar da görülebilir. Yumurta kaynaklı gıda yolu ile bulaşmada S. enterididis baskın Salmonella serotipidir ve tüm dünyada yaygındır.

Yaptığı Enfeksiyonlar

Dünya’nın her bölgesinde yaygın olarak görülen enfeksiyonlar arasında yer alan Salmonella enfeksiyonları, Türkiye’de önemli halk sağlığı problemlerindendir. Türkiye’de

14

Salmonella enfeksiyonları bildirimi zorunlu hastalıklardandır, ancak, bu konudaki ulusal istatistiksel veriler son derece kısıtlıdır. Türkiye’deki klinik örneklerden en sık izole edilen Salmonella serotipleri, Salmonella enteritidis ve Salmonella typhimurium’dur.

İnsanlarda, mide bulantısı, kusma, karın ağrısı ve ishal gibi çoğunlukla akut başlangıç gösteren ve kendiliğinden sınırlanan gastroenterit tablosu oluşturmasına rağmen septisemi, bakterinin bir ya da daha fazla bölgede yerleşmesiyle lokal infeksiyonlar şeklinde seyreden bağırsak dışı infeksiyonlara, komplikasyonlara ve hatta ölüme de yol açabilirler.

Gastroenterit patofizyolojisi

Salmonella infeksiyonlarında bulaşma fekal-oral yolla olmaktadır. Hasta ya da taşıyıcıların dışkılarının bulaştığı gıda ve sular etkenin yayılmasına neden olur. İnfektif dozu genellikle yaklaşık 1000 Colony Forming Unit (CFU) dır, ancak, bu infektif dozu serotipe ve mide pH’sı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Eğer mide pH’sı yüksek ise düşük bir doz, infeksiyon için yeterli olacaktır. Yüksek bir mide pH’sı Salmonella’nın invazyonunu hızlandırabilir ve bakterinin dolaşım sistemi, karaciğer ve safra kesesine yayılmasına olanak sağlayarak başka komplikasyonlara neden olur (56).

Epitelyum hücrelerine ilk invazyondan sonra konak fagosit hücreleri tarafından bakteri fagosite edilir ve fagositler içerisinde çoğalmaya başlar. Salmonella’nın primer infeksiyon bölgesi distal ileumdur. Salmonella’nın invazyon ve çoğalma stratejileri bakterinin serotipine ve konağın savunma sistemine bağlıdır. Bakteri tercihen epitelyum hücrelerinin dış bölgesine bağlanır. Birçok Salmonella türü endotoksinden başka sitotoksin ve enterotoksin gibi iki çeşit toksin üretir (57). Salmonella tarafından üretilen enterotoksin kolera toksinine benzer bir aktiviteye sahiptir. Salmonella toksini, kolera toksini gibi siklik adenozin monofosfat (cAMP) düzeylerini yükseltir, ancak, iki toksin yapısal olarak farklıdır. Salmonella toksini,

Pseudomonas aeruginosa ve Corynebacterium diptheriae tarafından üretilen toksinlerle

homologdur (58).

Tedavi

Salmonella gastroenteritlerinde antibiyotik tedavisi taşıyıcılık süresini uzatır ve ilaca dirençli suşların oluşmasına yol açar. Bu nedenle Salmonella gastroenteritlerinin tedavisinde antibiyotik kullanımı önerilmez. Ancak kendiliğinden düzelmenin olmadığı yüksek ateşle seyreden olgularda, hastaneye yatmayı gerektiren ağır ishallerde, immün sistemi bozuk olan hasta gruplarında (orak hücreli anemi, AIDS, kanser, yenidoğan ve yaşlı hastalar) antibiyotik

15

tedavisi önerilir. Salmonella’nın sebep olduğu sepsis, lokal organ ve doku enfeksiyonlarının uygun antibiyotiklerle tedavisi gereklidir (59,60). Salmonella infeksiyonlarının tedavisinde sıklıkla kloramfenikol, ampisilin ve trimetoprim/sülfometoksazol kullanılır. Bu antibotiklere direnç varlığında veya sistemik Salmonella infeksiyonlarının tedavisinde üçüncü kuşak sefalosporinler veya siprofloksasin kullanılır (60).

Ampisilin ve Siprofloksasin Direnç Mekanizması

Ampisilin, penisilin grubu bir β-laktam antibiyotiktir. Ana etkisi peptidoglikan sentezi için gerekli olan Penisilin Bağlayan Proteinlere (PBP) bağlanarak hücre duvarı sentezini inhibe eder, bu şekilde bakterisidal etki gösterir. Bu antibiyotiğe karşı direnç gelişimi PBP yapısının değişimi veya β-laktamazlarla enzimatik bozulma şeklinde olur (61).

Florokinolonlar için primer hedef bölgesi, iki A ve iki B subünitten oluşan tetramer yapıdaki DNA girazın subüniti olan GryA’dır. GryA, DNA zincirinin birbirinden ayrılması ve yeniden bağlanmasından sorumludur, GryB ise DNA’nın konformasyonel değişimi için ATP hidrolizi ile gerekli olan enerjiyi üretir. GryA’ya florokinolonların bağlanması, replikasyon çatalı ve transkripsiyonun ilerlemesini önler (62-64). Salmonella enterica’da bu antibiyotik grubuna karşı direncin gyrA’daki mutasyonlarla olduğu düşünülmektedir (65,66). Florokinolonların ikinci bir hedef bölgesi DNA Topoizomeraz IV’ın PARc subünitidir. DNA Topoizomeraz IV, ParC ve Par E olmak üzere iki alt birimden oluşur (66,67).

16

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Bilimsel Araştırma Değerlendirme Komisyonu onayı alınarak (Ek-1) ve Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonundan 2011-36 numara ile destek sağlanarak (Ek-2), Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarlarında ve Trakya Üniversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Merkezi Merkez Laboratuvarı Mikrobiyoloji Bölümü’nde gerçekleştirildi. Çalışma yöntemlerinin anlatımında kullanılan tablo ve şekil listesi Ek-7’de, çalışma uygulama süreci Ek-8’de verilmiştir. Metodlar aşağıdaki başlıklar ve sırayla sunulmuştur:

 Çalışma Materyali  Bakteri Kültürü

o Agar besiyerinde kültür o Sıvı besiyerinde kültür

o Bakteri üreme miktarının saptanması

o Tıbbi laboratuvarda Salmonella bakteri identifikasyonu ve stoklanması  Minimum İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi

o Antibiyotik stok solüsyonu hazırlanması o İnokülumun hazırlanması

o Minimum Inhibitör Konsantrasyonunun standart yöntemle saptanması o Ara dilüsyonla hassas MIC belirlenmesi

o Üremeyi %20, %50 ve %80 oranında engelleyen antibiyotik konsantrasyonlarının belirlenmesi

17

o Bakteri sayısı başına düşen antibiyotik miktarının tayini  Dış membran protein izolasyonu ve ilgili optimizasyon çalışmaları

o İzolasyon o Optimizasyon

 Protein konsantrasyon tayini

 Sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi o Elektroforez sisteminin hazırlanması

o Protein örneklerinin jele yüklenmesi ve yürütülmesi o Jel boyanması ve boyanın geri alınması

o Görüntüleme ve jelin kurutulması

o Bant ağırlığının protein çevirim grafiğinden ölçülmesi

 Bakteride stres yanıtının oluşturulması ve ilgili optimizasyon çalışmaları o Stres

o Optimizasyon

 Elektroforetik bantların biyoinformatik proteom analizi

Çalışmada kullanılan tüm tüp ve şişeler 121 °C’de 15 dk otoklavlanarak (Ek-5) steril edildi. Kontaminasyonu önlemek için tüm çalışmalar biyogüvenlik kabini içinde ve ateş altında steril çalışma tekniğine uygun gerçekleştirildi.

ÇALIŞMA MATERYALİ

Bu çalışmada kullanılan standart suş Salmonella enteritidis, Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi Mikrobiyoloji Bölümü kültür koleksiyonundan alınmıştır. Suş, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonunda ATCC 13076 ile numaralandırılmıştır. Suş kolleksiyonda skim milk besiyerinde – 35°C’de saklanmaktadır. Çalışmaya alınan diğer suşlar, Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi Merkez Laboratuvarı Mikrobiyoloji Bölümünde 01.10.2010 – 30.11.2010 tarihleri arasında dışkı örneklerinin kültüründen izole edilmiş ve standart yöntemlerle serotiplendirilmiş sekiz adet Salmonella

enterica serovar enteritidis suşlarıdır (Tablo 3). Bu suşlar, izolasyon ve serotiplendirme

işleminden sonra -80˚C’de boncuklu saklama tüplerinde (Ek-4) saklanmıştır. Ayrıca, çalışmaya ön çalışmalarda kullanmak üzere hasta materyalinden izole edilen ampisilin ve siprofloksasine duyarlı E. coli suşu katılmıştır.

18

Tablo 3. Çalışmada kullanılan dışkıdan izole edilen suşlar hakkında bilgi

Suş Tarih Antibiyotik Duyarlılığı

1 19.09.2010 AMP: S CIP: azR

2 11.10.2010 AMP: S CIP: azR

3 16.08.2010 AMP: S CIP: azR

4 21.10.2010 AMP: S CIP: S

5 27.07.2010 AMP: S CIP: S

6 18.10.2010 AMP: S CIP: S

7 16.01.2009 AMP: R CIP: S

8 24.05.2010 AMP: R CIP: S

AMP: Ampisilin; CIP: Siprofloksasin; S: Duyarlı; R: Dirençli; azR: azalmış siprofloksasin duyarlılığı. Sol kolonda suşlar numara ile verilmiştir. İlgili hasta bilgileri arşivlerde kayıtlıdır. Sonraki sütünda

suşların izole edildiği tarih verilmiştir.

BAKTERİ KÜLTÜRÜ

Agar Besiyerine Kültür

Şubat 2011- Ocak 2012 tarihleri arasında suşların -80°C’lik stoğundan agara birkaç kez ekimi yapıldı. Ekimler ‘’Eosin Methylene Blue’’ agar (EMB) (Ek-4) ve %5 koyun kanlı agar plaklarının (Ek-4) yüzeyine tek koloni düşürme tekniğine göre yapıldı. Bu teknikle ilgili genel bilgiler Ek-6' da verilmiştir. Ekim sonrası plaklar 37°C’lik etüvde 18 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası kalite kontrolde üremenin olup olmadığı, üreyen kolonilerin şekli ve büyüklüğü, hemoliz durumu, farklı büyüklükte ve şekilde kolonilerin varlığı (kontaminasyon kontrolü için) ve EMB agarda Salmonella’lar için belirteç olan laktoz negatif özellikte kolonilerin varlığı incelendi. Plaklar çalışmanın sonraki aşamalarında kullanılmak üzere 4°C’ye kaldırıldı.

Sıvı Besiyerinde Kültür

Membran izolasyonuna başlamak için petri plaklarındaki bakteri kolonilerinden 4-5 tanesi alınarak 10 ml besiyeri içeren tüpe aktarıldı ve tüpler iyice vortekslendi. Bakteri süspansiyonu optik okuyucuda ölçüldü. Salmonella için bakteri yoğunluğu seyreltme ile 0,5 McFarland’a ayarlandı ve inokülum olarak kullanıldı. Kültüre 5 x 105 /ml bakteri sayısı ile başlamak için gereken seyreltme yapılarak tüpler 37°C’lik etüve kaldırıldı ve 12 saat inkübe

19

edildi. İnkübasyon sonunda tüplerdeki üreme miktarı ölçüldü. E. coli ile yapılan deneylerde kolonilerden 3-4 tanesi alınarak 10 ml ‘‘Brain Heart Infusion Broth’’ (BHİB) (Ek-3) içinde süspanse edildi ve 1 McFarland bulanıklığında inokülum hazırlandı. Bu inokülumdan 0,5 ml alınarak içinde BHIB bulunan falkon tüplerine aktarıldı ve tüpler 37˚C’de 4 saat inkübe edildi.

Bakteri Üreme Miktarının Saptanması

Üreme sonrası besiyeri içerisinde bulunan bakteri miktarının ölçümü optik yoğunluk ölçen cihazla (Ek-5) yapıldı. >1,1 McFarland üzerindeki ölçümlerde ‘’Phosphate Buffered Saline’’ (PBS) (Ek-3) ile seyreltme sonrası ölçümler yapıldı. Seyreltilmiş kültürün ölçüm değeri seyreltme katsayısı ile çarpılarak McFarland değeri tespit edildi. Bu sayıya denk gelen bakteri sayısı, oordinatda McFarland ve apsiste bakteri sayısı olan bakteri çevirim grafiğinden belirlendi (68). Kaynak bilgi kullanılarak oluşturulan grafik Şekil 4’de gösterilmektedir.

McFarland 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Bakteri sayısı ( x 108/ml) M c F a rl a n d 1,5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Şekil 4. McFarland bulanıklık standardı ve denk gelen bakteri sayısı. Ordinata McFarland sayıları, apsise McFarland bulanıklık standardına denk gelen bakteri sayısı değerleri yazılarak grafik oluşturulmuştur.

Tıbbi Laboratuvarda Salmonella Bakteri İdentifikasyonu ve Stoklanması

Hastane laboratuvarına gelmiş olan materyaller kabul yapıldıktan sonra ilgili teknisyen tarafından uygun agara ekilmektedir (EMB ve SS agar). Ertesi gün plaklardaki koloniler yapıları açısından değerlendirilmekte (EMB agarda düzgün şekilli şeffaf koloniler, SS agarda H2S oluşturmuş şeffaf koloniler). İlgili test besiyerine (Üç Şkerli Demirli Agar, Lizin Iron

Agar, Sitrat Agar, Motilite-Indol-Ornitin dekarboksilaz, Üreaz Agar ve Fenilalanin Agar) ekilmekte, bir sonraki gün besiyerlerinin biyokimyasal reaksiyon sonuçları rehber tablo kullanılarak bakterinin identifikasyonu yapılmaktadır. Salmonella olduğu ispatlanan

20

kolonilere her seferinde iğne özeyle 1 mm kadar daldırılarak alınan bakteriler lamdaki antiserum panelinin her biriyle ayrı ayrı aglütinasyon testine tabii tutulmaktadır. Aglütinasyon veren suşlar hem antibiyogram işlemine tabii tutulmakta hem de boncuklu saklama besiyerine aktarılmaktadır. Antibiyogram işlemi için koloniden alınan örnekten hazırlanan inokülum antibiyogram kartına yüklenerek kartlar Vitek II cihazına (Ek-5) yüklenir. Bu kartların her biri farklı antibiyotikle yüklenmiş gözler içerir. Gözlerdeki bakteri yoğunluk değişimleri 14 saat sonra cihazın optik okuyucusu tarafından saptanır ve bilgisayarından duyarlı veya dirençli sonuç olarak bildirilir. Boncuklu saklama besiyerine bakteri aktarmak için bakteriler kolonilerinden özeyle alınarak aktarılır, karıştırılan boncukların dibindeki sıvı enjektörle geri çekilerek bakteriler – 80°C’de stoklanır.

MİNİMUM İNHİBİTÖR KONSANTRASYONUN BELİRLENMESİ

Antibiyotik Stok Solüsyonu Hazırlanması

Çalışmada, potensi üretici firma tarafından belirlenmiş ampisilin ve siprofloksasin antibiyotikleri kullanıldı. Antimikrobiyal tozlar çalışma zamanına kadar üretici firma önerileri doğrultusunda, ampisilin +4°C’de ve siprofloksasin oda sıcaklığında desikatör içinde saklandı. Stok antibiyotik solüsyonu hazırlanmasında gereken miktarın hesaplaması için aşağıdaki formül kullanıldı (69).

Antimikrobiyal ajanların stok solüsyonu 1024 μg/ml konsantrasyonda olacak şekilde hazırlandı. Ampisilin, üretici firmanın önerileri doğrultusunda distile su içinde çözüldü. Siprofloksasin, üretici firmanın önerileri doğrultusunda distile su içinde manyetik karıştırıcıda karıştırıldı ve 6 N HCl’den 30 μl/50 ml eklenerek çözüldü. Antibiyotikler, 0.2 μm por çaplı membran filtrelerden geçirilerek steril eppendorf tüplerde 1 ml porsiyonlarla kullanılıncaya kadar -80°C’de saklandı.

İnokülumun Hazırlanması

Bir gün öncesinde kanlı agar plağına ekilmiş taze kültürden birbirine benzer 2-3 koloni steril sürüntü çubuğu ile alınarak steril ‘’Muller Hinton Broth’’ (MHB) besiyerinde

21

0,5 McFarland bulanıklığı ayarlandı. Böylece, yaklaşık 1-2 x 108 CFU/ml denk inokülum sağlandı. Bu tüpten 150 μl alınarak içinde 15 ml steril MHB bulunan tüpe aktarıldı ve iyice vortekslendi. Bu şekilde 1 x 106 CFU/ml inokülum elde edildi. Ayrıca kontrol maksadıyla inokülumdan 0,1 ml alınarak kanlı agara ekim yapıldı ve 37°C etüvde 18 saat inkübasyona bırakıldı. Bu plaklar ertesi gün değerlendirildi (69).

Minimum İnhibitör Konsantrasyonunun Standart Yöntemle Saptanması

Suşların ampisilin ve siprofloksasin için Minimum Inhibitory Concentration (MIC) değeri 24 kuyucuklu plakta makrodilüsyon yöntemiyle test edildi (69). Tarafımızdan geliştirilen bu test yönteminin işlerliğini anlamak üzere başlangıçta bu yöntem klasik tüpteki makrodilüsyon yöntemi ile karşılaştırıldı. Her iki yöntemde de ilk kuyucuk veya tüpten başlayarak antibiyotik seri boyunca seyreltildi ve üzerlerine bakteri inokülumu eklendi, sistem inkübatöre kaldırıldı ve ertesi gün sonuçlar değerlendirildi. Kullanılan ayıraçların ayrıntısı her iki sistemde de aşağıda anlatıldığı gibidir. Tüpte makrodilüsyon yöneminin deney seti Şekil 5’de, 24 kuyucuklu makrodilüsyon yönteminin plağı Şekil 7’de gösterilmektedir.

Bu deneyde her bir antibiyotik için ayrı birer plak kullanıldı. Plakların ilk 14 kuyucuğu test edilecek antibiyotiğin seri dilüsyonları için, 15’nci kuyucuk test edilen antibiyotiğin kontaminasyon kontrolü için, 16’ncı kuyucuk seyreltme işleminde kullanılan MHB besiyerinin sterilite kontrolü için ve 17’nci kuyucuk test edilen suşun inokülumunun canlılık kontrolü için kullanıldı. Deneyde kuyucuklara önce antibiyotikler seri seyreltme ile dağıtıldı ve ardından üzerine inokülum eklenerek plaklar inkübasyona kaldırıldı. Ampisilin seyreltmesi için stok solüsyonundan 1 ml plağın birinci kuyucuğuna aktarıldı. Siprofloksasin seyreltmesi için antibiyotik önce 256 µg/ml'ye steril PBS ile seyreltildi ve bunun 1 ml'si plağın birinci kuyucuğuna aktarıldı. Her iki plakta da müteakip 13 kuyucuğa 0,5 ml MHB eklendi. Bunlara birinci kuyucuktan başlayan 0,5 ml’lik seri seyreltme uygulanarak antibiyotik dağıtımı yapıldı. Böylece ampisilinde 1024 µg/ml’den başlayan ve 0,125 µg/ml ile sonlanan; siprofloksasinde 256 µg/ml’den başlayıp 0,015 µg/ml ile sonlanan konsantrasyonlar oluşturuldu. Antibiyotiklerin üzerlerine ve 17’nci kuyucuğa 1 x 106 CFU/ml inokülumdan 0,5 ml eklendi. Böylece, her bir kuyucuktaki antibiyotik konsantrasyonu ve bakteri yoğunluğu yarıyarıya azaldı. Plaklar 37°C’lik etüvde 18 saat inkübasyona bırakıldı. Ertesi gün kuyucuklardaki üremeler hem gözle hem de 96 kuyucuklu plağa nakledilerek 595 nm dalga boyunda mikro optik okuyucuda ölçülerek değerlendirildi. 1-14 kuyucukta üremenin olmadığı son antibiyotik konsantrasyonu MIC olarak belirlendi.

22

Şekil 5. Tüpte makrodilüsyon yöntemiyle Minimum İnhibitör Konsantrasyonun saptanması. İçine ampisilin konan tüpler azalan konsantrasyonda dizilmiştir. Fotoğrafta okla işaretlenen altıncı tüpe kadar olan tüplerde üreme olmazken son beş tüpte antibiyotik miktarı bakterini üremesini engelleyememiştir.

Ara Dilüsyonla Hassas Minimum İnhibitör Konsantrasyonun Belirlenmesi

Deney sadece standart suşla yapıldı. Klasik ‘’Minimum İnhibitör Konsantrasyonu’’ (MIC) deneyi gibi uygulandı, ancak, farklı olarak antibiyotik seyreltmeleri MIC değerinin bir üst ve bir alt dilüsyonları arasında dokuz basamaklı ileri seyreltmeyle yapıldı. Ampisilinde 1024 µg/ml’lik stoktan 100 µl alındı ve 6300 µl steril distile su ile karıştırılarak 16 µg/ml’lik stok elde edildi. Siprofloksasinde 1024 µg/ml’lik stoktan 5 µl alındı ve 5115 µl steril distile su ile karıştırılarak 1 µg/ml’lik stok elde edildi. Bu stoklar daha sonra ampisilinde final 2 ile 0,5 µg/ml ve siprofloksasinde final 0,125 ile 0,03125 µg/ml aralığında antibiyotik seri seyreltmeleri eldesi için kullanıldı. Çalışmada kullanılan seri seyreltme değerleri aşağıdaki Tablo 4'de verilmiştir. Bu antibiyotiklerin üzerine MIC deneyinde olduğu gibi inokülum eklendi, inkübasyonu yapıldı, ertesi gün örneklerden birer numune 96 kuyucuklu plağa aktarılarak optik okuyucuda ölçülerek MIC değeri bulundu.

Tablo 4. Antibiyotiklerin seyreltilmesinde kullanılan antibiyotik konsantrasyonları Ampisilin (µg/ml) Siprofloksasin (µg/ml) 2 0,125 1,8 0,1125 1,6 0,1 1,4 0,0875 1,2 0,075 1 0,0625 0,8 0,05 0,6 0,0375 0,4 0,025

23

Üremeyi %20, %50 ve %80 Oranında Engelleyen Antibiyotik

Konsantrasyonlarının Belirlenmesi

Bu belirlemeyi yapmak için bir grafik çizildi. Bu grafikte, hassas minimum inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesi deneyinde elde edilen optik yoğunluk değerleri ordinata, karşılık gelen antibiyotik konsantrasyonu apsise işlendi. Sıfır antibiyotik konsantrasyonundaki optik değer, üremenin hiç engellenmediği (%0 engellendiği) değerdir. Buna karşılık gelen optik değer bulundu. Bunun yarısı optik değer, üremenin %50 engellendiği antibiyotik konsantrasyonunu temsil ettiğinden, grafikte karşılık gelen antibiyotik konsantrasyonu üremeyi %50 oranında engelleyen antibiyotik konsantrasyonu olarak kabul edildi. Benzer şekilde %20 ve %80 optik değer oranları alındı ve grafikte karşılık gelen antibiyotik konsantrasyonları sırasıyla, üremeyi %20 ve %80 oranında engelleyen antibiyotik konsantrasyonu olarak kabul edildi.

Bakteri Sayısı Başına Düşen Antibiyotik Miktarının Tayini

Stres deneylerinde sıvı besiyerindeki artmış bakteri nüfusunu minimum inhibe edecek antibiyotik miktarı kullanılmıştır. Miktarı bulmak için şu formül kullanıldı:

DIŞ MEMBRAN PROTEİN İZOLASYONU VE İLGİLİ OPTİMİZASYON ÇALIŞMALARI

İzolasyon

Kanlı agardan BHIB besiyerine ekilen ve çoğaltılan bakteriler 2500 x g de 20 dk santrifüjlenerek çöktürüldü. Besiyeri ve bakterilere ait artıkların uzaklaştırılması için çökelti sodyum azidli steril soğuk PBS ile süspanse edilerek mikro eppendorf tüpler içerisinde üç kez mikrosantrifigasyonla yıkandı (10000 x g de 1 dakika). 5 dakika stresi uygulanan hücreler ise önce tüp başına 4 ayrı ve hacminin dört katı soğuk PBS içinde hemen seyreltildi, ardından yıkandı. Son yıkamanın sonunda üst sıvı atıldı, çökeltiye 1 ml soğuk aseton eklendi, steril özeyle iyice karıştırıldı, 5 dk asetonla muamele edildi, 10000 x g de 1 dk santrifüjlenerek üstteki aseton döküldü ve tüplerin ağzı açık bırakılarak kuruması sağlandı. Membran

24

proteinlerinin izolasyonu için tüplere bakteri hacminin iki katı olacak şekilde %2 Triton X-100 ve %2 N-Lauryl sarkosin final konsantrasyonda Tris tampon pH:8,3 (Ek-3) eklendi. Proteazların etkisini inhibe etmek için 5 µl proteaz inhibitör kokteyl (Ek-4) eklendi ve bakteri karışımı 100/dk rotator üzerinde yaklaşık 16 saat oda sıcaklığında bekletildi. Bu sürenin sonunda tüpler 5 dk kaynatıldı, daha sonra 12000x g de 5 dk santrifüjlenerek üst sıvı başka bir eppendorfa aktarıldı ve elektroforez işlemi uygulanana kadar üst sıvı – 30°C’ye kaldırıldı.

Optimizasyon

Bakteriyel dış membran bileşkenlerini izole edecek ekstraktör formülünün optimizasyonu için önce, standart Salmonella suşu ile aşağıda açıklanan optimizasyon deneyleri yapıldı. Bunun için kültürde çoğaltılmış ve PBS’de yıkanmış bakteriler kullanıldı. Çalışma boyunca ara ve nihai ürünler azidli ortamda muhafaza edildi. Membran izolasyonu eğer hemen yapılmayacaksa bakteri çökeltisine %0.05 sodyum azid eklendi ve -80°C’ye kaldırıldı. İzolasyon günü çökelti oda sıcaklığına getirildi ve çalışmaya kaldığı yerden devam edildi.

İlk optimizasyon çalışmasında altı farklı ekstraksiyon karşılaştırıldı. Bunun için altı bakteri çökeltisinden dördünün her biri aynı hacimde ayrı ayrı %2,5 Triton X-100’lü Tris tampon ile, %2,5 Triton X-100’lü PBS ile, %2 N-Lauryl sarkosin’li PBS ile ve %2 NP-40’li PBS ile +4°C’de 16 saat ekstrakte edildi. Beşinci çökeltideki bakteriler aynı hacimde sodyumdodesilsülfatlı ekstraktör ile 5 dk kaynatıldı. Altıncı çökeltideki bakteriler 5 ml soğuk asetonla 5 dk muamele ve üst sıvının atılması ardından aynı hacimde %2,5 Triton X-100’li Tris tampon ile ekstrakte edildi. Tüm inkübasyonlar +4°C’de 16 saat yapıldı ve santrifügasyon sonrası üst sıvılar toplandı (61,70).

İkinci optimizasyon çalışmasında yine altı farklı ekstraksiyon karşılaştırıldı. İkisinde, soğuk asetonla 5 dk muamele ve üst sıvının atılması ardından bakteri çökeltisi aynı hacimde %1 Tween 80’li Tris tampon veya %2 N-Lauryl sarkosine’li Tris tamponla ekstrakte edildi (71). Diğer dördünde ıslak bakteri tüplerinden ikisine bakterilerle aynı hacimde %1 Tween 80’li Tris tampon ve diğer ikisine %2 N-Lauryl sarkosine’li Tris tampon eklendi. Çiftlerden biri 1 saat kaynatarak ekstraksiyona tabi tutuldu. Diğeri tüm ekstraksiyonlar çalkalayıcı üzerinde +4°C’de 16 saat yapıldı. Ekstraktlar santrifügasyon sonrası üst sıvı olarak eppendof tüplerde toplandı (Tablo 5). E. coli ile yapılan ekstraksiyon ön denemesinde çökelti %0,5 Tween 80‘li PBS veya %0,5 Tween 80’li Tris tampon ile +4°C’de 16 saat ekstrakte edildi.

25

Tablo 5. Optimizasyon çalışmasında kullanılan ayıraçlar ve koşulları

Optimizasyon çalışması

İzolasyon Ayıraç ve Koşulları

1 %2,5 Triton X-100’lü Tris, 4°C’de 16 saat

2 %2,5 Triton X-100’lü PBS, 4°C’de 16 saat

3 %2 N-Lauryl sarkosine’li PBS, 4°C’de 16 saat

4 %2 NP-40’li PBS, 4°C’de 16 saat

5 %10 SDS’li ekstraktör ile 5 dk kaynatma, 4°C’de 16 saat

İlk

6 Asetonla 5 dk muamele sonrası %2,5 Triton X-100’li Tris, 4°C’de 16 saat

7 Asetonla 5 dk muamele sonrası %1 Tween 80’li Tris, 4°C’de 16 saat

8 Asetonla 5 dk muamele sonrası %2 N-Lauryl sarkosine’li Tris, 4°C’de 16 saat

9 %1 Tween 80’li Tris, 4°C’de 16 saat

10 %1 Tween 80’li Tris’le 1 saat kaynatma, 4°C’de 16 saat

11 %2 N-Lauryl sarkosine’li Tris, 4°C’de 16 saat

İkinci

12 %2 N-Lauryl sarkosine’li Tris’le 1 saat kaynatma, 4°C’de 16 saat

PBS: Fosfat tampon çözeltisi; SDS: Sodyum dodesil sülfat; dk: Dakika.

Soldan ilk iki sütünda ilk ve ikinci deneyler ve bunlarda kullanılan ekstraktların numaraları görülmektedir. Diğer sütünda kullanılan ayıraçlar ve koşullar verilmiştir.

PROTEİN KONSANTRASYON TAYİNİ

Elektroforez jelinde optimum protein bantlarının oluşması ve karşılaştırma sağlanması için jel kuyucuklarına belirli miktarda protein içeren örneklerin yüklenmesi sağlanmalıdır. Bunun için membrandan izole edilen proteinlerin konsantrasyon tayininin yapılması gerekir.

Örneklerin protein konsantrasyon tayini Bradford yöntemi ile Coomassie Plus Reagent kullanarak ve üretici firmanın önerilerine göre yapıldı. Kalibratör eğrisi elde etmek için önce bir kalibratör hazırlandı. Bunun için konsantrasyonu 2000 µg/ml olan Bovin Serum Albüminin (Ek-4) stok protein karışımı PBS tamponu içinde hazırlandı ve seyreltmek üzere taze olarak kullanıldı. Protein kalibratörü dokuz adet tüpte ve Tablo 6’da belirtilen seyreltme değerlerinde kullanıldı.

Kalibratör ve protein konsantrasyonu bilinmeyen örneklerden 10 µl 96 kuyucuklu mikroplaklara aktarıldı, üzerine 190 µl Coomassie Plus Reagent ilave edildi, plak 30 sn çalkalayıcıda iyice karıştırıldı, oda sıcaklığında 10 dk inkübasyondan sonra renk değişimi 595 nm dalga boyunda optik okuyucuda ölçüldü. Konsantrasyon eğrisini hazırlamadan önce kör okuma değeri tüm diğer absorbans değerlerinden çıkartıldı. Eğri, Excel programı kullanılarak ordinata OD595 okuma değeri ve apsise kalibratör değerleri yerleştirilerek

oluşturuldu. Grafikteki eğriden yararlanarak absorbansı belirlenmiş örneklerin protein miktarları tayin edildi. OD595 okumalarının deterjan ve Trise bağlı sağlıklı sonuç vermemesi

26 Tablo 6. Protein kalibratörünün hazırlanma şeması

Standartlar PBS (µl) PBS üzerine eklenen

BSA çözeltisi (µl) Son Konsantrasyon (µg/µl) A 0 Stok BSA’dan 300 2000 B 125 Stok BSA’dan 375 1500 C 325 Stok BSA’dan 375 1000 D 175 B’den 175 750 E 325 C’den 325 500 F 325 E’den 325 250 G 325 F’den 325 125 H 400 G’den 100 25 I 400 0 0

PBS: Fosfat tampon çözeltisi; BSA: Sığır serum albumini.

Tablonun en sol sütününda harflerle kodlanmış standartlar, ikinci sütünda seyreltme işleminde kullanılan PBS’nin miktarı, üçüncü sütünda stok albuminden ve diğer tüplerden alınacak miktarlar, son sütünda nihai protein konsantrasyonu verilmiştir.

SODYUM DODESİLSÜLFAT-POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ Bakterilerin antibiyotik stresine yanıtda oluşturdukları dış membran proteinlerinin moleküler ağırlıklarının saptanması için Laemmli kesintili dikey sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi kullanıldı (71). Elektroforezde kullanılan ayırma jelinin akrilamid yüzdesi, analiz edilecek örnekteki peptidlerin moleküler ağırlığına göre %10-12 arasında, deneyler için %12 oranında kullanıldı. Ayırıcı jelin üstüne yayılan ve örneklerin yüklenmesi için kullanılan yükleme jelinin akrilamid yüzdesi %4 idi. Bu elektroforez sisteminde SDS, proteinlerin denatürasyonunu sağladı. Elektroforez işlemlerinde deneye başlamadan önce örneklerin jele yüklenme sırası için her seferinde yükleme haritası oluşturuldu.

Elektroforez Sisteminin Hazırlanması

Aralarına jel dondurulacak cihaza ait iki cam plak, saf etanol ile temizlendi ve sabitleme düzeneğine sabitlendi. Cam plakların arasına ayırma jeli (Ek-3) hızlıca pipetlenerek aktarıldı. Karışımdan cam tüpe aktarılan 2 ml jel, polimerizasyonun takibi için kullanıldı. Ayırma jelinin üst kısmının düz olmasını sağlamak için üzerine 150 µl izopropil alkol yayıldı. Jelin polimerleşmesi oda sıcaklığında yapıldı. Polimerleşen jelin üst kısmındaki alkol kurutma kağıdı ile geri alındı, üzerine yükleme jeli hızlıca yayıldı ve içine elektroforez tarağı yerleştirildi. Yükleme jelinin polimerizasyonu yine cam tüpe aktarılmış bulunan 2 ml ile takip edildi. Yükleme jeli de polimerize olduktan sonra camlı donmuş jel sistemi dikey biçimde sabitleme aparatına monte edildi ve aparat elektroforez tankına yerleştirildi. Üst havuza

27

tarağın üstünü aşacak şekilde elektroforez tamponu (Ek-3) dolduruldu, sızıntı kontrolu için üst havuzdaki sıvı seviyesi 10 dk gözlemlendi, sızıntı olmadığından emin olduktan sonra ıslak tarak dikkatlice jelden çıkarıldı. Alt havuza aynı tampon dolduruldu. Elektroforez sistemi güç kaynağına (Ek-5) bağlandı ve 5-10 dk boş sisteme akım verildi.

Deneyde kullanılan elektroforez tamponu için iki ayrı tampon formülü denendi. Bunlardan biri Borat Tamponlu elektroforez sistemi olup burada üst havuz için üst tampon ve alt havuz için alt tampon kullanıldı (Ek-3). Diğeri Tris tamponlu elektroforez sistemi olup yukarıda anlatıldığı gibi her iki havuza da aynı tampon kullanıldı.

Protein Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi

Tarağın jelde oluşturduğu kuyucuklara 8-10 µg protein yüklemek üzere eppendorf tüpte 10 µl protein örneği ile 40 µl örnek yükleme tamponu (Ek-3) karıştırıldı ve karışım proteinlerin tam denatürasyonunu sağlamak için 5 dk kaynatıldı. Kaynatma işlemi tamamlanan 20 µl protein örnekleri yükleme haritasına göre 40 µl’lik kuyucuklara kaçak yapmamaya dikkat edilerek hızla aktarıldı. Kuyucuklardan en az birine moleküler ağırlık elektroforez markırı üretici firmanın talimatlarına uyularak aktarıldı (72).

Yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez işlemi başlatıldı. Tüm işlem boyunca akım 30 mA’de sabit tutularak elektroforez tamamlandı. İzleme boyası jelin diğer ucuna 1 cm yaklaştığında elektroforez sonlandırıldı (72).

Jel Boyanması ve Boyanın Geri Alınması

Elektroforez işleminden sonra jel hızla camlar arasından çıkarıldı, işaretleme maksadıyla yükleme haritasındaki sol alt köşe yarım santim kadar kesilip çıkarıldı, fiksatör metanol içeren boyama solüsyonuna (Ek-3) aktarıldı ve yaklaşık 16 saat hafif çalkalanarak boyandı. Daha sonra jele bağlanmış fazla boyanın uzaklaştırılması için jel boya çıkarma sıvısıyla (Ek-3) muamele edildi. Boya çıkarma sıvısı her iki saatte bir değiştirildi ve toplam 5-6 kez değiştirme yapıldı. Bu şekilde jeldeki fazla boya uzaklaştırılarak protein bantlarının görünür hale gelmesi sağlandı (72).

Görüntüleme ve Jelin Kurutulması

Jellerin ışık kutusu önünde fotoğrafları çekildi. Kurutma öncesi jel %2 gliserol içeren %10’luk asetik asit banyosunda bir çift selülöz membranla 15 dk bekletildi. Kurutulma işlemi için jel membranların arasına yayıldı, arada hiç hava kalmayacak şekilde sistem cam üzerine

28

klips yardımıyla gerildi. 48 saat içerisinde kuruyan jel membranlarla çıkarılarak veri olarak saklandı.

Bant Ağırlığının Protein Çevirim Grafiğiyle Ölçülmesi

Jelin üst sınırından alttaki takip boyasına kadar olan mesafe cetvelle ölçülerek bulundu ve buna toplam uzunluk dendi. Sonra, moleküler ağırlık bandlarının her birinin üst sınıra olan uzaklığı bulundu ve bunlar toplam uzunluğa bölünerek bant başına Rf değerleri bulundu. Bir

semi-log10 grafik kağıdında apsise Rf değerleri ve oordinata bandların moleküler ağırlık ln

değerleri yerleştirilerek eğri çizildi (74). Eğri kullanılarak, ağırlığı bilinmeyen diğer örneklerin ağırlıkları kendi Rf değerleri kullanılarak tespit edildi. Daha sonra moleküler

ağırlıkların amino asit zincir uzunluğuna çevrimi, 1 amino asit = 110 Dalton formülünden yararlanılarak tespit edildi (75).

BAKTERİDE STRES YANITININ OLUŞTURULMASI VE İLGİLİ

OPTİMİZASYON ÇALIŞMALARI

Stres

Deney, 5 x 105 CFU/ml yoğunlukta Salmonella bakterisinin 11-12 saat çoğaltılması ardından besiyerine antibiyotik eklenerek yapıldı. Deney setine, ayrıca, diğer tüplere yapılan tüm işlemlerin uygulanacağı, içinde bakteri ve/veya antibiyotik bulunmayan negatif kontroller eklendi. Bakterilerin 11-12 saat çoğaltılması sonunda tüplerdeki üreme miktarı ölçüldü ve bakteri çevirim grafiğinden bakteri sayısı bulundu. Tüpler santrifüj edildi. Steril çalışma tekniği ile üst sıvı döküldü ve tüpteki besiyeri yenilendi. Tüpler iyice vortekslenerek karıştırıldı. Tüpteki bakteri sayısı başına düşen ampisilin ve siprofloksasinin MIC için gereken miktarlar hesaplandı ve ilgili tüplere eklendi. Ampisilin dirençli klinik suşlarla yapılan deneylerde standart suşun MIC değerinin 10 katı konsantrasyonda antibiyotik uygulandı. Tüpler her iki antibiyotik için 37°C’lik inkübatörde 5 saat, ayrıca, siprofloksasin için 5 dk inkübe edildi. İnkübasyon sonunda tüplerdeki üreme kontrolü için bakteri yoğunlukları kaydedildi. Ayrıca, kontaminasyon kontrolu için 5 saat maruziyet tüplerinden inkübasyon sonrası kanlı agara ekim yapıldı. Tüpler bu işlemlerden sonra santrifüjlenerek işleme yukarıda anlatıldığı gibi devam edildi.

29 Optimizasyon

Yukarıdaki saptanabilir stres yanıtının oluşturulmasını sağlayan antibiyotik maruziyetinin bulunması için önce aşağıda açıklanan bir seri optimizasyon deneyi yapıldı. Çalışmalarda, değişik antibiyotik konsantrasyonları ve maruziyet süreleri denendi, farklı değişkenlerin saptanabilir stres yanıtının oluşumuna etkileri arandı. Aşağıda, Salmonella suşu ile yapılan altı optimizasyon çalışması verilmiş ve stres etkenleri/koşulları toplu halde Tablo 7’de sunulmuştur.

1- Stres, antibiyotik konsantrasyonu ve zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyeri içinde üremiş ve yoğunluğu 8 McFarland olan standart Salmonella bakteri tüplerinden 7 saat ve 24 saat stres uygulanacak olanları santrifüj edildi, üst sıvıları döküldü ve besiyeri tazelendi. Tüplere, kontrol tüpleri hariç, 5 x 105 CFU/ml bakteride üremeleri %20, %50 ve %80 oranında engelleyen konsantrasyonlarda ampisilin ve siprofloksasin, üreme sayılarına bakılmaksızın ayrı ayrı eklendi. 37˚C’ye ayarlanmış çalkalamalı benmaride yapılan inkübasyonda stres yanıtı 40 dk, 2 saat, 7 saat ve 24 saat sonra incelendi.

2- Antibiyotik konsantrasyonu ve zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyeri içinde üremiş ve yoğunluğu 8 McFarland olan ampisilin dirençli 8’nci hasta suşu ve siprofloksasine duyarlılığı azalmış 3’ncü hasta suşu tüplerinde santrifügasyon sonrası üst sıvıları döküldü ve besiyeri tazelendi. Tüplere, kontrol tüpleri hariç, her bir suşun kendi 5 x 105 CFU/ml miktarı için saptanan ve duyarlı olduğu MIC konsantrasyonunda antibiyotik, ayrıca, diğer tüplere bu antibiyotiğin standart suş için bulunmuş olan MIC konsantrasyonunda antibiyotik üreme sayılarına bakılmaksızın eklendi. Stres yanıtı 2 ve 24 saat sonra incelendi.

3- Stres değişkeninin incelemesi: 0,5 McFarland bulanıklığında 1-2 x 108 CFU/ml standart Salmonella bakterisi içeren üç ayrı sıvı besiyerine sırasıyla nihai 1 µg/ml ampisilin, nihai 0.0625 µg/ml siprofloksasin, %5’lik stok çamaşır suyu nihai 1/250 seyreltilerek ayrı ayrı eklendi ve stres yanıtı 12 saat sonra incelendi.

4- Antibiyotik konsantrasyonu ile zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyeri içinde üremiş ve yoğunluğu 8 McFarland olan standart Salmonella bakteri tüplerinden 7 saat ve 24 saat stres uygulanacak olanları santrifüj edildi, üst sıvıları döküldü ve

30

besiyeri tazelendi. Tüplere, kontrol tüpleri hariç, 5 x 105 CFU/ml bakteri için saptanan MIC konsantrasyonunda ve ayrıca, bunun 1,8 katı siprofloksasin bakterinin üreme sayılarına bakılmaksızın eklendi. Stres yanıtı 40 dk, 2 saat, 7 saat ve 24 saat sonra incelendi.

5- Stres ile zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyerinde üreyen ve yoğunluğu 8 McFarland olan bakteriler stres deneyinde anlatıldığı gibi, ancak, bakteri sayısı başına düşen MIC konsantrasyonunun 1,5 katı ampisilin ve siprofloksasine ayrı ayrı maruz bırakıldı. Bunun için, tüplerdeki sıvı besiyerinde çoğaltılan bakterilerin yoğunlukları ölçüldü, 7 saat ve 24 saat tüplerinde besiyeri tazelendi, hesaplanan ampisilin ve siprofloksasin miktarları, kontrol tüpler hariç diğer tüplere eklendi, ve ilgili bakteri tüpleri 5 dk, 2 saat, 7 saat ve 24 saat süreyle ayrı ayrı strese maruz bırakıldı. İnkübasyonlar bittiğinde kontaminasyon kontrolü için tüplerden kanlı agara pasaj yapıldı ve petriler 37°C’lik etüve kaldırıldı. Bu deneyde içinde bakteri veya antibiyotik bulunmayan iki adet kontrol tüp dışında sadece 7 ve 24 saatler için birer kontrol kullanıldı.

6- Stres ile zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyerinde üreyen ve yoğunluğu 8 McFarland olan bakteriler stres deneyinde anlatıldığı gibi bakteri sayısı başına düşen ampisilin ve siprofloksasinin MIC konsantrasyonuna ayrı ayrı maruz bırakıldı. Stres yanıtı 24 saat, 3 gün, 6 gün ve 9 gün sonra incelendi. İlk iki gün 12 saat arayla, ikinci günden sonra ise 24 saat arayla üreme kontrolu için optik okuyucuda ölçüm yapıldı. Üreme miktarında artış olduğunda besiyeri tazelendi, olmadığında besiyeri 36 saat arayla değiştirildi. Planlanan stres süresi dolan tüplerden hem katı agar besiyerine hem de sıvı besiyerine bakterinin canlı olup olmadığını belirlemek amacıyla pasajlar yapıldı.

Kullanılan E. coli suşu ile ön deneme yapılarak farklı stres değişkenlerine yanıt incelendi. Bunun için tüplerdeki 25 ml bakteri süspansiyonları 37˚C’de 4 saat inkübe edildi ve üzerlerine ayrı ayrı nihai 2 µg/ml ampisilin, nihai 0,5 µg/ml siprofloksasin, 100 µl fenol, %30 stoktan 100 µl NaN3, %10 stoktan 300 µl H2O2, 1 N 100 µl NaOH, nihai %1 Triton X-100