diğerinin değişkenleriyle çapraz kombine edilerek denenmiştir. Bu parametreler, stres oluşturan kimyasala maruziyet ile maruziyetin süresidir. Uygulanan stres koşulları Tablo 7’de gösterilmektedir. Belirli stres koşulunun uygulanması sonrası her bir bakteride ifade edilen gen ürün profili, benzer stres koşuluna tabi tutulmayan kontrol bakterilerinin ifade ettiği gen ürün profiliyle karşılaştırılmıştır.
İlk yapılan deneyde bakterilerin düşük konsantrasyondaki ampisilin ve siprofloksasine karşı yanıtı incelendi. En iyi yanıtı sağlayan değişik maruziyet süresi aranmıştır. İlgili bantlar incelendiğinde saptanabilir bir stres yanıtının elde edilmediği görüldü. İkinci deneyde ampisilin dirençli 8 numaralı suş ve siprofloksasine azalmış duyarlı 3 numaralı suş, yine
40
düşük konsantrasyondaki ve her birinin kendi dirençli olduğu antibiyotiğe maruz bırakıldı. Bakterilerin stres yanıtı iki farklı sürede incelendi ve saptanabilir bir yanıta rastlanmadı. Üçüncü deneyde standart suş ilk deneydeki en yüksek antibiyotik konsantrasyonundan 100 kat yüksek oranda antibiyotik stresine maruz bırakıldı. Bu deneyde her iki antibiyotiğe ilaveten sodyum hipokloritin düşük konsantrasyonuna maruziyet de test edildi. İlgili bantlar incelendiğinde saptanabilir bir stres yanıtının elde edilmediği görüldü. Dördüncü deneyde standart suş önceki deneydekinin 1/2 ve 1/4 azaltılmış siprofloksasin konsantrasyonuna maruz bırakıldı, ancak, yanıt 40 dakikadan 24 saate kadar süren bir zaman serisinde incelendi. İlgili bantlar incelendiğinde saptanabilir bir sters yanıtının elde edilmediği görüldü. Örnek jel görüntüleri Şekil 11’de görülmektedir.
A B
K Amp Cip K Amp Cip
kDa: kilo dalton; K: Kontrol; Amp: Ampisilin; Cip: Siprofloksasin
Şekil 11. Saptanabilir stres yanıtı deney sonucu: A- 1/4000 Minimum inhibitör konsantrasyonu, B: Minimum inhibitör konsantrasyonu. Birinci ve beşinci deneye ait ve 7 saatlik stres uygulanan bakterilerin membran elektroforez sonuçları, sırasıyla, sol ve sağ jel fotoğraflarında gösterilmektedir. ‘’B’’ fotoğrafında görüldüğü gibi saptanabilir stres yanıtı sadece MIC konsantrasyon değeriyle elde edilmektedir.
Beşinci deneyde standart suş 1,5 MIC değerinde ve her iki antibiyotiğin stresine ayrı ayrı, 5 dakikadan 24 saate kadar süren zaman aralığında maruz bırakıldı. 5 dk stres yanıt bantları incelendiğinde, her iki antibiyotik için 78 kDa bant ifadesinin dört kat, 39 kDa bant ifadesinin ampisilin için iki kat ve siprofloksasin için dört kat, 35 kDa bant ifadesinin her iki antibiyotik için yarıyarıya azaldığı tespit edildi. 2 saatlik stres yanıtında, 90 kDa bandın ampisilinde iki kat azalırken siprofloksasinde değişiklik olmadığı, 78 kDa bantda ampisilinde değişiklik olmazken siprofloksasinde dört kat azaldığı, 56 kDa bandın siprofloksasinde yarı yarıya azaldığı, 42 kDa bandın ampisilinde üç kat artarken siprofloksasinde üç kat azaldığı tespit edildi. 7 saat stres yanıtı incelendiğinde, 90 kDa bandın ampisilinde dört kat azalırken
-100 kDa -85 kDa -60 kDa -50 kDa -30 kDa -20 kDa 100 kDa- 80 kDa- 60 kDa- 50 kDa- 30 kDa- 20 kDa-
41
siprofloksasinde değişmediği, 78 kDa ve 39 kDa bantların ampisilinde değişmezken siprofloksasinde üç kat azaldığı, 50 kDa bandın her iki antibiyotikde yarı yarıya azaldığı, 48 kDa bandın ampisilinde iki kat siprofloksasinde ise üç kat azaldığı ve 42 kDa bandın ampisilinde iki kat azalırken siprofloksasinde değişmediği saptandı. 24 saat stres yanıtı incelendiğinde, 78 kDa, 50 kDa, 48 kDa ve 42 kDa bantlarda ampisilin için değişiklik olmazken siprofloksasin yanıtında ilk ikisi için iki kat, bir sonraki için üç kat azalma ve sonuncusu için iki kat artış saptandı.
Altıncı deneyde standart suş MIC değerinde ve her iki antibiyotiğin stresine ayrı ayrı maruz bırakıldı. Maruziyet süresi 24 saatten 9 güne kadar süren zaman aralığıdır. Paralel yapılan kültür sonuçları suşun 24 saatten sonra yaşamadığını göstermesi üzerine burada sadece 24 saatın bantları değerlendirildi. Kontrolle karşılaştırıldığında 24 saat stres yanıtında, 78 kDa bandın ampisilinde yarı yarıya azalırken siprofloksasinde iki kat arttığı, 50 kDa ve 48 kDa’da ampisilin ifadesinde değişme olmazken siprofloksasinde iki kat azaldığı, 42 kDa, 39 kDa ve 35 kDa’da ampisilin ifadesinde değişme olmazken siprofloksasin ifadesinde iki kat artış olduğu saptandı.
Escherichia coli’yle yapılan ön denemede bakteriler düşük konsantrasyonda
antibiyotiklere ilaveten beş farklı muhtemel stres kaynağı kimyasala 10 saat maruz bırakıldı. Maruziyet süresince yapılan gözlemde ampisilin ve NaN3 bulunan tüplerde bir miktar,
siprofloksasin ve fenol bulunan tüpte tamamen hücre lizisinin olduğu saptandı. Siprofloksasin ve fenol tüpleri dışlanarak diğer tüplerin bantları incelendiğinde; uygulanan H2O2 ve Triton
X-100 stresine yanıt olmadığı; NaOH’te yanıt olarak 50 kDa ve 56 kDa bantların ve NaN3
yanıtında 30 kDa ve 48 kDa bantların ifadesinin azaldığı; ampisiline yanıtta 39 kDa ve 42 kDa bantların ifadesinin arttığı tespit edildi. Salomenella enteritidis ve E. coli bakterilerinin normal gen ifade profilleri karşılaştırmalı incelendiğinde ortak bantların mevcudiyeti gözlemlendi.
Optimizasyon koşulunun saptanabilir bant vermesiyle ilgili veri Tablo 11’de; Salmonella’da saptanan bantların kDa ağırlıklarıyla ilgili veri Tablo 12’da sunulmaktadır. Tablo 11’deki standart Salmonella bakterisi ile yapılan deneylerin sonuçları göstermiştir ki sadece MIC ve üzeri değerde antibiyotik konsantrasyonu ile saptanabilir gen ifade değişimi elde edilmektedir.
42 Tablo 11. Stres yanıtı optimizasyon deney sonuçları
Stres Bakteri Stres etkeni Konsantrasyon Zaman Saptama
1,2,3 1/200-16000 MIC 40dk, 2sa, 7sa, 12sa, 24sa Negatif
6 1 MIC 24sa, 3gün, 6gün, 9gün Pozitif
5
Ampisilin
1,5 MIC 5dk, 2sa, 7sa, 24sa Pozitif
1,2,3,4 1/200-16000 MIC 40dk, 2sa, 7sa, 12sa, 24sa Negatif
6 1 MIC 24sa, 3gün, 6gün, 9gün Pozitif
5
Siprofloksasin
1,5 MIC 5dk, 2sa, 7sa, 24sa Pozitif 3
S. enteritidis
Çamaşır suyu 12sa Negatif
Fenol 12sa Değerlendirilmedi
NaN3 12sa Pozitif
H2O2 12sa Negatif
Triton X-100 12sa Negatif
NaOH 12sa Pozitif
Ampisilin 1/4000 MIC 12sa Pozitif
E. coli
Siprofloksasin 1/4000 MIC 12sa Değerlendirilmedi
NaN3: Sodyum azid; H2O2: Hidrojen peroksit; NaOH: Sodyum hidroksit; MIC: Minimum inhibitör
konsantrasyon; E. coli: Escherichia coli; S. enteritidis: Salmonella enteritidis.
Sol sütünda ‘’stres’’ başlığı altında optimizasyon deney numaraları, sonraki dört sütünda başlıklarda belirtilen deneylerle ilgili değişkenler, son sütunda her bir deney koşulunda elde edilen stres yanıtının saptanabilirliği pozitif veya negatif olarak belirtilmiştir. Buna göre, deneyler sonucunda stres yanıtının saptanması için Salmonella bakterilerinin en az MIC konsantrasyonunda antibiyotiğe maruz bırakılması gerektiği anlaşılmaktadır. Burada E. coli’nin daha düşük konsantrasyonda ampisilinle de saptanabilir stres yanıtı verdiği görülmektedir. İlgili elektroforez deneylerinin toplu bant dökümü Ek-9’daki Tablo 17 ve Tablo 18’de verilmiştir.
İki farklı tür bakterinin ampisiline yanıtı konsantrasyon açısından karşılaştırıldığında
E. coli’nin daha düşük ampisilin konsantrasyonunda saptanabilir stres yanıtı gösterdiği
anlaşılmıştır. E. coli’nin NaN3 ve NaOH’e yanıtı ampisiline yanıtı ile karşılaştırıldığında
39 kDa, 42 kDa, 50 kDa ve 90 kDa stres yanıtlarının ortak gen ifadeleriyle olduğu, ancak diğer stres proteinlerinin ajana bağlı farklı ifade edildiği de görülmektedir. Şöyle ki, 27 ve 78 kDa yanıtı ampisiline özgü; 35 kDa ve 56 kDa yanıtı NaOH ile ortak; 16 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 48 kDa, 60 kDa ve 107 kDa NaN3 ile ortak gen yanıtları vermiştir. Tüm veriler
Tablo 18’de (Ek-9) verilmiştir. E. coli denemeleri ön deneme maksatlı ve çalışmanın esas kapsamı dışında yapıldığından doğrulanmamıştır. Bu nedenle sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır.
43
Tablo 12. Standart suşla 5’nci ve 6’ncı deneyde değişik antibiyotik konsantrasyonu ve değişik maruziyet süreleriyle yapılan stres yanıtı optimizasyon sonuçları
Bant Ağırlığı (kDa) Stres miktar ve süresi Stres 107 90 78 60 56 50 48 42 39 35 30 27 26 23 20 16 Amp Az4 Az2 Az1 1,5 x MIC 5 dk Cip Az4 Az4 Az1 Amp Az2 Ar3 1,5 x MIC 2 sa Cip Az4 Az1 Az3 Stres yok 7 sa
Kont flu + + flu + + + + + flu + + + + + Amp Az4 Az1 Az2 Az2
1,5 x MIC
7 sa Cip Az3 Az1 Az3 Az3
Stres yok 24 sa
Kont + + flu + + + + + flu + + + + + +
Amp 1,5 x MIC 24 sa Cip Az2 Az2 Az3 Ar2 Amp Az1 MIC 24 sa Cip Ar2 Az2 Az2 Ar2 Ar2 Ar2
Kont: Kontrol; Amp: Ampisilin; Cip: Siprofloksasin; kDa: kilo Dalton; Arx/Azx: Bant ifadesindeki sırasıyla
artış/azalış, üzerindeki rakamlar artış veya azalmanın kaç kat yoğunlukta olduğunu göstermektedir; flu: Belirgin olmayan diffüze olmuş bandı; MIC: Minimum inhibitör konsantrasyonu
En yukarıdaki başlık satırından sonra tablo iki panel halinde kalın çizgilerle birbirinden ayrılarak sunulmaktadır. En sol sütünda üst panel altı satır halinde 5’nci deneyle ilgili stres miktar ve süresini; alt panel tek satır halinde 6’ncı deneyle ilgili ‘’stres miktar ve süresi’’ni vermektedir. Satırlarda iki alt satır halinde üstte antibiyotik konsantrasyonu ve altta maruziyet süresi belirtilmiştir. İkinci sütünda ‘’stres’’ başlığı altında her bir deneyde kullanılan kontrol tüpler ve stres uygulanan tüpler belirtilmiştir. Dikkat edilirse sol sütündaki her bir stres koşulu satırı karşılığında ikinci sütunda iki farklı antibiyotik satırı yer almaktadır. ‘’Bant ağırlığı’’ başlığı altında saptanan bant ağırlıkları dizilmiştir. Üst panelde yer alan iki kontrol satırında hangi bandın ne şiddette göründüğü pozitif veya Flu ifadesiyle belirtilmiştir. Diğer stres koşulu satırlarındaki kutucuklarda, kontrole göre artma veya azalma saptanan bantlar belirtilmiş aynı seviyede ifade eden bantların kutucukları boş bırakılmıştır. İlgili elektroforez deneylerinin toplu bant dökümü Ek-9’daki Tablo 17’de verilmiştir.
Yukarıda açıklanan ve Tablo 12’de sunulan bantlar buradaki iki farklı konsantrasyondaki ortak ve benzeşmeyen gen ifadeleri açısından analiz edilmiş ve sonuçlar aşağıda verilmiştir:
1,5 x MIC konsantrasyonuna maruziyette,
(1) her iki antibiyotik için 78 kDa, 50 kDa, 48 kDa, 42 kDa, 39 kDa ve 35 kDa bant ifadesinin farklı stres sürelerinde ortak yönde azaldığı,
(2) siprofloksasin için 78 kDa, 50 kDa, 48 kDa ve 39 kDa bant ifadesinin farklı stres sürelerinde azaldığı, ancak, 42 kDa bant ifadesinin 24 saatte arttığı,
(3) ampisilin için 90 kDa ve 42 kDa bant ifadesinin 2 ve 7 saatte azaldığı, MIC konsantrasyonuna maruziyette,
44
(4) her iki antibiyotik için yukarıda açıklanan bant ifadesinin 24 saatte ortak yönde davranış göstermediği,
MIC ve 1,5 X MIC konsantrasyonuna 24 saat maruziyetler çapraz değerlendirildiğinde,
(5) her iki antibiyotik için yukarıda açıklanan bant ifadesinin ortak yönde davranış göstermediği,
(6) siprofloksasin için 50 kDa ve 48 kDa bant ifadesinin azaldığı, 78 kDa bant ifadesinin 1,5 X MIC maruziyette azaldığı, ancak, MIC maruziyette arttığı, 39 kDa ve 35 kDa bant ifadesinin 1,5 X MIC maruziyette değişmediği, ancak, MIC maruziyette arttığı tespit edilmiştir.
Tablo 12’deki sonuçlar ve yukarıdaki çapraz analizler göstermektedir ki antibiyotik stresine maruz kalan standart Salmonella bakterisi 2 saat içinde bir stres yanıtı geliştirmekte, bu yanıt 2-7 saatler arasında değişim göstererek yeni karakteriyle 24 saate kadar devam etmektedir. Tüm süreçte bakterilerin farklı antibiyotiğe ortak genler ve/veya farklı genlerle yanıt verdiği görülmüştür. Optimizasyon çalışmasının tüm verileri ortak değerlendirildiğinde, test edilen antibiyotikler için Salmonella bakterisinde tüm saptanabilir stres yanıtının MIC konsantrasyonuna 5 saat maruziyetle elde edilebildiği anlaşılmıştır. Yukarıdaki tablolarda ve anlatımda sunulan verilerin ham dökümü Ek-9’da verilmiştir.
ANTİBİYOTİK STRESİNE BAKTERİNİN VERDİĞİ YANITIN