Çalışmada standart suş dışında 3 adet azalmış siprofloksasin duyarlı, 2 adet ampisilin dirençli ve 3 adet her iki antibiyotiğe de duyarlı, toplam 9 farklı Salmonella enteritidis suşu ayrı ayrı ampisilin ve siproflosasin streslerine maruz bırakılmıştır. Bir bakterinin ayrı ayrı her iki strese de yanıt olarak ifade ettiği dış membran proteinlerini belirlemede, aynı bakterinin normal koşullarda ifade ettiği membran proteinleri bilgisi kullanılmış ve normalden sapmalar aşağıda açıklanmıştır. Sonuçlar Tablo 13’de toplu halde sunulmuştur.
Azalmış siprofloksasine duyarlı 1’nci hasta suşunda her iki antibiyotiğe karşı 35 kDa bantta hafif azalma, 18 kDa bantta kaybolma, 50 kDa bantta sadece siprofloksasinde hafif artış saptandı. Azalmış siprofloksasin duyarlı 2’nci hasta suşunda antibiyotik etkisiyle her iki antibiyotikte 78 kDa bant kayboldu, 20 kDa, 23 kDa ve 77 kDa bant oluştu; siprofloksasinde daha belirgin olmak üzere 50 kDa bantta artış gözlendi. Siprofloksasine yanıt olarak 18 kDa ve 73 kDa bantlar oluştu; 22 kDa bant kayboldu. Azalmış siprofloksasin duyarlı 3’ncü hasta suşunda her iki antibiyotik için 35 kDa ve 50 kDa bantta belirgin ve 90 kDa bantta hafif artış;
45
siprofloksasinde daha belirgin olmak üzere 78 kDa bantta artış; 34 kDa bantta kaybolma saptandı. Siprofloksasine yanıt olarak 107 kDa yeni bant oluştu; 22 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 36 kDa, 37 kDa ve 48 kDa bantlarda artış gözlendi. Ampisiline yanıt olarak; 20 ve 26 kDa bantlarda artış saptandı. 33 kDa yeni bant oluşumu ampisilinde zayıf, siprofloksasinde belirgin olarak izlendi.
Her iki antibiyotiğe duyarlı 4’ncü hasta suşunda, ampisilin için 16 kDa, 19 kDa ve 78 kDa bantta artış olurken, 34 ve 56 kDa bantta azalma, 32 kDa, 54 kDa ve 55 kDa bantlarda kaybolma, 31 kDa ve 37 kDa bant yeni oluşumu saptandı. Her iki antibiyotiğe duyarlı 5’nci hasta suşunda, siprofloksasin için 32 kDa ve 15 kDa bantta artma, 16 kDa bantta azalma olduğu, ampisilinde ise 17 kDa ve 16 kDa bant ifadesinin arttığı tespit edildi. Her iki antibiyotiğe duyarlı 6’ncı hasta suşunda, her iki antibiyotik için 26 kDa bantta hafif ve 90 kDa, 50 kDa, 35 kDa, 16 kDa, 15 kDa bantlarda belirgin artış, 78 kDa, 37 kDa ve 36 kDa yeni bant oluşumu gözlendi. Siprofloksasin için ayrıca 56 kDa bantta artma olduğu, 23 kDa ve 19 kDa yeni bantların oluştuğu görüldü. Her iki antibiyotiğe duyarlı standart suşda ampisilin için 87 kDa, 85 kDa, 68 kDa, 65 kDa ve 24 kDa yeni bantların oluşumu, 40 kDa, 32 kDa ve 18 kDa bantlarda kaybolma, 15 kDa, 35 kDa ve 36 kDa bantlarda artış, 50 kDa bantda azalma saptandı. Siprofloksasin için 22 kDa, 35 kDa, 36 kDa ve 50 kDa bantlarda artış izlendi. 30 kDa bant her iki antibiyotik etkisiyle hafiflemiş ve aşağı kaymıştır.
Ampisilin dirençli 7’nci hasta suşunda, ampisilin için 107 kDa ve 25 kDa yeni bantlar oluşurken, 90 kDa, 56 kDa, 18 kDa ve 15 kDa bandların azaldığı, 78 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 36 kDa ve 16 kDa bantların artığı tespit edildi. Siprofloksasin için, 50 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 18 kDa ve 15 kDa bantların arttığı görüldü. Ampisilin dirençli 8’nci hasta suşunda, ampisilin için 78 kDa yeni bant oluşurken, 16 kDa bandın azaldığı tespit edildi. Siprofloksasin için 34 kDa, 33 kDa ve 32 kDa bantlar artarken, 90 kDa ve 15 kDa bantların azaldığı, 56 kDa ve 36 kDa bantların kaybolduğu gözlendi.
Çalışmada ayrıca 5 saatlik stres yanıtı ile 5 dk’lık stres yanıtı karşılaştırılmak istenmiş ve hasta suşları 5 dk için siprofloksasine ayrıca maruz bırakılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre 1’nci suş 30 ve 16 kDa, 4’ncü suş 37 kDa, 6’ncı suş 37 kDa ve 7’nci suş 52 kDa bantında artış gösterdi. 3’ncü suş 22 kDa, 36 kDa ve 47 kDa bantlarda güçlü ve 50 kDa bantda hafif artış, 52 kDa hafif azalış, 16 kDa ve 48 kDa bantlarda kaybolma gösterdi. Standart suş, 2’nci, 5’nci ve 8’nci suşta 5 dk’da yanıt izlenmedi. Örnek elektroforezin jel fotoğrafı Şekil 12’de verilmiştir.
46 M K 1 2
M: Elektroforez markırı; K: Kontrol; kDa: kilo Dalton
Şekil 12. Bakterilerde stres oluşturulması deneyinde elde edilen elektroforez bantları. Standart suşun stres sonrası verdiği bantlar fotoğrafta görülmektedir. Kontrol yükleme kolonunda stres uygulanmamış, 1 ve 2 numaralı kolonlarda sırasıyla ampisilin ve siprofloksasine maruziyet uygulanmış bant sonuçları izlenmektedir. Görüldüğü gibi bakterilerin stres yanıtı farklı protein ifadeleriyle ortaya çıkmıştır.
Yukarıda açıklanan ve Tablo 13’de toplu sunulan elektroforetik sonuçlar ortak ve benzeşmeyen gen ifadeleri açısından karşılaştırmalı analiz edilmiştir. Bunun için bantlar başlıca dört grupta incelenmiştir. Birinci grup bantlar 77-90 kDa, ikincisi 48-56 kDa, üçüncüsü 30-37 kDa ve dördüncüsü 15-23 kDa bantlardır. Bu bant grupları artan veya yeni ortaya çıkan gen ürünleri birlikte değerlendirildiğinde; 9 suşdan 7’nde ampisilin için ve 3’nde siprofloksasin için 1’nci grup bantlarda; 9 suşdan 4’nde ampisilin ve 6’nda siprofloksasin için 2’nci grup bantlarda; 9 suşdan 5’nde ampisilin için ve 5’nde siprofloksasin için 3’ncü grup bantlarda; 9 suşdan 7’nde ampisilin için ve 5’nde siprofloksasin için 4’ncü grup bantlarda farklı ifade saptanmıştır. Bu sonuçlar her iki antibiyotikde ortak olma açısından değerlendirildiğinde, ilk üç grupta bantların yarısının ortak olduğu, ayrıca, hiçbir kombinasyona girmeyen 26 kDa bandın 9 suşdan 2’nse birlikte arttığı görülmektedir. Bant gruplarının azalan veya kaybolan gen ürünleri değerlendirildiğinde suşlarda ortaklık görülmemiş, birinci grup için üç suşta, ikinci grup için bir suşta, üçüncü grup için üç suşta ve dördüncü grup için beş suşta farklılık izlenmiştir. Bu sonuçlar göstermektedir ki Salmonella
enteritidis bakterilerinin tamamı çalışmada incelenen iki antibiyotikden en az birinin stresine
yanıt olarak ikinci ve üçüncü grupta yer alan gen ürünlerini ifade etmekte veya ifadesini arttırmaktadırlar. Birinci bant grubunda gen ifadesinin veya artışının görülmediği suşlar sadece 1’nci ve 5’nci hasta suşlarıdır. Dördüncü bant grubunda ise sadece 1’nci ve 8’nci hasta suşlarında ifade azalmış veya kaybolmuş, diğerlerinde artış veya yeni ifade gerçekleşmiştir.
85 kDa- 50 kDa- 30 kDa- 20 kDa-
47
Tablo 13. Dokuz farklı bakterinin strese yanıtıyla elde edilen elektroforetik bant sonuçları
Sd: Standart Salmonella suşu; S: Stres faktörü; Amp: Ampisilin; Cip: Siprofloksasin; -: Kontrolde olan bandın stres faktörüne bağlı olarak kaybolması; +: Stres faktörüne
bağlı olarak kontrolde olmayan bandın ortaya çıkması; Arx/Azx: Bant ifadesinde sırasıyla artış/azalış, üzerindeki rakamlar artış veya azalmanın kaç kat yoğunlukta
olduğunu; aşağı: Bandın stres etkisiyle bir alt konuma yer değiştirmesini göstermektedir. .
Bant Ağırlığı (kDa)
Süre Suş S 107 90 87 85 78 77 73 68 65 56 55 54 52 50 48 47 40 37 36 35 34 33 32 31 30 26 25 24 23 22 20 19 18 17 16 15 5 dk 1. suş Cip Ar Ar Amp Az - 5 sa 1. suş Cip Ar Az - 5 dk 2. suş Cip Amp - + Ar1 + + 5 sa 2. suş Cip - + + Ar2 + - + + 5 dk 3. suş Cip Az Ar - Ar Ar Ar Az Amp Ar1 Ar1 Ar2 Ar1 Ar1 Ar1 Ar1 5 sa 3. suş Cip + Ar1 Ar2 Ar2 Ar1 Ar1 Ar1 Ar2 - + Ar1 Ar1 Ar1 Ar1 5 dk Sd Cip Amp + + + + Az1 Az1 - Ar1 Ar2 - aşağı + - Ar 5 sa Sd Cip Ar1 Ar2 Ar1 aşağı Ar1 5 dk 4. suş Cip Ar 5 sa 4. suş Amp Ar1 Az1 - - + Az1 - + Ar1 Ar1 5 dk 5. suş Cip Amp Ar1 Ar1 5 sa 5. suş Cip Ar1 Az1 Ar1 5 dk 6. suş Cip Ar Amp Ar1 + Ar2 + + Ar2 Ar1 Ar2 Ar2 5 sa 6. suş Cip Ar + Ar1 Ar2 + + Ar2 Ar1 + + Ar2 Ar2
48
Tablo 13 (Devam) Dokuz farklı bakterinin strese yanıtıyla elde edilen elektroforetik bant sonuçları
Sd: Standart Salmonella suşu; S: Stres faktörü; Amp: Ampisilin; Cip: Siprofloksasin; -: Kontrolde olan bandın stres faktörüne bağlı olarak kaybolması; +: Stres faktörüne bağlı olarak kontrolde olmayan bandın ortaya çıkması; Arx/Azx: Bant ifadesinde sırasıyla artış/azalış, üzerindeki rakamlar artış veya azalmanın kaç kat yoğunlukta olduğunu; aşağı: Bandın stres etkisiyle bir alt konuma yer değiştirmesi göstermektedir.
En sol sütünda 18 satır halinde deneyde kullanılan suşların herbiri için stres süresi ve altında suş adı verilmiştir. Gri ile aydınlatılmış suşlar azalmış siprofloksasin duyarlı, yeşille aydınlatılmış olanlar her iki antibiyotiğe duyarlı ve pembe ile aydınlatılmış olanlar ampisilin dirençli suşlardır. İkinci sütünda ‘’stres’’ başlığı altında her bir deneyde kullanılan antibiyotik belirtilmiştir. Sol sütündaki her bir suş için ikinci sütunda iki farklı antibiyotik satırı yer almaktadır. Bant ağırlığı başlığı altında saptanan bant ağırlıkları dizilmiştir. Bu tabloda stres uygulanan hücrelerin sonuçları, normal koşullarda elde edilen sonuçlara bağıl olarak verilmiştir. Buna göre kutucuklarda, bir stres sonucu ifadesi normalle karşılaştırıldığında yeni ortaya çıkan, kaybolan, artan veya azalan bant sonuçları belirtilmiş, normalle aynı bulunduğunda kutucuk boş bırakılmıştır. Dikkat edilirse 4’ncü suşun 5 saat için sadece ampisiline stres yanıtı ölçülmüştür. Verilerin ham dökümü Ek-9’daki Tablo 17’de verilmiştir.
Bant Ağırlığı (kDa)
Süre Suş S 107 90 87 85 78 77 73 68 65 56 55 54 52 50 48 47 40 37 36 35 34 33 32 31 30 26 25 24 23 22 20 19 18 17 16 15 5 dk 7. suş Cip Ar Amp + Az1 Ar1 Az1 Ar1 Ar1 Ar1 + Az1 Ar1 Az1 5 sa 7. suş Cip Ar1 5 dk 8. suş Cip Amp + Az 5 sa 8. suş Cip Az1 - - Ar Ar Ar Az
49
Her bir bant için iki antibiyotiğe ortak yanıt veren suşlar aranmıştır. Buna göre, 90 kDa ve 26 kDa bandların 3’ncü ve 6’ncı suşlarda, 78 kDa bandın 3’ncü suşda, 50 kDa bandın 2’nci, 3’ncü, 6’ncı ve 7’nci suşlarda, 36 kDa ve 35 kDa bandların standart suş, 3’ncü ve 6’ncı suşlarda, 16 ve 15 kDa bandların 6’ncı suşda arttığı, 35 kDa bandın 1’nci suşda azaldığı saptandı. Ayrıca, 78 kDa bandın 2’nci suşda, 34 kDa bandın 3’ncü suşda, 18 kDa bandın 1’nci suşda kaybolduğu, 78 kDa bandın 6’ncı suşda, 77 kDa bandın 2’nci suşda, 37 ve 36 kDa bantların 6’ncı suşda, 23 kDa ve 20 kDa bantların 2’nci hasta suşunda ortaya çıktığı saptandı.
Her bir antibiyotik için, hangi bantların hangi suşlarda ortak ifade edildiği aranmıştır. Ampisilin için, 78 kDa bandın 4 ve 7 nolu suşlarda, 16 kDa bandın 4, 5, 6 ve 7 nolu suşlarda arttığı, 56 kDa bandın 4 ve 7 nolu suşlarda azaldığı; siprofloksasin için, 32 kDa bandın 5 ve 8 nolu suşlarda, 15 kDa bandın standart suşda, 5 ve 7 nolu suşlarda arttığı, 23 kDa bandın 2 ve 6 nolu suşlarda ortaya çıktığı tespit edildi.
Yukarıdaki veriler test edilen suşların öne çıkan karakterleri açısından incelenmiştir. Buna göre, 47 kDa bant hem azalmış siprofloksasin duyarlı şuşlar hem de 8’nci hasta suşunda belirgin olmak üzere tüm suşlarda her iki antibiyotik ve kontrol ortamında mevcuttur, ancak, 7’nci hasta suşunda siprofloksasin sonrası kaybolmaktadır. 18 kDa bant 1, 2 ve 5 nolu hasta suşlarında belirgin ifade edilirken ampisilin dirençli suşlarda ifade edilmemiştir. Standart suşla karşılaştırmalı Trakya suşlarının özgül ifadesi normal koşullarda incelendiğinde altı adet protein bandı ifadesinin özgül biçimde yapıldığı görüldü; (1) 39 kDa ve 60 kDa bantların Trakya suşlarında bulunmadığı; (2) 30 kDa bandın Trakya suşlarında ifade edilirken standart suşta geçici dönemlerde ifade edildiği; (3) 56 kDa bandın Trakya suşlarında belirgin varolduğu; (4) 14 kDa ve 37 kDa bantların Trakya suşlarında zayıf ve 35 kDa bandın kuvvetli ifade edildiği görülmektedir. Bantların ham dökümü Tablo 17’de (Ek-9) verilmiştir.
ELEKTROFORETİK BANTLARIN BİYOİNFORMATİK PROTEOM
ANALİZİ
Farklı S. enteritidis suşlarının strese yanıtıyla elde edilen elektroforetik bantların karşı geldiği muhtemel gen ürün bilgileri veri bankalarından toplandı. Tablo 14’da görüldüğü gibi ifadesiyle ilgilendiğimiz banttan her birine karşılık 7 adete kadar varan toplam 43 adet muhtemel protein saptandı. Bir önceki bölümde açıklanan dört bant gruplamasına sadık kalırsak birinci grup 77-90 kDa bant proteinleri, membran yapısında, transportunda ve adezyon eğiliminde rol alan dört farklı proteindir (fimbriyal protein, PefC, SefC ve foxA ürünü). İkinci grup 48-56 kDa bant proteinleri, çoklu ilaç direncinde, membran
50
biyogenezinde, metabolizmada, asit stresine yanıtda, sekresyonda, porin olarak, iç ve dış membranların birleştirilmesinde rol alan 10 farklı proteindir (MdtQ, dacB ürünü, ybjT epimerazı, DacB ürünü, ClcA, OprD, LamB porin, TolB ve salgılanan TolC). Üçüncü grup 30-37 kDa bant proteinleri, membran transportunda, membran ve polisakkarit biyogenezinde, metabolizmada, konjugasyonda, sigma E ifadesinde ve dış membran aracılı virülansda rol alan 17 farklı proteindir (OmpA, fosfoporin protein E, rfaQ ürünü, rfbE ürünü, oksidoredüktaz, şeker izomerazı, arnC ürünü, rseB ürünü, rfaC ürünü, nükleozit şeker izomerazı, yabC ürünü, OmpT, dihidrodipikolinat sentetaz, ArnD, yeeZ ürünü ve mepA). Dördüncü grup 15-23 kDa bant proteinleri, membran opasitesinde, lipoprotein yapımında, metabolizmada, periplazmik şaperon üretiminde, adezyon ve invazyon eğiliminde rol alan 7 farklı proteindir (OapA, OmpA_C-like, OMP_b-brl, OmpH, invH ürünü ve rscF ürünü). Bu gruplarda yer alan 38 protein dışında 26 kDa karşılığında üç adet tamir ve virülanstan (yhjY ürünü, adezin protein ve wecG ürünü), 73 kDa karşılığında iki adet membran transportu ve direnç sağlamaktan sorumlu muhtemel protein (ArnA ve cirA ürünü) saptanmıştır.
Yukarıda bahsedilen dört grup proteinin incelenen suşlarda antibiyotik stresi karşısında arttığı ve çoğunun her iki antibiyotiğe karşı saptandığından daha önce bahsedilmişti. Strese yanıt olarak gelişen proteinler işlev açısından incelendiğinde bunların virülans, membran transportu, tamir, direnç, metabolizma ve stres düzenleyici kategorilerinden birinde yer aldığı görüldü (Tablo 14). Kategorilerdeki protein adetleri karşılaştırıldığında %17’sinin asit ve antibiyotiğe dirençte, %1’inin stres proteini üretiminde, %8’inin virülans düzenleme ve adezyona eğilimde, %15’inin membran transport ve sekresyonunda, %44’ünün membran tamirinde ve %15’inin metabolik faliyette rol aldığı anlaşıldı.
İncelenen suşların antibiyotiğe maruziyet sonrası antibiyotiğe direnç, aside direnç ve stres genleri ifade etmesinden antibiyotik karşısında stres moduna girdiği anlaşılmaktadır. Bakterilerde eş zamanlı virülans, konjugasyon eğilimi ve adezyon genlerinin ifade etmesi destekleyici bulgudur. Bunun dışında bakterinin antibiyotiğe karşı membran transportu sağlayan, membran tamiri yapan ve metabolik aktiviteyi yürüten genleri ifade etmesi, bakterinin aynı zamanda zehirlenmeye karşı fiilen savunmaya geçtiğini göstermektedir. İfade edilen genlerin yüzdesi göz önünde bulundurulduğunda S. enteritidis bakterilerinin uygulanan stres koşullarında değişen ifadelerde çoğunlukla membran transportu ve tamiri ile ilgili genlerini ifade etmeye çalıştığı anlaşılmaktadır.
51
Tablo 14. Strese yanıt bantlarının biyoinformatik analiz sonuçları
kDa a.a Gen Protein Erişim no Bilgi ve Fonksiyon
15 134 rscF YP_002242413 Dış membran lipoprotein
16 147 invH YP_002244813 Hücre yapışma ve invazyon
18 161 hlpA OmpH CAR31820 Periplazmik şaperon, dış membran proteini 20 178 OMP_b-brl CAR34453 Dış membran proteini
207 lolB CAR32839 Dış membran lipoproteini, şaperon, membranda lipoprotein oluşumunda ve protein naklinde rol oynar. 209 yiaD OmpA_C-like YP_002245533 Dış membran lipoproteini
23
211 ytfB OapA YP_002246192 Hücre zarf opasitesiyle ilişkili protein 234 yhjY YP_002245529 Beta-barrelli dış membran proteini 239 YP_002242442 Dış membran adesin protein 26
246 wecG UDP-N-asetil-D- mannozaminüronik asit transferaz
B5QVI6 Enterobakteriyel ortak antijen (ECA) sentezinde yer alan
lipoprotein
274 mepA Penisiline duyarsız mürein endopeptidaz öncüsü
YP_002244452 Hücre zarf biogenezinde yer alır. 30
274 yeeZ YP_002244156 Hücre zarf biyogenezisi ve dış membran karbonhidrat naklinde ve metabolizmasında yer alır.
299 arnD ArnD B5R273 Arabinoz fosfo andekaprenolun deformilasyonunu yapar, arabinozun polimiksin ve katyonik antimikrobiyal peptidlere karşı direncini sağlamak için lipid A’ya arabinozu bağlar.
33
301 Dış membran dihidrodipikolinat sentetaz,
YP_002245422 Amino asit transport metabolizmasında ve hücre zarf
biyogenezisinde rol alır. 312 pgtE OmpT; IcsP; SopA;
Pla; PgtE
YP_002244465 Dış membran proteazı virülans faktörü, antimikrobiyal
peptitleri ve IcsA ototransportörünü tahrip eder 313 yabC S-adenozilmethionin
bağlı metiltransferaz
CAR31710 Hücre zarf biyogenezisinde rol alır. 316 Nükleozid difosfat
şeker izomerazı,
YP_002244825 Hücre zarf biyogenezi, karbonhidrat transferi ve
metabolizmasında rol alır. 317 rfaC LPS heptosyl
transferase-1
YP_002245600 Lipopolisakkarit sentezi, heptoz transferi yapar. 318 rseB Periplasmic negative
regulator of sigmaE
YP_002244643 Stres faktörü sigma E’nin sinyal düzenleyicisi
319 YP_002243814 İşlevi bilinmeyen protein 35
327 arnC Arabinoz transferaz B5R271 Arabinozun metabolizmasında rol alır. Böylece modifiye olmuş arabinoz LipidA’ya bağlanır ve polimiksin ve katyonik antimikrobiyal peptidlere karşı direnç sağlar. 336 Şeker izomerazı YP_002246320 Hücre zarf biyogenezisi
337 Oxidoreductaz YP_002242978 Hücre zarf biyogenezi, dış membranda karbonhidrat transportu ve metabolizmasında rol alır.
37
338 rfbE CDP-tyvelose-2- epimerase
YP_002244175 Hücre zarf biyogenezisinde rol alır. 344 rfaQ Lipopolysaccharide core
biosynthesis protein
YP_002245611 Lipopolisakkarit heptosiltransferaz, LPS’nin sentezinde
rol alır. 350 phoE Outer membrane
phosphoporin protein E
YP_002242456 Dış membranda küçük hidrofolik moleküllerin su içinde
transferi için 38 350 ompA outer membrane
protein A
YP_002243066 Dış membranda gerekli olmayan küçük moleküllerin hücre içine girmesini engelleyen ve peptidoglikana bağlanma özelliği olan protein, F-faktör ile
konjügasyonda rol alır, faj reseptörüdür, dış membran
mimari yapısının korunması rol alır 430 tolB translocation protein
TolB
YP_002242843 TolB translokasyon proteini olup dimer oluşumunda,
hücre zarının bütünlüğünün korunmasında ve içteki TolA membran proteinine dış membranın bağlanmasında rol alır.
48
439 TolC YP_002246063 Bu salgılanan protein dış membran protein sentezi, içten dışa trafiği ve sentezinde rol alır.
50
452 lamB LamB porin, maltoporin Maltose-inducible porin
YP_002246036 Maltoporin-benzeri kanal, enterobakterilerde maltodekstrin ve diğer şekerleri dış membrana yerleştirilmesine rol alır
52
Tablo 14 (Devam) Strese yanıt bantlarının biyoinformatik analiz sonuçları
kDa a.a Gen Protein Erişin no Bilgi ve Fonksiyon
468 ybfM OprD YP_002242796 Dış membran porini
469 YP_002244688 Tip 1 sekresyon dış membran proteini 473 clcA H(+)/Cl(-) exchange
transporter ClcA
B5R3G7 İki klorur iyonunu bir protonla değiştirerek amino asit dekarboksilasyonu üzerinden bakteride aşırı aside karşı
direnç sağlayan antiport sistem proteinidir. 477 dacB D-alanyl-D-alanine
carboxypeptidase
YP_002245199 Penisilin bağlayan protein olup hücre duvar sentezi 477 ybjT Nükleosid difosfat
şeker epimerazı
YP_002242979 Hücre zarf biyogenezi, karbaonhhidrat transportu ve
metabolizmasında rol alır. 477 dacB D-alanyl-D-alanine
carboxypeptidase
CAR34709 Penisilin bağlayan protein, hücre zarf biogenezi
52
478 yohG MdtQ CAR33751 Bu lipoprotein çoklu ilaç direncinde, puromisin, akriflavin ve tetrafenilarsoniuma karşı dirençte rol alır.
660 arnA ArnA B5R272 Dekarboksilasyon ve formilasyonla arabinoz üretilmesi ve lipid A’ya eklenmesi, böylece polimiksin
ve katyonik antimikrobiyal peptidlere direnç sağlanması 73
663 cirA Colicin I receptor; Cir; FeuA; CirA
YP_002244284 Siderofor ve mikrosin reseptörü, 1-3 üç formda dihidroksibenzoserin transportunda rol alır. 77 702 foxA Ferrioxamine B
receptor precursor
YP_002242497 TonB bağımlı ligand kapılı kanal, periplazmik taraftaki
beta-barrel yapısıyla periplazmayı dış membrana bağlar. 814 YP_002246269 Fimbrial protein
814 sefC SefC P33388 Membranda hücre içine ve dışına nakliyat sağlar 90
817 pefC PefC CCF82191 Adesin maksatlı fimbriya oluşması, membrandan protein
transportu, Tip VII sekresyon sisteminde rol alır.
kDa: protein moleküler ağırlık ünitesi kilo Dalton; a.a: proteinin amino asit uzunluğu.
Birinci sütünda stres yanıt proteinin moleküler ağırlığı, ikinci sütünda bu moleküler ağırlığa karşılık gelen ve biyoinformatik analizde bulunan proteinlerin amino asit uzunluğu, üçüncü sütünda muhtemel genler, dördüncü sütünda protein isimleri, beşinci ve altıncı sütünda bu proteinlerin GenBank erişim numaraları ve işlevleri verilmiştir. Tabloda, mavi ile aydınlatılmış alandaki genler 4’ncü grup bantlara, pembe ile aydınlatılmışlar 3’ncü grup bantlara, yeşille aydınlatılmış alandaki genler 2’nci grup bantlara ve sarı ile aydınlatılanlar 1’nci grup bantlarla ilişkilidir. Son sütünda 5 adet virülansla (%8) kırmızı, 8 adet membran transportuyla ilgili işlevi yapan protein (%15) koyu mavi, 24 adet membran tamiriyle (%44) mor, 9 adet dirençle (%17) koyu yeşil, 8 adet metabolizmayla (%15) kahverengi ve 1 adet stres düzenlemeyle (%1) pembe vurgulu protein işlevi gösterilmiştir.
Aynı stres altındaki farklı bakterilerin bu genleri kullanmada ne derece benzeştikleri protein düzeyinde analiz edilmiştir. Dokuz suş arasında azalmış siprofloksasin duyarlı 1’nci suş, ampisilin dirençli 8’nci suş ve her iki antibiyotiğe duyarlı 5’nci suşun diğerlerine göre strese karşı büyük yanıtsızlık gösterdiği saptanmıştır. 1’nci suşun stresler karşısında OmpH ve 35 kDa membran tamir enzimleri gibi membran biyogenez ve diğer işlevlere ait proteinlerin ifadesini azalttığı; siprofloksasin karşısında sadece membran transport LamB porini ifade ettiği saptanmıştır. 8’nci suşun ampisilin karşısında sadece foxA ürünüyle membran yapısını savunduğu, siprofloksasin karşısında ise üçüncü grup stres protein ağırlıklı ve keza diğer işlevli gen ürünlerini ifade ettiği saptanmıştır. 5’nci suşun siprofloksasin karşısında sadece stres proteini ve rscF ürünü gibi tamir proteini ifade ettiği; ampisilin karşısında ise sadece invH ürünüyle savunma moduna geçtiği saptanmıştır. Dokuz suştan diğer 6 suşun stres karşısında oldukça benzer profilde gen ifadesi yaptığı görülmektedir.
53
Ampisilin ve siprofloksasine yanıtta ayırıcı gen ifadesi aranmıştır. 9 suştan 7’sinde siprofloksasine yanıt olarak 50 kDa ağırlığındaki LamB porin ifadesinin seçici arttığı saptanmıştır. Bazı suşların LamB porin ifadesini ampisiline karşı da yaptığı görülmektedir. 9 suştan 6’sında ampisiline seçici yanıt olarak 77-78 kDa ağırlığındaki membran transportu ve