ELECTROPHORETYPING OF STRESS RESPONSE GENE EXPRESSION IN SALMONELLA
5 X alt tampon
(Borat Tamponlu elektroforez için)
1000 ml hazırlamak için:
2,122 M Tris-base 800 ml distile su içinde çözüldü, pH: 9,18 ayarlandı ve distile su ile hacim 1000 ml tamamlandı.
%33 akrilamid çözeltisi
(Borat Tamponlu elektroforez için)
100 ml hazırlamak için:
33 gr akrilamid 80 ml distile suda iyice çözülmesi sağlandı, daha sonra distile suyla hacim 100 ml tamamlandı. Şişe alüminyum folyo ile kaplanarak ışıktan muhafaza edildi.
%1 bisakrilamid çözeltisi
(Borat Tamponlu elektroforez için)
100 ml hazırlamak için:
1 gr bisakrilamid 80 ml distile suda iyice çözülmesi sağlandı, daha sonra distile suyla hacim 100 ml tamamlandı. Şişe alüminyum folyo ile kaplanarak ışıktan muhafaza edildi.
%5 amonyumpersülfat
(Borat Tamponlu elektroforez için)
20 ml hazırlamak için:
1 gr amonyumpersülfat 15 ml distile suda suda iyice çözülmesi sağlandı, daha sonra distile suyla hacim 20 ml tamamlandı. 500 µl hacimlerde ependorf tüplere aktarıldı ve kullanılıncaya kadar -20°C’de saklandı.
Örnek tamponu (bağ kıran)
(Borat Tamponlu elektroforez için)
40 ml hazırlamak için:
4 ml 10X üst tampon, 2 gr sakaroz, 74 mg disodyum-EDTA.2H2O, 8 ml
distile su, 2 ml beta-merkaptoetanol iyice karıştırıldı. Üzerine 0,76 gr SDS eklendi ve çözdüldü. pH: 8,64 ayarlandı ve distile suyla hacim 40 ml tamamlandı. Hazırlanan protein örnekleri, örnek tamponu ile yarıyarıya olacak şekilde karıştırıldı ve 5 dk kaynar suda tutularak proteinlerin denatüre olması sağlandı.
Takip boyası
10 ml hazırlamak için:
0,05 gr bromfenol mavisi, 6,5 ml distile su içine eklendi ve gliserinle toplam hacim 10 ml tamamlandı. Çukurlara yüklecek protein miktarı 5- 10 µg olacak şekilde takip boyasıyla denatüre edilmiş protein örneği karıştırıldı.
Yumuşak jel tamponu
(Borat Tamponlu elektroforez için)
40 ml hazırlamak için:
2,62 gr Tris-asit, 30 ml distile suda çözüldü, pH: 6,1 ayarlandı ve hacim distile suyla 40 ml’ye tamamlandı.
%11 alt jel
(Borat Tamponlu elektroforez için)
30,113 ml hazırlamak için:
10 ml akrilamid çözeltisi, 3,3 ml bisakrilamid çözeltisi, 6,7 ml 5x alt tampon ve 9,3 ml distile su bir kapta iyice karıştırıldı. Daha sonra 0,66 ml %5 amonyumpersülfat ve 15,3 µl TEMED eklenerek karıştırıldıktan sonra 30 sn içinde sabitlenmiş cam çerçeveler arasına aktarıldı.
%4 üst jel
(Borat Tamponlu elektroforez için)
10 ml hazırlamak için:
1,25 ml akrilamid çözeltisi, 2,5 ml bisakrilamid çözeltisi, 1,25 ml yumuşak jel tamponu ve 4,8 ml distile su bir kapta iyice karıştırıldı. Daha sonra 0,2 ml %5 amonyumpersülfat ve 10 µl TEMED eklenerek karıştırıldıktan sonra 30 sn içinde polimerleşmiş alt jel üstüne aktarıldı ve hemen tarak yerleştirildi.
77 Kullanılan Tampon ve Jel Formülleri (Devam)
%30
akrilamid/bisakrilamid
(Tris Tamponlu elektroforez için)
100 ml hazırlamak için:
29,2 gr akrilamid ve 0,8 gr bisakrilamid, 70 ml distile su içerisinde iyice çözüldü, daha sonra distile suyla hacim 100 ml tamamlandı. Şişe alimünyum folyo ile kaplanarak ışıktan muhafaza edildi ve +4°C’de saklandı.
1,5 M Tris-HCl
(Tris Tamponlu elektroforez için)
100 ml hazırlamak için:
18,15 gr Tris-base 70 ml distile suda çözüldü, 6 N HCl ile Ph: 8,8 ayarlandı. Distile suyla hacim 100 ml tamamlandı ve +4°C’de saklandı.
0,5 M Tris-HCl
(Tris Tamponlu elektroforez için)
100 ml hazırlamak için:
6 gr Tris-base 60 ml distile suda çözüldü, 6 N HCl ile pH: 6,8 ayarlandı. Distile suyla hacim 100 ml tamamlandı ve +4°C’de saklandı.
%10 SDS
(Tris Tamponlu elektroforez için)
100 ml hazırlamak için:
10 gr SDS 60 ml distile suda çözüldü, distile suyla hacim 100 ml tamamlandı ve oda sıcaklığında saklandı.
%10 amonyumpersülfat
(Tris Tamponlu elektroforez için)
10 ml hazırlamak için:
1 gr amonyumpersülfat 7 ml distile suda suda iyice çözülmesi sağlandı, daha sonra distile suyla hacim 10 ml tamamlandı. 500 µl hacimlerde ependorf tüplere aktarıldı ve kullanılıncaya kadar
-20°C’de saklandı.
Örnek tamponu
(Tris Tamponlu elektroforez için)
8 ml hazırlamak için:
3 ml distile su, 1 ml pH: 6,8 olan 0,5 M Tris-HCl, 1,6 ml gliserol, 1,6 ml %10 SDS, 0,4 ml beta-merkaptoetanol ve 0,4 ml %0,5 bromfenol mavisinden karıştırıldı. 10 µl protein örneği 40 µl örnek tamponu ile karıştırılarak 100 °C’de 4 dk kaynatıldı.
5 X elektrod tamponu
(Tris Tamponlu elektroforez için)
1000 ml hazırlamak için:
15 gr Tris-base, 72 gr glisin ve 5 gr SDS 1000 ml distile su içinde iyice çözüldü. Stok tampon +4°C’de saklandı. Kullanılacağı zaman stok tampon, 1x ayarlandıktan sonra HCl ile pH:8,3 ayarlandı.
%12’lik ayırma jeli
(Tris Tamponlu elektroforez için)
25 ml hazırlamak için:
10 ml %30’luk akrilamid/bisakrilamid, 8,375 ml distile su, 6,25 ml 1,5 M Tris-HCl ve 0,25 ml %10 SDS bir kapta iyice karıştırıldı. Daha sonra 125 µl %10 amonyumpersülfat ve 12,5 µl TEMED eklenerek, jel hızlıca sabitlenmiş cam çerçevelerin içine aktarıldı.
%4’lük yükleme jeli
(Tris Tamponlu elektroforez için)
10 ml hazırlamak için:
1,3 ml akrilamid/bisakrilamid, 6,1 ml distile su, 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl ve 0,1 ml %10 SDS bir kapta iyice karıştırıldı. Daha sonra 50 µl %10 amonyumpersülfat ve 10 µl TEMED eklenerek, jel hızlıca polimerleşmiş ayırma jelinin üstüne aktarıldı.
Jel boyama solüsyonu 100 ml hazırlamak için:
25 ml metilalkol, 10 ml asetikasit ve 0,005 ml comassile blue 65 ml distile su içinde karıştırıldı.
Boya çıkarma sıvısı
300 ml hazırlamak için:
90 ml metil alkol (%30), 30 ml asetik asit (%10) ve 180 ml distile su (%60) karıştırıldı.
78
EK-4
Kullanılan Biyolojik Aktif Preparatlar ve Kimyasallar Boncuklu saklama besiyeri (Microbank, Kanada)
EMB agar (Salibrus, Türkiye)
%5 koyun kanlı agar (Salibrus, Türkiye)
Ampisilin Lot no: 005898.05, potensi: %94 (Duchefa Biochemie, Hollanda) Siprofloksasin Lot no: 94010863 potensi: %98 (Applichem, Almanya) BHIB (AnalaR NORMAPUR, Prolabo, İspanya)
MHB besiyeri (HiMedia, Hindistan)
Elektroforez Moleküler Ağırlık Markırı, BraodRange (ThermoScientific, ABD) Elektroforez Moleküler Ağırlık Markırı, Protein-Marker II (PreQLab, Almanya) BSA (Sigma, Almanya)
Proteaz inhibitör kokteyl (Thermo Scientific, ABD) Coomassie Plus Reagent (Thermo Scientific, ABD) Triton X-100 (Sigma, ABD)
NP-40 (Applichem, Almanya)
N-Lauryl sarkosine (Merck, Almanya)
Tris-base (AnalaR NORMAPUR, Prolabo, İspanya) Tris-asit ( Merck, Almanya)
Sodyumazid (CarloERBA, İtalya) SDS (Merck, Almanya)
Akrilamid (Merck, Almanya) Bisakrilamid (ABCR, Almanya) TEMED (Sigma, ABD)
Glisin (Merck, Almanya) Gliserin (Applichem, Almanya)
Amonyum persülfat (GPR RECTAPUR, Prolabo, İspanya) %37 HCl (Riedel-de Haen, Sigma Aldrich, Almanya)
Asetik asit (Smyras, Aromas Food&Chemical Industry, Türkiye) Metanol (Emsure, Merck, Almanya)
Aseton (Kimetsan, Türkiye)
Sodyum hidroksit (CarloERBA, İtalya)
Sodyum klorur (AnalaR NORMAPUR, Prolabo, İspanya) Di-sodyum hidrojen fosfat di hidrat (Emsure, Merck, Almanya) Sodyum dihidrojenfosfat (Emsure, Merck, Almanya)
79
EK-5
Kullanılan Cihazlar
Derin dondurucu (Nuair, Revco, ABD) Isıtmalı su banyosu (Nüve ST402, Türkiye) Sanrifüj NF800R (Nüve, Türkiye)
Buzdolabı (Bosch, Almanya)
Minifüj Mikro120 (Hettich, Almanya) Çalkalayıcı Mini Rocker (BioSan, Letonya) Vitek II cihazı (Biomerieux, Fransa)
pH metre 6173 (Jenco, Kanada)
Biyogüvenlik kabini (Esco Class II BSC, Singapur) Hassas terazi AEX-120 G ( Shimadzu, Japonya) Etüv EN500 (Nüve, Türkiye)
Otoklav OT 4060 (Nüve, Türkiye)
Manyetik karıştırıcı MSH-20A (WiseStir, Kore)
Optik yoğunluk ölçüm cihazı DensiCHEK (Biomerieux, Fransa) Mini jel (Bio-Rad, Almanya)
Elektroforez güç kaynağı (Bio-Rad, Almanya) Vorteks (Nüve, Türkiye)
Laboratuvar Malzemeleri
24 kuyucuklu plak (Sigma-Aldrich, Almanya)
80
EK-6
Tek Koloni Düşürme Tekniği
Steril özeyle alınan örnek, agar plağın bir kenarına zikzak hareketiyle çizgi halinde aynı ekim çizgisinden tekrar geçmeden ekim yapılır. Bu bölge ilk ekim alanıdır. Daha sonra öze yakılarak steril edilir. Soğutulduktan sonra birinci ekim alanının çizgilerine değdirilerek, birinci ekim alanına dik olarak ikinci ekim sahasına zikzaklar yapılarak ekim yapılır. Öze tekrar yakılarak sterillendikten sonra soğutulur ve ikinci ekim alanının kenarına değdirilerek bu alana dik olacak şekilde üçüncü alana ekim yapılır. Aynı işlem tekrarlanarak dördüncü alana ekim yapılır.
Biyoinformatik
İnsan genom projesi ve diğer canlıların sekanslama çalışmaları sayesinde büyük miktarda biyolojik veriler elde edildi. Bu verilerin analizi ve yorumlanması için oluşan büyük talepler gelişen biyoinformatik bilimi tarafından yönetilmektedir. Biyoinformatik, biyolojik bilgilerin toplanması ve yorumlanması için hesaplama ve analiz araçlarının kullanılması olarak tanımlanır.
Günümüzde bilginin depolanması için kullanılan ve etkili erişime olanak sağlayan en geçerli yol veri tabanları ve programlarıdır. Veri tabanı programları, toplanan bilgileri işleyebilen, istenen sonuçları kolaylıkla hazırlayabilen bir bilgisayar programıdır.Milyonlarca nükleotidin depolanması ve organizasyonu için veritabanlarının oluşturulması, araştırıcıların bu bilgilere ulaşabilmesi ve yeni veriler girebilmeleri için ilk aşamadır. Biyoinformatikte nükleotid dizi bilgilerinin organizasyonu ve depolanması görevini üstlenmiş üç büyük kuruluş vardır, GenBank (Gen Bankası; Maryland, ABD), EMBL (Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı; Hinxton, İngiltere) ve DDBJ (DNA Japonya Veritabanı; Mishima, Japonya).
Protein dizi verileri ile ilgili başlıca hizmet sağlayanlar ise GenBank, EMBL, PIR International (Protein Identification Resource) ve Swiss-Prot’tur.
Bu kuruluşlar araştırmacıların faydalanmasına açıktır ve nükleotid dizi bilgilerinin toplanması ve dağıtılmasında işbirliği içinde çalışmaktadır.
81
EK-7
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil 1. Bakteri hücresinde stres faktörünün algılanması ve yanıt şeması
Şekil 2. Sigma faktörünün (σS) çeşitli stres uyaranları tarafından farklı basamaklarda düzenlenmesi Şekil 3: Gram negatif bakteri hücre duvarı yapısı
Şekil 4. McFarland bulanıklık standardı ve denk gelen bakteri sayısı
Şekil 5. Tüpte makrodilüsyon yöntemiyle Minimum İnhibitör Konsantrasyonun saptanması Şekil 6. Eosine Methylen Blue agar plağa ekilmiş Salmonella enteritidis kolonileri
Şekil 7. 24 kuyucuklu plakta, dilüsyon yöntemiyle Minimum İnhibitör Konsantrasyonun tayini Şekil 8. Üremeyi %20, %50 ve %80 oranında engelleyen antibiyotik konsantrasyon grafiği: A-Ampisilin, B-Siprofloksasin
Şekil 9. Elektroforez sisteminde tampon denemesinin sonucu: A-Borat tamponlu jel, B-Tris tamponlu jel
Şekil 10. Dış membran proteini optimizasyon sonucu
Şekil 11. Saptanabilir stres yanıtı deney sonucu: A- 1/4000 Minimum İnhibitör Konsantrasyonu, B: Minimum İnhibitör Konsantrasyonun
Şekil 12. Stres deneyinde elektroforez jelinde bantlar