Stres
Deney, 5 x 105 CFU/ml yoğunlukta Salmonella bakterisinin 11-12 saat çoğaltılması ardından besiyerine antibiyotik eklenerek yapıldı. Deney setine, ayrıca, diğer tüplere yapılan tüm işlemlerin uygulanacağı, içinde bakteri ve/veya antibiyotik bulunmayan negatif kontroller eklendi. Bakterilerin 11-12 saat çoğaltılması sonunda tüplerdeki üreme miktarı ölçüldü ve bakteri çevirim grafiğinden bakteri sayısı bulundu. Tüpler santrifüj edildi. Steril çalışma tekniği ile üst sıvı döküldü ve tüpteki besiyeri yenilendi. Tüpler iyice vortekslenerek karıştırıldı. Tüpteki bakteri sayısı başına düşen ampisilin ve siprofloksasinin MIC için gereken miktarlar hesaplandı ve ilgili tüplere eklendi. Ampisilin dirençli klinik suşlarla yapılan deneylerde standart suşun MIC değerinin 10 katı konsantrasyonda antibiyotik uygulandı. Tüpler her iki antibiyotik için 37°C’lik inkübatörde 5 saat, ayrıca, siprofloksasin için 5 dk inkübe edildi. İnkübasyon sonunda tüplerdeki üreme kontrolü için bakteri yoğunlukları kaydedildi. Ayrıca, kontaminasyon kontrolu için 5 saat maruziyet tüplerinden inkübasyon sonrası kanlı agara ekim yapıldı. Tüpler bu işlemlerden sonra santrifüjlenerek işleme yukarıda anlatıldığı gibi devam edildi.
29 Optimizasyon
Yukarıdaki saptanabilir stres yanıtının oluşturulmasını sağlayan antibiyotik maruziyetinin bulunması için önce aşağıda açıklanan bir seri optimizasyon deneyi yapıldı. Çalışmalarda, değişik antibiyotik konsantrasyonları ve maruziyet süreleri denendi, farklı değişkenlerin saptanabilir stres yanıtının oluşumuna etkileri arandı. Aşağıda, Salmonella suşu ile yapılan altı optimizasyon çalışması verilmiş ve stres etkenleri/koşulları toplu halde Tablo 7’de sunulmuştur.
1- Stres, antibiyotik konsantrasyonu ve zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyeri içinde üremiş ve yoğunluğu 8 McFarland olan standart Salmonella bakteri tüplerinden 7 saat ve 24 saat stres uygulanacak olanları santrifüj edildi, üst sıvıları döküldü ve besiyeri tazelendi. Tüplere, kontrol tüpleri hariç, 5 x 105 CFU/ml bakteride üremeleri %20, %50 ve %80 oranında engelleyen konsantrasyonlarda ampisilin ve siprofloksasin, üreme sayılarına bakılmaksızın ayrı ayrı eklendi. 37˚C’ye ayarlanmış çalkalamalı benmaride yapılan inkübasyonda stres yanıtı 40 dk, 2 saat, 7 saat ve 24 saat sonra incelendi.
2- Antibiyotik konsantrasyonu ve zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyeri içinde üremiş ve yoğunluğu 8 McFarland olan ampisilin dirençli 8’nci hasta suşu ve siprofloksasine duyarlılığı azalmış 3’ncü hasta suşu tüplerinde santrifügasyon sonrası üst sıvıları döküldü ve besiyeri tazelendi. Tüplere, kontrol tüpleri hariç, her bir suşun kendi 5 x 105 CFU/ml miktarı için saptanan ve duyarlı olduğu MIC konsantrasyonunda antibiyotik, ayrıca, diğer tüplere bu antibiyotiğin standart suş için bulunmuş olan MIC konsantrasyonunda antibiyotik üreme sayılarına bakılmaksızın eklendi. Stres yanıtı 2 ve 24 saat sonra incelendi.
3- Stres değişkeninin incelemesi: 0,5 McFarland bulanıklığında 1-2 x 108 CFU/ml standart Salmonella bakterisi içeren üç ayrı sıvı besiyerine sırasıyla nihai 1 µg/ml ampisilin, nihai 0.0625 µg/ml siprofloksasin, %5’lik stok çamaşır suyu nihai 1/250 seyreltilerek ayrı ayrı eklendi ve stres yanıtı 12 saat sonra incelendi.
4- Antibiyotik konsantrasyonu ile zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyeri içinde üremiş ve yoğunluğu 8 McFarland olan standart Salmonella bakteri tüplerinden 7 saat ve 24 saat stres uygulanacak olanları santrifüj edildi, üst sıvıları döküldü ve
30
besiyeri tazelendi. Tüplere, kontrol tüpleri hariç, 5 x 105 CFU/ml bakteri için saptanan MIC konsantrasyonunda ve ayrıca, bunun 1,8 katı siprofloksasin bakterinin üreme sayılarına bakılmaksızın eklendi. Stres yanıtı 40 dk, 2 saat, 7 saat ve 24 saat sonra incelendi.
5- Stres ile zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyerinde üreyen ve yoğunluğu 8 McFarland olan bakteriler stres deneyinde anlatıldığı gibi, ancak, bakteri sayısı başına düşen MIC konsantrasyonunun 1,5 katı ampisilin ve siprofloksasine ayrı ayrı maruz bırakıldı. Bunun için, tüplerdeki sıvı besiyerinde çoğaltılan bakterilerin yoğunlukları ölçüldü, 7 saat ve 24 saat tüplerinde besiyeri tazelendi, hesaplanan ampisilin ve siprofloksasin miktarları, kontrol tüpler hariç diğer tüplere eklendi, ve ilgili bakteri tüpleri 5 dk, 2 saat, 7 saat ve 24 saat süreyle ayrı ayrı strese maruz bırakıldı. İnkübasyonlar bittiğinde kontaminasyon kontrolü için tüplerden kanlı agara pasaj yapıldı ve petriler 37°C’lik etüve kaldırıldı. Bu deneyde içinde bakteri veya antibiyotik bulunmayan iki adet kontrol tüp dışında sadece 7 ve 24 saatler için birer kontrol kullanıldı.
6- Stres ile zaman değişkenlerinin çapraz incelenmesi: Sıvı besiyerinde üreyen ve yoğunluğu 8 McFarland olan bakteriler stres deneyinde anlatıldığı gibi bakteri sayısı başına düşen ampisilin ve siprofloksasinin MIC konsantrasyonuna ayrı ayrı maruz bırakıldı. Stres yanıtı 24 saat, 3 gün, 6 gün ve 9 gün sonra incelendi. İlk iki gün 12 saat arayla, ikinci günden sonra ise 24 saat arayla üreme kontrolu için optik okuyucuda ölçüm yapıldı. Üreme miktarında artış olduğunda besiyeri tazelendi, olmadığında besiyeri 36 saat arayla değiştirildi. Planlanan stres süresi dolan tüplerden hem katı agar besiyerine hem de sıvı besiyerine bakterinin canlı olup olmadığını belirlemek amacıyla pasajlar yapıldı.
Kullanılan E. coli suşu ile ön deneme yapılarak farklı stres değişkenlerine yanıt incelendi. Bunun için tüplerdeki 25 ml bakteri süspansiyonları 37˚C’de 4 saat inkübe edildi ve üzerlerine ayrı ayrı nihai 2 µg/ml ampisilin, nihai 0,5 µg/ml siprofloksasin, 100 µl fenol, %30 stoktan 100 µl NaN3, %10 stoktan 300 µl H2O2, 1 N 100 µl NaOH, nihai %1 Triton X-100
31
Tablo 7. Optimizasyon çalışmalarında uygulanan stres koşulları
Deney No
Bakteri Bakteri yoğunluğu (CFU/ml)
Stres etkeni Stres süresi
1 Sd 20 x 108 1/5000-1/16000 MIC Ampisilin 1/5000-1/8000 MIC Siprofloksasin
40 dk, 2 sa, 7 sa, 24 sa
Suş 3 1/4000 MIC Siprofloksasin
1/16000 MIC Siprofloksasin 2 Suş 8 20 x 108 1/4000 MIC Ampisilin 1/4000000 MIC Ampisilin 2 sa, 24 sa 3 Sd 1-2 x 108 1/1000 MIC Ampisilin 1/1000 MIC Siprofloksasin %9,6X10-3 Hipoklorit 12 sa 4 Sd 20 x 108 1/2200 MIC Siprofloksasin 1/4000 MIC Siprofloksasin 40 dk, 2 sa, 7 sa, 24 sa 5 Sd 20 x 108 1,5 MIC Ampisilin 1,5 MIC Siprofloksasin 5 dk, 2 sa, 7 sa, 24 sa 6 Sd 20 x 108 1 MIC Ampisilin 1 MIC Siprofloksasin 24 sa, 3 g, 6 g, 9 g E. coli <20 x 108 1/4000 MIC Ampisilin 1/4000 MIC Siprofloksasin 1/281 Fenol (w/w) 1/833 NaN3 (w/w) 1/833 H2O2 (v/v) 4 mM NaOH %1 Triton X-100 10 sa
No: Deney numarası; CFU: Colony Forming Unit; Sd: Standart Salmonella suşu; dk: dakika; sa: saat; g: gün; Suş 3: Üçüncü hastadan izole edilen suş; Suş 8: Sekizinci hastadan izole edilen suş; E. coli: Escherichia coli; NaN3: Sodyum azid; H2O2: Hidrojenperoksit; NaOH: Sodyum hidroksit; MIC: Minimum inhibitör
konsantrasyon
En sol sütünda deney numarası, ikinci sütünda deneyde kullanılan suş, üçüncü sütünda stres faktörü uygulanan bakteri sayısı, dördüncü sütünda eklenen stres konsantrasyonu ve beşinci sütünda maruziyet süresi verilmiştir.
ELEKTROFORETİK BANTLARIN BİYOİNFORMATİK PROTEOM
ANALİZİ
Salmonella enteritidis genomunda ilgili amino asit uzunluktaki proteinleri kodlayan
genleri bulmak için önce GenBank’ta protein seçeneğine girildi. Buradaki arama motoruna ‘’Salmonella enteritidis’’ anahtar kelimeleri kullanılarak bakteri listesindeki Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str. P125109 seçeneğine girildi. Açılan sayfada bu
kökene ait protein listesine ulaşıldı. Sayfada yer alan uzaktan kumandalı motor kullanılarak ’’outer membrane protein and Salmonella Enteritidis’’ anahtar kelimeleri ile kökene ait 275 adet protein içeren listeye ve listede yer alan amino asit uzunluk değerlerine ulaşıldı. Listeden, istenilen uzunluğa denk veya yakın, dış membranda bulunan proteinler, keza, membran yapımında rol alan salgılanabilir proteinler seçilerek bir tahmini stres yanıt proteinleri listesi
32
oluşturuldu. Protein işlevi hakkında bilgi GenBank’tan gen ismi girilerek açılan sayfadan elde edildi (76). Biyoinformatik analiz hakkında açıklayıcı bilgi Ek-6’da verilmiştir.
33
BULGULAR
Çalışmanın bulguları şu başlıklarla sunulmuştur: Bakterilerin saflık kontrol sonuçları MIC sonuçları
o Standart suş için ara dilüsyonla hassas MIC sonuçları
o Üremeyi %20, %50 ve %80 oranında engelleyen antibiyotik konsantrasyon sonuçları
Elektroforez sisteminde tampon denemesinin sonucu Dış membran proteini izolasyon optimizasyonu
Saptanabilir stres yanıtı oluşturulmasının optimizasyonu
Antibiyotik stresine bakterinin verdiği yanıtın elektroforetik sonuçları Elektroforetik bantların biyoinformatik proteom analizi