Yapılan Yardımlar

Uma das vias analisadas que poderia estar relacionada à resistência é a via de p53. Os resultados indicaram que Skmel-28, mais resistente, apresentava deficiência na

via de p53, conforme visto pelos resultados de western blotting da própria p53 e de p21, ao contrário de Skmel-37. Para confirmar o real impacto da via de p53 optou-se por usar o inibidor farmacológico de p53, pifithrin-α, e verificar seu efeito na resposta à cisplatina. Desta maneira, as linhagens foram tratadas com pifithrin-α e cisplatina, sendo o padrão de morte celular observado 24h após as 24h iniciais de exposição à cisplatina. Os resultados (Figura 62) mostraram que para Skmel-28 não houve mudança na resposta à cisplatina, resultado que pode ser justificado pela ausência de atividade de p53 nesta linhagem. Já para Skmel-37 é possível verificar que o uso de inibidor de p53 levou a uma menor taxa de morte celular, sugerindo assim que de fato a via de p53 possa estar envolvida neste processo.

Figura 62. Morte celular em Skmel-28 (A) e Skmel-37 (B) após o uso de pifithrin-α. Resultados mostram média e desvio padrão de ensaio em triplicata. Ensaio representativo de triplicatas independentes. * p < 0.05.

4.4.4 Caracterização das vias de morte por exposição à cisplatina

Uma vez sugerido que a via de p53 poderia estar relacionada com a resistência ao tratamento com cisplatina, procurou-se explorar melhor os mecanismos que contribuiam para o desencadeamento de morte após cisplatina em melanomas.

A primeira questão a ser analisada foi se a fase do ciclo celular contribuia para a morte celular causada por cisplatina. Neste caso em específico, porque cisplatina causa lesões genômicas, dentre outras, que acabam por interferir com processos de duplicação e transcrição. Para verificar se a passagem pela fase S do ciclo celular poderia interferir com a resposta, procurou-se estimular/inibir o ciclo celular através da quantidade de soro fetal. Desta maneira as células foram tratadas com 2% de soro para inibir o ciclo celular e outro grupo com 20% para estimular o ciclo. Em ambas as situações descritas, as células foram tratadas com cisplatina. A figura 63 demonstra os resultados do experimento. Inicialmente verificou-se realmente se o tratamento com diferentes concentrações de soro tem efeito no ciclo celular. Como mostrado na figura 63A, é possível verificar que a concentração de 20% de soro aumenta em cerca de 10% a quantidade de células em ciclagem (S/G2/M), o que também pode ser observado nos histogramas representativos mostrados (Figura 63B). Quando se observa o efeito da diferença de concentração na resposta ao quimioterápico, se observa que para ambas as linhagens a inibição do ciclo celular leva a uma menor taxa de morte (Figura 63C).

Figura 63. Análise do efeito do ciclo celular na resposta à cisplatina. (A) Média e desvio padrão da porcentagem de eventos em cada uma das fases do ciclo celular nas condições de concentração de soro. (B) Imagem representativa dos histogramas referentes às concentrações do soro. (C) Gráfico com a porcentagem de células hipodiplóides referente à sensibilidade à cisplatina em relação à concentração de soro. Resultados mostram média e desvio padrão de ensaio em triplicata. Ensaio representativo de triplicatas independentes. *** p < 0.001.

Os resultados sugerem que a passagem pela fase S do ciclo celular pode ser mais letal no uso de cisplatina. Isto porque, provavelmente o acúmulo de lesões genômicas causadas por cisplatina, durante a fase de replicação de DNA cause maiores consequências e desencadeie processos de morte.

Seguindo a intenção de caracterizar o processo de morte relacionado à cisplatina nestas duas linhagens, procuramos entender as possíveis vias moleculares envolvidas. O processo de desencadeamento de morte se mostra bem complexo, com a ativação de várias sub-vias as quais levam a ativação de mecanismos de morte, podendo este ser por

morte do tipo apoptose onde há a ativação da via Caspase. Analisou-se a expressão de duas proteínas importantes para a regulação do mecanismo de morte celular, BCL-2 e PUMA α/ . Enquanto BCL-2 atua como proteína anti-apoptótica, PUMA α/ age como proteína pró-apoptótica. O resultado da expressão destas das proteínas pode ser vista na Figura 64.

Figura 64. Western Blotting para BCL-β e PUMA α/ .

Os resultados corroboram com os achados para sensibilidade à cisplatina, isto porque na linhagem Skmel-28, mais resistente, a expressão de BCL-2 aumentou conforme a exposição enquanto em Skmel-37 diminuiu. Já com relação a expressão de PUMA α/ , nota-se que sua expressão aumenta conforme o tratamento com cisplatina em Skmel-37, porém em Skmel-28 é possível observar a não expressão da proteína, mesmo após o tratamento com cisplatina. Este resultado reflete uma importante característica que tem justamente se desenhado, a participação de p53 na resposta à cisplatina. Isto porque PUMA α/ é um alvo downstream de p53, o que reforça tal participação desta via.

Os resultados mostram que o tratamento com cisplatina leva a um desbalanço dos fatores pró e anti-apoptóticos, no caso PUMA α/ e BCL-2. O desbalanço destes

fatores é primordial para a ativação ou não das vias efetoras de apoptose, como a ativação das Caspases 3 e 7. Sendo assim, nós verificamos a ativação de Caspase 3 e 7 nas linhagens após o tratamento com cisplatina, como uma análise complementar dos processos de morte envolvidos. Neste experimento, as linhagens foram tratadas com cisplatina, conforme metodologia já utilizada e a marcação da atividade Caspase 3/7 foi medida através de peptídeo fluorescente ativado por atividade das Caspases citadas e que atuam como efetoras, cuja fluorescência pode ser adquirida por citometria. Desta maneira, a verificação da atividade Caspase 3/7 se deu pela análise da intensidade média de fluorescência emitida. A figura 65 demonstra os resultados para a análise da ativação de Caspase 3/7 das linhagens.

Figura 65. Análise da ativação de Caspase 3/7. (A) Análise de histogramas quanto aos picos de fluorescência. (B) Gráfico com a análise da intensidade média de fluorescência do ensaio de ativação de Caspase 3/7 nas linhagens de melanoma utilizadas. Resultados mostram média e desvio padrão de ensaio em duplicata. Ensaio representativo de triplicatas independentes.

Os resultados demonstraram que houve maior ativação de Caspase 3/7 em Skmel-37 quando se analisa o deslocamento dos histogramas em comparação ao controle (Figura 65A) e também quando se compara ao deslocamento apresentado por Skmel-28. No entanto, quando os dados de intensidade média de fluorescência são postos em gráficos (Figura 65B), é possível verificar que a ativação de Caspase 3/7 é significativa para ambas as linhagens no tempo de 24h após tratamento com cisplatina por 24h. Uma análise mais detalhada do ensaio de Caspase 3/7, mostrando a aquisição dos eventos pela fluorescência pode ser visto em Anexo E.