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Tratamento com DNase I

O ensaio Taqman que seria utilizado para avaliação da expressão alelo- especifica de XPC K939Q foi originalmente desenvolvida para genotipagem do polimorfismo em ensaios usando DNA, desta maneira os primers usados para amplificação seriam próprios para DNA. Além disso, o exon 15 onde se encontra o polimorfismo tem grande extensão (216 bp mais a região 3´UTR de 600 bp)(Khan et

Assim, para realizarmos a quantificação da expressão alelo-especifica houve a necessidade de se tratar o RNA extraído com DNase com o intuito de se eliminar qualquer resíduo de DNA contaminante que poderia vir a alterar a confiabilidade dos resultados. Primeiramente, houve a necessidade de verificar se havia DNA contaminante nas amostras de RNA extraídas por metodologia de TRIZOL. Para tal, usaram-se primers de amplificação de XPC, desenhados para se ligarem a regiões intrônicas (mais especificamente, os primers usados para genotipagem de XPC poli AT).

Para averiguação da possível contaminação de DNA em amostras de RNA, as amostras de um ensaio completo com exposição à UVB foram amplificadas para XPC poli AT. O resultado da amplificação pode ser visto na figura 45A. O resultado demonstra claramente a presença de DNA contaminante durante a extração de RNA pela metodologia do TRIZOL, confirmando assim a necessidade do tratamento de DNA para as amostras oriundas da extração de RNA.

Após metodologia de tratamento com DNase I, a qual necessitou de padronização, foi possível eliminar a presença de DNA contaminante das amostras, conforme pode ser visto no produto de amplificação exemplificado na figura 45B. Uma vez padronizada a eliminação de DNA contaminante, o RNA resultante pode ser convertido em cDNA para quantificação alelo-específica.

Figura 45. Amplificação de DNA contaminante em amostras de RNA extraído do ensaio para quantificação alelo-específica de XPC. (A) amplificação em amostras originais de extração. (B) amplificação após tratamento com DNase I.

Teste de especificidade das sondas Taqman

O próximo passo para garantir a sensibilidade do ensaio de expressão alelo específico seria de testar uma possível reação cruzada entre as sondas, podendo assim levar a uma interpretação errada do sinal envolvido na amplificação. Para testar a possibilidade de reação cruzada entre sondas, imaginou-se verificar a veracidade de identificação de genótipos através do ensaio Taqman em amostras genotipadas inicialmente por PCR. Optou-se por genotipar as amostras para esta finalidade usando os primers para o polimorfismo XPC poli AT (descrito na tabela 1). Em um banco de amostras de DNA de indivíduos saudáveis, procurou-se identificar o genótipo destas amostras (figura 46).

Figura 46. Genotipagem de amostras do banco de DNA para posterior teste de reação cruzada.

Com a identificação de genótipo de algumas amostras do banco de DNA disponível, o próximo passo foi testar a possível reação cruzada entre as sondas. Para tal, ensaio Taqman foi realizado utilizando-se duas amostras de cada genótipo (KK, KQ e QQ) e analisando-se a possibilidade de reação cruzada entre as sondas. O resultado do

plot de genotipagem pode ser visto na figura 47. Em um primeiro teste, a utilização das

sondas de genotipagem resultou na confirmação dos genótipos previamente identificados por PCR, ou seja, as amostras de genótipo KK vistas por PCR também foram confirmadas por Taqman, assim como as amostras de genótipo KQ e QQ.

Para uma análise mais detalhada da amplificação das amostras, atentou-se também para os amplifications e multicomponent plots das amplificações (figura 48).

Os resultados vistos demonstram bem a especificidade das sondas utilizadas. Isto porque, nas amostras de genótipo KK, o amplification plot demonstrou apenas uma curva de amplificação (do alelo K), enquanto no multicomponent plot, apenas um componente (verde) apresenta aumento na intensidade de fluorescência, enquanto o componente azul (representando o alelo Q) não apresenta mudança significativa da intensidade de fluorescência ao longo do processo de amplificação. Já nas amostras heterozigotas, há o aumento de intensidade de fluorescência nos dois fluoróforos usados (FAM e VIC, respectivamente alelos Q e K) e nas amostras de genótipo QQ, apenas o fluoróforo correspondente demonstrou aumento da intensidade de fluorescência. Tomando em conta os resultados, acredita-se que as sondas específicas para cada alelo, poderiam ser usadas para quantificação de expressão alelo-específica.

Construção da curva padrão

Conforme descrito na seção de Materiais & Métodos, houve a necessidade de se criar uma curva padrão de concentração conhecida dos alelos K e Q para referência no cálculo da possível diferença alelo-específica. Esta curva foi criada através de diluições diferentes de DNA homozigoto para os alelos KK com DNA homozigoto para os alelos QQ nas proporções (KK/QQ) de 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 e 1:4. Uma vez criada tais diluições (todas com concentração de 50 ng/μl), foi realizado o ensaio Taqman para confirmação da utilidade da curva. Os resultados da amplificação (amplification plot) de cada uma das diluições podem ser observados na figura 49. Nas figuras de cada plot, é possível observar a diferença de amplificação de cada alelo em decorrência da diluição previamente estabelecida, onde a separação das curvas obedece a expectativa de cada tipo de diluição feita.

Figura 49. Amplification plots para a curva de amplificação da curva padrão. K Q K Q K Q K Q K Q K Q 3:1 2:1 1:1 3:1 2:1 K Q 4:1 4:1

Uma vez obtida a curva padrão para referência, os valores obtidos da amplificação foram plotados em gráfico para averiguação dos resultados, no intuito de verificar se a curva padrão serviria de fato para base de cálculo para a expressão alelo-específica. Um exemplo dos dados plotados em gráficos pode ser visto na figura 50.

Figura 50. Plotagem dos dados da curva padrão.

O resultado da plotagem dos dados da curva padrão pareceram adequados, uma vez que o valor R2 apresentou valor de correlação de 0.98, valor adequado para utilização de curvas padrão.