Ülkemizdeki Engelli Bireylerin Çalışma Hayatında Karşılaştığı

Nosso grupo obteve resultados interessantes quanto ao envolvimento de genes da via NER e o desenvolvimento de melanoma (Gonçalves et al., 2011). Em um estudo caso-controle foi observado maior risco de desenvolvimento de melanoma em indivíduos que possuíam um haplótipo polimórfico no gene XPC (Tabela 3). Tal haplótipo é formado por três polimorfismos: uma inserção de 83 pares de bases de repetições AT no intron 9 (polimorfismo conhecido como PAT+), uma substituição de citosina para adenina no sitio de splicing do intron 11 (polimorfismo conhecido como

IV11-6C/A) e a troca de uma Lisina por Glutamina no códon 939 da proteína (K939Q).

Além disso, o mesmo estudo mostrou que os três polimorfismos apresentam forte desequilíbrio de ligação, sendo assim, herdados juntos no formato de um haplótipo. Alguns estudos sugeriram menor capacidade de reparo conferida a estes polimorfismos, principalmente em relação aos polimorfismos PAT+ e K939Q, no entanto tais estudos foram baseados em linfócitos de pacientes, método que pode estar sujeito a outras variações genéticas que não foram analisadas (Qiao et al., 2002). No entanto, uma maior análise do impacto destes polimorfismos, seja na estabilidade do mRNA, uma vez que dois dos polimorfismos estão localizados em regiões intrônicas (sendo uma delas no sitio de splicing), seja na atividade da proteína mediante a troca de lisina por glutamina no códon 939 ainda não foram devidamente exploradas, principalmente para neoplasias tais como o melanoma.

Não apenas as variações genéticas existentes em XPC aumentaram o risco para o desenvolvimento melanoma, como a associação das variações existentes de XPC com

outros fatores de risco já conhecidos para melanoma também demonstrou aumento de risco (Tabela 4). Os resultados obtidos deste estudo sugerem que fatores que possam modular a atividade de XPC, como por exemplo, a existência de variações genéticas, podem também estar relacionados ao desenvolvimento de melanomas. Alguns estudos recentes têm demonstrado a existência de variações funcionais em alguns genes devido à presença de variações polimórficas (Altilia et al., 2012). Além disso, variações na expressão gênica específica de diferentes alelos também têm sido descritas, o que pode justamente acarretar em riscos diferenciais atribuídos a alelos específicos e determinadas doenças (Pillay et al., 2012).

Tabela 3. Frequência genotípica e risco associado a polimorfismos no gene XPC e risco de melanoma. Dados extraídos de Gonçalves et al., 2011.

Tabela 4. Associação de variações polimórficas de XPC e demais fatores de risco para o risco de desenvolvimento de melanomas. Dados extraídos de Gonçalves et al., 2011.

Os resultados apontados pelo estudo claramente demonstram um papel dos polimorfismos de XPC no risco de melanoma (Gonçalves et al., 2011). Tais dados serviram de base para a proposta de analisar o possível impacto funcional destes polimorfismos. Devido a presença de polimorfismos intrônicos e o forte desiquilíbrio de ligação entre as variantes, buscou-se avaliar o possível impacto funcional na

estabilidade e expressão gênica de XPC, usando como marcador surrogado o polimorfismo K939Q. As seções a seguir descrevem os resultados quanto à padronização e avaliação da expressão gênica de XPC.

4.3.2 Genotipagem de linhagens de melanoma para os polimorfismos de XPC

Seguindo os objetivos do projeto de avaliar o impacto dos polimorfismos de

XPC na expressão e funcionalidade do mesmo, procurou-se genotipar as linhagens de

melanoma existentes no laboratório quanto aos genótipos de XPC. Neste caso, a genotipagem permitiria identificar linhagens que poderiam ser utilizadas como modelos para averiguar o impacto dos polimorfismos intrônicos de XPC na expressão e estabilidade dos transcritos. Os polimorfismos de XPC são: presença de região de repetição de bases AT de 83 pares de bases localizados no intron 9 (XPC Poli AT); substituição de um citosina por adenina no sitio de splicing do exon 12 (XPC IV -6 C/A) e substituição do aminoácido lisina (K) por glutamina (Q) no códon 939. Os polimorfismos poli AT, XPC IV -6 A e 939Q são os alelos variantes do gene.

Os resultados da genotipagem para os polimorfismos de XPC podem ser vistos na figura 43.

Figura 43. Genotipagem das linhagens celulares de melanoma existentes no laboratório para os polimorfismos de

XPC: (A) XPC poli AT, (B) XPC K939Q, (C) XPC IV-6 C/A.

Os resultados mostram que as linhagens celulares Skmel-02, Skmel-37, LB373 e MZ2-Mel são todas heterozigotas para os polimorfismos de XPC, enquanto as demais linhagens, Skmel-28, Mel-85, Mewo e SBCL2 apresentam os genótipos selvagens para os polimorfismos de XPC. Com os resultados das genotipagens, as linhagens heterozigotas se mostram importantes para análise de expressão alélica diferencial, pois podem ser analisadas por meio de sondas específicas para Real-time PCR. A exploração de linhagens de melanoma para linhagens heterozigotas para XPC K939Q, e consequentemente para os demais polimorfismos, foi estendida para as demais linhagens adquiridas no grupo (Figura 44). Estas linhagens são: UACC-62, Skmel-05, Skmel-19, Skmel-29, Skmel-103 e Skmel-147. Resumo da genotipagem dos polimorfismos de XPC esta detalhado na tabela 4.

Figura 44. Genotipagens das novas linhagens celulares de melanoma existentes no laboratório para os polimorfismos de XPC: (A) XPC poli AT, (B) XPC K939Q, (C) XPC IV-6 C/A.

Tabela 5. Resumo das genotipagens dos polimorfismos de XPC nas linhagens de melanoma. XPC poli AT XPC IV -6 C/A XPC K939Q Skmel-02 Heterozigoto CA KQ Skmel-28 Selvagem CC KK Skmel-37 Heterozigoto CA KQ Mel85 Selvagem CC KK LB373 Heterozigoto CA KQ Mewo Selvagem CC KK SBCL2 Selvagem CC KK MZ2Mel Heterozigoto CA KQ UACC-62 Selvagem CC KK Skmel-05 Selvagem CC KK Skmel-19 Homozigoto AA QQ Skmel-29 Homozigoto AA QQ Skmel-103 Heterozigoto CA KQ Skmel-147 Heterozigoto CA KQ

4.3.3 Padronização das metodologias usadas para quantificação alelo-específica de