Evde Çalışma Biçimi, Bireysel Çalışma, Girişimcilik

Uma vez que muitos agentes quimioterápicos agem causando danos no DNA, os quais podem ser reparados pela via de reparo NER levando assim a resistência à quimioterapia em tumores, buscou-se avaliar se a inibição de hHR23B de alguma maneira aumentaria a resposta à quimioterapia. Para tal, optou-se por utilizar quimioterápicos que de alguma maneira estivesse relacionados à participação da via NER no reparo das lesões causadas por tais agentes quimioterápicos, seja por criação de adutos no DNA (as quais são preferencialmente reparados pela via NER), ou seja, pela oxidação ou alquilação de bases. Para este último caso, alguns trabalhos sugerem a participação seja de XPC (D´Errico et al., 2006) ou mesmo de hHR23B (Miao et al., 2000) na atividade de reparo de lesões oxidativas. Desta maneira, usaram-se os quimioterápicos: cisplatina (que pode atuar causar adutos no DNA), dacarbazina e temozolamida (comumente usados na quimioterapia de melanomas e que causam alquilações em bases do DNA), etoposídeo (inibidor de DNA topoisomerase e que pode também causar adutos de DNA), 5’Fluouracil (antimetabólito que atua na inibição da timidilato sintase, inibindo assim a síntese de timina) e Tunicamicina (agente causador de estresse de reticulo devido a sua atuação na inibição de importante passo do folding de proteínas).

5’ Fluouracil foi escolhido devido a sua eficácia poder ser mediada pela ação da proteína glicosilase TDG (Thymine DNA Glysosylase)(Kunz et al., 2009) que atua no reparo de lesões em timinas, sendo que TDG pode também interagir com XPC (Shimizu

reticulo pode levar a aumento de espécies reativas de oxigênio que causam danos no DNA (onde novamente o complexo XPC-hHR23B pode atuar modulando proteínas da via BER), ou a mesma situação de estresse desencadeia processos de degradação de proteínas, papel que pode ser modulado por hHR23B devido a seus domínios de ligação a ubiquitina (Dantuma et al. 2009).

Para verificar o efeito do silenciamento de hHR23B na resposta a agentes quimioterápicos, células Skmel-37 foram transfectadas com esiRNA para hHR23B e após 48h de inibição, foram tratadas para os agentes citados. As concentrações usadas foram estimadas com base na literatura específica para uso destes agentes em linhagens de melanoma ou mesmo de uso rotineiro no laboratório (detalhes na seção de materiais e métodos). Após 48h, as células foram extraídas e verificadas para morte celular por incorporação de iodeto de propídeo. Os resultados podem ser vistos na figura 41.

Os resultados demonstraram primeiramente que a inibição de hHR23B e também de XPC levou a maior sensibilidade das células a exposição a doxorrubicina (Figura 41). Como o silenciamento de hHR23B e XPC sugeriu a participação deste complexo proteico da via NER na resposta a doxorrubicina, surgiu à questão de verificar se nas linhagens de melanoma que possuem baixa expressão de hHR23B apresentariam a mesma sensibilidade a doxorrubicina. Para responder esta questão, nós voltamos a utilizar as linhagens de melanoma LB373 e Mel85 (as quais apresentavam baixa expressão de hHR23B) para avaliar a sensibilidade a doxorrubicina, tendo em comparação a linhagem Skmel-37, a qual expressa hHR23B. Desta maneira, as três linhagens foram plaqueadas e após 24h, foram expostas a doxorrubicina à concentração de 100 ng/ml por 48h e analisadas quanto a morte celular por incorporação de iodeto de propídio em citometria de fluxo. A exposição das linhagens de melanoma à

doxorrubicina mostrou que a linhagem Skmel-37, a qual expressa hHR23B, possui sensibilidade “intermediária” à ação do quimioterápico quando comparada com as linhagens LB373 e Mel85, as quais não expressam hHR23B (Figura 41). Tal resultado sugere que outras variáveis além do complexo XPC-hHR23B, mais precisamente a via NER, podem estar envolvidas na sensibilidade a doxorrubicina.

Figura 41. Sensibilidade das linhagens de melanoma à doxorrubicina. (A) efeito do silenciamento de hHR23B e XPC. (B) Sensibilidade das linhagens de melanoma à doxorrubicina. Resultados mostram média e desvio padrão de ensaio em triplicata. Ensaio representativo de triplicatas independentes.

Além de doxorrubicina, outros agentes quimioterápicos também foram utilizados. No caso do uso de Temozolomida e 5´Fluoracil, nenhuma diferença foi observada (Figura 42A e C). Já para o uso de etoposideo, curiosamente, a inibição de hHR23B levou a uma menor taxa de morte celular após 48 de tratamento (Figura 42B). Para cisplatina, apenas a inibição de XPC levou a um aumento na taxa de morte celular, no entanto, o silenciamento de hHR23B não alterou tal sensibilidade (Figura 42D).

Além dos agentes quimioterápicos usados, testou-se se hHR23B poderia contribuir para a sensibilidade ao agente tunicamicina, composto comumente usado para ativar estresse de reticulo endoplasmático, onde a atuação de tunicamicina impede um importante passo de glicosilação de proteínas recém-sintetizadas, levando a um acumulo

de proteínas mal-enoveladas, disparando assim o processo conhecido como UPR (unfolded protein response). A ativação de UPR leva as células a ativarem um programa de degradação das proteínas mal-enoveladas acumuladas no reticulo endoplasmático, da qual hHR23B pode estar relacionado devido a seus domínios de ligação a proteínas ubiquitinadas (Dantuma et al., 2009). A persistência da ativação de UPR também pode levar as células a apoptose. Como hHR23B também apresenta os mesmos domínios de ligação a proteínas ubiquitinadas e também têm sido relacionado a regulação de degradação de proteínas, pode também de alguma maneira estar relacionado a sensibilidade a tunicamicina.

De maneira similar aos resultados encontrados para exposição à etoposídeo, o tratamento com tunicamicina levou as células previamente silenciadas para hHR23B a uma menor taxa de morte celular quanto comparada as células tratadas com esiRNA negativo (Figura 42E). No entanto, o silenciamento para XPC não alterou a susceptibilidade a tunicamicina, evidenciando assim um possível papel de hHR23B independente de sua função no NER.

Figura 42. Sensibilidade das linhagens de melanoma à 5´Fluoracil (A) Etoposídeo (B), Temozolomida (C), Cisplatina (D) e Tunicamicina (E), após silenciamento de hHR23B e XPC. Resultados mostram média e desvio padrão de ensaio em triplicata. Ensaio representativo de triplicatas independentes.

4.3 Função de polimorfismos de XPC no risco de desenvolvimento de melanoma e