Yöntem

A escolha dos intervalos de tempo baseou-se primeiramente no estudo da cinética dos anticorpos (ANOVA e Tukey). A escolha deste agrupamento teve o objetivo de contribuir com informações que possam ser aproveitadas na interpretação de resultados sorológicos obtidos em gestantes.

Com relação à cinética, vários estudos apontam perfis sorológicos clássicos de infecção aguda, intermediária e crônica (Camargo et al., 1977; Suzuki et al., 2001; Cozon et al., 1998; Remington et al., 2006). Embora não haja consenso quanto à classificação temporal da infecção por T. gondii, a maioria dos autores denomina como infecção aguda casos com duração menor ou igual a 3 meses (Suzuki et al., 2001; Robert et al., 2001) e crônica ou latente quando maior que 12 meses. Um período intermediário entre 3-12 meses foi nominado por Robert et al. (2001) de período convalescente, enquanto Camargo et al. (1977) descreveram um perfil sorológico que chamou de transição, intermediário entre o agudo e o crônico.

A importância médica do diagnóstico temporal da infecção aguda por T. gondii em pacientes imunocompetentes está relacionada às gestantes, ao diagnóstico diferencial das uveítes e linfadenopatias, além de casos de doença sistêmica aguda grave.

Com relação às gestantes, a despeito dos poucos estudos baseados em evidências científicas (Peyron et al., 2000), a confirmação diagnóstica de soroconversão ocorrida durante a gravidez é ponto de partida para a instituição de medidas médicas, como tratamento materno e investigação fetal. Do ponto de vista da utilização destas informações para a assistência médica pré-natal, é importante saber que no Brasil, o início do pré-natal frequentemente ocorre após o primeiro trimestre. A propósito, Reis

et al. (2006) relataram que a primeira visita ao pré-natal em Porto Alegre foi feita no

primeiro trimestre em apenas 31,4% dos casos em que a idade gestacional era conhecida. O problema gerado a partir da realização tardia dos testes sorológicos anti-

T. gondii é que a interpretação dos resultados e a tomada de decisão em casos

suspeitos de infecção aguda fica prejudicada. Ocorre que a maioria dos testes de segunda linha (em especial, o de avidez de IgG), solicitados em casos de gestantes

IgM positivas, só permite afastar infecção aguda quando anticorpos de alta avidez são encontrados nas primeiras 12 a 20 semanas. Considerando a realidade brasileira, são desejáveis testes que também possam ser úteis quando realizados em períodos posteriores ao primeiro trimestre de gestação.

A análise dos resultados de amostras de soro em fase mais precoce da infecção (meses 1 e 2 ) levou em conta o fato de que a infecção precede os sintomas em cerca de 1 a 3 semanas. Como a nossa referência de tempo em relação às coletas de sangue foi o início dos sintomas, o mês três poderia encobrir uma real diferença entre os níveis de anticorpos dos meses 1 e 2 (fase mais aguda), tanto quanto o mês oito poderia fazê-lo em relação ao período convalescente precoce. Assim, foram retirados dos respectivos grupos com o intuito de minimizar a interferência destes mêses na transição das fases aguda para a convalescente precoce e da convalescente precoce para a tardia. A análise da curva ROC (GRAF. 6), retirando-se o mês 3 do grupo 1 (infecção aguda) e o mês 8 do grupo dois (infecção convalescente precoce), reforçou que a IgG não é capaz de separar as diferentes fases do primeiro ano de infecção.

A análise dos resultados dos testes pela curva ROC (TAB. 31 do APÊNDICE D) aponta que os testes para IgM e avidez de IgG podem separar os grupos 1 e 3 com valores sob a curva significantes. Exceto a IFI e com menor poder, também podem separar os grupos 1 e 2. Os testes de avidez de IgG apresentam o melhor desempenho com vantagem sobre os testes para IgM e da CF sobre o ELFA na distinção do grupo 1 e 3.

6.5 Identificação da melhor combinação de testes que discrimina as fases da doença

Considerando o objetivo de separar os pacientes em três grupos distintos e levando em conta que a curva ROC permite a alocação dos casos em apenas dois grupos, optamos por utilizar a mesma estratégia proposta por Robert et al. (2001), que utilizaram a combinação de um teste de primeira linha, com sensibilidade maior que 95%, com um teste de segunda linha. Este último, além de sensível (maior que 90%) deveria apresentar fração de falso positivo menor que 50%. Índices diagnósticos convencionais como sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo são usados quando o resultado do teste é binário (doença presente ou ausente). De forma semelhante, definimos sensibilidade dos testes como o percentual de resultados positivos no grupo 1 (infecção aguda) e especificidade como percentagem de resultados negativos no grupo 3 (infecção convalescente tardia).

Valores positivos no grupo 3 foram considerados falso-positivos, e valores negativos no grupo 1 foram considerados falso-negativos. O ponto de corte escolhido foi aquele que garantiu mais de 95% de sensibilidade para o diagnóstico de infecção aguda (primeira linha) ou mais de 90% com fração de falso positivo menor que 50% (segunda linha).

Devido ao desenho do estudo, valores preditivos positivo e negativo não foram obtidos. Os testes escolhidos para esta análise foram os da classe IgM e IgA, além da avidez de IgG, classicamente utilizados no diagnóstico de infecção aguda por T.

gondii. As subclasses de IgG também foram analisadas, levando-se em conta que não

existem estudos sobre o desempenho diagnóstico destes anticorpos pela técnica de CF na infecção aguda por T. gondii.

Os anticorpos da classe IgG não foram analisados devido à limitação do seu uso no diagnóstico da doença toxoplásmica aguda, restrito às situações onde ocorre soroconversão ou naquelas em que observa-se um aumento significativo dos títulos de anticorpos, de pelo menos duas vezes, medidos pelo teste do corante ou IFI.

Estratégia semelhante foi aplicada por Robert et al.(2001) em estudo que envolveu 11 centros de referência europeus para o diagnóstico de infecção primária por T. gondii. Os soros analisados por esses autores foram distribuídos em três grupos, constituídos de 73 indivíduos com menos de 3 meses de soroconversão (infecção aguda), 49 soros destes mesmos indivíduos com infecção datada entre 3 e 12 meses após a soroconversão (infecção convalescente) e 154 com infecção pregressa (mínimo de 12 meses). Os autores analisaram um grande número de soros de pacientes com infecção crônica, que não fizeram parte dos grupos iniciais. Isso favoreceu a discriminação dos grupos, porém distanciou da prática clínica, onde os pacientes que mais demandam esclarecimento diagnóstico são aqueles que apresentam positividade nos testes IgM, o que deve ocorrer majoritariamente no primeiro ano após a primoinfecção.

Nosso estudo analisou uma coorte de pacientes acompanhada ao longo de 1 ano, o que permitiu um seguimento sorológico do mesmo grupo. Sete testes de primeira linha foram combinados com 6 testes de segunda linha, gerando 42 modelos. Cinco testes (IgM ELISA, IgM ELFA, IgM CF, avidez ELFA e avidez CF) atenderam aos critérios de primeira ou segunda linha, na dependência dos pontos de corte. As melhores combinações de dois testes foram aquelas que partiram da avidez CF como teste de

primeira linha, seguido da IgM ELISA (sensibilidade 95,7% e especificidade 98,1%) ou avidez ELFA (sensibilidade 95,5% e especificidade de 98,1%).

A análise discriminante identifica o conjunto de testes que oferece o melhor desempenho. O modelo 4 gerado pelo método step wise identificou os testes avidez CF, IgM ELFA, avidez ELFA e IgG2 CF, permitindo 75,6% de acerto na classificação dos grupos. Quando se excluiu a IgG2 deste modelo (modelo 12) a média de acerto manteve-se no mesmo patamar (75,1%). Os erros de classificação dos modelos 4 e 12 ocorreram entre os grupos vizinhos. Ressalta-se que nenhum paciente do grupo 1 foi erroneamente classificado no grupo 3, e vice-versa. Portanto, os resultados desses modelos permitem excluir infecção convalescente tardia ou aguda se o caso é classificado no grupo 1 e 3 respectivamente.

Considerando por um lado o pequeno acréscimo no desempenho, e por outro o custo e as dificuldades técnicas para a dosagem de IgG2, esse último modelo (12) delineou- se como o melhor conjunto de testes para a discriminação dos grupos agudo e convalescente tardio.

O conjunto de testes deve considerar a disponibilidade de recursos técnicos dos laboratórios ou centros de referência. No entanto, não é limitação para o emprego da técnica de citometria de fluxo, hoje disponível e sub-utilizada na rede de pública de saúde, nos laboratórios de referência para HIV-AIDS.