3.1. Hasta-metod
Çalışmamıza Nisan 2009 ile Şubat 2010 tarihleri arasında Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Gastroenteroloji polikliniğine dispeptik yakınmalar ile başvuran, klinik muayenede endoskopi endikasyonu konulan ve gaytada H.pylori antijeni pozitif saptanan toplam 59 hasta dahil edildi. Hastalardan üst GİS endoskopi işlemiyle mide antrum ve korpusundan dörder adet biyopsi materyali alındı. Biyopsiler her iki bölgede de karşılıklı olarak büyük ve küçük kurvaturdan alındı. Bu biyopsi örneklerinin antrumdan iki ve korpustan alınan iki örnek patolojik inceleme, biri PCR ve diğeri de H.pylori kültürü için kullanıldı. Endoskopi esnasında orada bulunan Mikrobiyoloji Anabilim Dalı araştırma görevlisi tarafından, aşağıda belirtildiği gibi, biyopsi örneklerinin uygun şartlar ve süre içerisinde laboratuvara ulaşması sağlanıldı. Kültürde üreme olan hastalardan amoksisilin, klaritromisin, tetrasiklin ve levofloksasin direncini belirlemek üzere antibiyogram yapıldı. 2 hastada teknik nedenlerle levofloksasin direnci çalışılamadı. Hastaların yaş, cinsiyet, son bir yıl içerisinde H.pylori’ye yönelik antibiyotik tedavisi alıp almadıkları, şikayetleri, üst GİS endoskopi ve patolojik inceleme bulguları, patoloji örneğindeki H. pylori yoğunluğu gibi özellikleri kayda alındı. İşlem sonrası hastalara amoksisilin 2x1 gr, klaritromisin 2x500 mg ve lansoprazol 2x30 mg’dan oluşan üçlü H.pylori eradikasyon tedavisi başlandı. 2 hafta süren bu tedaviden sonra 4 hafta süreyle PPI (esomaprazol) 2x40 mg devam edilerek tedavi 6 haftaya tamamlandı. Tedavi sonlandıktan 6-8 hafta sonra hastaların H.pylori eradikasyon kontrolünü yapmak üzere kontrol üst GİS endoskopisi planlandı. Kontrole gelen hastalarda ilaç uyumu sorgulandı. Kontrolde de hastalardan üst GİS endoskopi ile mide antrum ve korpusundan, yine aynı alanlardan, 4’er adet biyopsi materyali alındı ve örnekler eradikasyon başarısını belirlemek üzere kültür, PCR ve patolojik inceleme için kullanıldı.
40 3.2. Kültür
Midenin antrum ve korpus bölgelerinden alınan biyopsi örnekleri işlem esnasında endoskopi ünitesinde bulunan mikrobiyoloji araştırma görevlisi tarafından % 3 gliserin içeren Brusella buyyon içerisine koyularak buz içerisinde en geç 1 saat içerisinde laboratuvara ulaştırıldılar. Transport besiyeri içerisinde uçları kırık cam bagetlerle tamamen parçalanan biyopsi örnekleri H.pylori izolasyonu amacı ile % 7 bekletilmiş at kanı, % 1 izovitaleks ve H.pylori antibiyotik suplementi [6 mg/L vankomisin, 2 mg/L trimetoprim ve 5 mg/L amfotericin B ve 5 mg /L lardakolistin] ilaveli Colombia agar besiyerlerine pipet yardımı ile ekildi. İnokülasyon yapılan besiyerleri 37ºC de % 80 N,
% 15 CO2 ve % 5 O2 içeren mikroaerofilik atmosferde (BD-BBL Campy Pak Plus Mıcroaerophylic system 271045–5235591) 9 gün süre ile inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda besiyerlerinde yaklaşık olarak 0,5 mm çapında hemolizsiz, gri, şeffaf koloniler H.pylori yönünden değerlendirilmek üzere oksidaz ve üreaz testleri ile değerlendirildi. Koloniden hazırlanan preparatlarda Gram boyası ile boyanarak spiral şeklindeki gram negatif bakterilerin varlığı araştırıldı. Oksidaz ve üreaz pozitif, gram negatif spiraller H.pylori olarak kabul edildi ve antibiyotik duyarlılık testi için kullanıldı.
3.3. Antibiyotik Duyarlılık Testleri
H.pylori izolatlarının amoksisilin, klaritromisin, tetrasiklin ve levofloksasin duyarlılık testleri agar dilüsyon (AD) yöntemi ile yapıldı. Kültür ortamında üretilen H.pylori suşları AD testinde kullanılmak üzere oda ısısına getirilmiş Brusella buyyon içerisinde Mc Farland 4 bulanıklık tüpüne göre dilüe edildi. AD testi için % 7 bekletilmiş at kanı ve % 1 izovitaleks içeren MHA besiyerleri kullanıldı. Besiyerleri otoklavda steril edildikten sonra ilave edilen antibiyotiklerle çalışmada kullanılacak olan; tetrasiklinin 1, 2, 4, 8 mg/L; klaritromisinin;0,5, 1, 2, 4 mg/L, amoksisilinin 0,5, 1, 2, 4 mg/L lik, levofloksasinin 0,5, 1, 2, 4 mg/L lik seri dilüsyonları hazırlandı.
Besiyerleri kullanılmadan önce 24 saat anaerop şartlarda (BBL) 37ºC‘de bekletildi.
Brusella buyyonda Mc Farland 4’e göre hazırlanan test suşlarından önceden
41
işaretlenmiş plaklar üzerindeki sanal kuyucuklara 4 µl damlatılarak ekimler yapıldı.
Ekim yapılan plaklar 37ºC’de mikroaerofilik şartlarda 72 saat inkübasyona bırakıldı.
Süre sonunda değerlendirilen plaklarda H.pylori üremesi görülen son dilüsyonlar direnç için kriter olarak kabul edildi. Elde ettiğimiz H. pylori suşlarının antibiyotiklere karşı dirençli olduğunu gösterir kritik antibiyotik konsantrasyonları; Amoksisilin için 1 mg/L, Klaritromisin için 1 mg/L, Tetrasiklin için 2 mg/L ve Levofloksasin için 1 mg/L olarak alındı.
3.4. Antibiyotik Solüsyonlarının Hazırlanması
Amoksisilin, klaritromisin, tetrasiklin ve levofloksasin PBS (pH 6.0) içerisinde çözüldü ve son konsantrasyonları amoksisilin, klaritromisin ve levofloksasin için 0,5, 1, 2 ve 4 mg/l, tetrasiklin için 1, 2, 4 ve 8 mg/l olacak şekilde besiyerlerine eklendi.
3.5. Uygulanan Moleküler Yöntemler
Elde edilen mide biyopsi örneklerinden konak ve bakteriyal DNA, Qiagen QIAamp DNA Mini Kiti ile izole edildi ve DNA miktarı spektrofotometrede 260 nm’de ölçülerek hesaplandı. Ekstraktlarda, H. Pylori genom varlığını araştırmak için glmM primer çifti (eski adı: ureC) kullanıldı. H. Pylori PCR pozitif örneklerde, virulansdan sorumlu gen bölgelerinden olan cagA allellerinin varlığını belirlemek amacıyla ilgili primerler ile ileri analizler yapıldı62 (Tablo 11).
Tablo 11: Çalışmada kullanılan primer çiftleri ve hedef gen uzunlukları48
Primer Yöntem Dizi Ürün Uzunluğu glmM PCR F 5’-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT–3’ 294 bp R 5’-AAGCTTACTTTCTAACACTAACGC–3’
CagA PCR F 5’-GATAACAGGCAA GCTTTTGAGG -3’ 349 bp R 5’-CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA -3’
42
3.6. H.pylori glmM (ureC) Gen Bölgesinin Amplifikasyonu
GlmM genini tespit etmek amacıyla bu gene spesifik 294 bp uzunluğundaki gen fragmentini hedef alan glmM-F 5’- AAG CTT TTA GGG GTG TTA GGG GTT T -3’
ve glmM-R 5’AAG CTT ACT TTC TAA CAC TAA CGC -3’ primerleri sentez ettirildi (Tablo 11). Liyofilize halde gelen primerler steril bidistile su ile 100 pmol/µl olacak şekilde dilüe edilerek stok primerler hazırlandı. Toplam reaksiyon hacmi 50 µl olacak şekilde PCR buffer (10 X Mg free, 500 mM KCl,100 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X–
100) 5 µl, MgCl2 (25mM) 5 µl, dNTP karışımı (her biri 10 mM) 1 µl, herbir primer çiftinden (stok 100 pmol/µl) 0,5 µl, Taq DNA polimeraz (Vivantis, 5 u/µl U) 0,25 µl, steril distile su 32,75 µl eklenerek amplifikasyon karışımı hazırlandı. Negatif örnek olarak distile su kullanıldı. Hazırlanan bu karışıma ekstrakte edilen DNA örneğinden ve pozitif kontrol örneğinden 5 µl eklendi ve amplifikasyon için termal cycler’a yerleştirildi.
Amplifikasyon aşamaları şu şekilde programlandı:
1. 94º C’de 4 dak. — ilk denaturasyon 2. 94º C’de 1 dk. — denaturasyon 57º C’de 1 dk. — bağlanma 35 döngü 72º C’de 1 dk. — uzama
3. 72º C’de 7 dk. — son uzama (extension) ve + 4ºC’de bekleme konumu.
Amplifikasyon ürünleri % 2’lik agaroz jel elektroforezinde yürütülerek incelendi.62
3.7. H.pylori CagA Gen Bölgesinin Amplifikasyonu
CagA genini tespit etmek amacıyla bu gene spesifik 349 bp uzunluğundaki gen fragmentini hedef alan cagA F 5’- GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G -3’ ve CagA R 5’- CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A -3’ primerleri sentez ettirildi(Tablo 11). Liyofilize halde gelen primerler steril bidistile su ile 100 pmol/µl olacak şekilde dilüe edilerek stok primerler hazırlandı. Toplam reaksiyon hacmi 50 µl olacak şekilde PCR buffer (10 X Mg free, 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 0,1%
Triton X-100) 5 µl, MgCl2 (25mM) 5 µl, dNTP karışımı (her biri 10 mM) 1 µl, herbir primer çiftinden (stok 100 pmol/µl) 0,5 µl, Taq DNA polimeraz (Vivantis 5 u/µl U) 0,25
43
µl, steril distile su 27,7 µl eklenerek amplifikasyon karışımı hazırlandı. Negatif örnek olarak distile su kullanıldı. Hazırlanan bu karışıma ekstrakte edilen DNA örneğinden 10µl eklendi ve amplifikasyon için termal cycler’a yerleştirildi.
Amplifikasyon aşamaları şu şekilde programlandı:
1. 94º C’de 4 dk. — ilk denaturasyon 2. 94º C’de 1 dk. — denaturasyon 57º C’de 1 dk. — bağlanma 35 döngü 72º C’de 1 dk. — uzama
3. 72 ºC’de 7 dk. — son uzama ve + 4 ºC’de bekleme konumu.
Amplifikasyon ürünleri % 2’lik agaroz jel elektroforezinde yürütülerek incelendi.62
3.8. İstatistiksel Analiz
Verilerin analizi için SPSS 11.5 paket programı kullanıldı. P<0,05 olması anlamlı olarak kabul edildi. Grup analizleri için T-test ve Pearson korelasyon analizleri uygulandı.
44