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No presente trabalho foi demonstrado que a IL-1β é regulada em enxerto humano de veia safena in vivo e ex vivo. Esta resposta foi também observada em modelo animal (conexão artério-venosa em rato) que permitiu uma caracterização temporal de regulação da IL-1β no processo de arterialização de um segmento venoso.

Para a realização deste estudo, foi de fundamental importância o desenvolvimento de um modelo experimental. Foi desenvolvido o modelo de conexão artério-venosa em rato, onde a veia jugular é conectada à artéria carótida por até 90 dias. Este modelo reproduz as mudanças encontradas em modelos de enxerto venoso já descritos na literatura, evidenciado por hiperplasia intimal (HI) progressiva, migração e proliferação de SMC e deposição de matriz extracelular (Faries e cols, 1996; Stark e cols., 1997; Sterpetti e cols., 1997; Zou e cols., 1998; Zhang e cols., rante 1999; Westerband e cols., 2001; Jiang e cols., 2004; Diao e cols., 2005). Nos períodos estudados o coração do animal parece não estar comprometido funcionalmente, ainda que este modelo de conexão artério-venosa possa ser utilizado como indutor crônico de insuficiência cardíaca congestiva.

No sistema vascular as células são expostas não somente a fatores químicos e biológicos, mas também a fatores mecânicos, incluindo “shear stress” na superfície endotelial, distensão e deformação radial da parede do vaso sanguíneo (Moore e cols., 2001). Estes fatores mecânicos influenciam diretamente no remodelamento do enxerto venoso, que passa de um regime de baixo fluxo e pressão, para um regime arterial (Liu e

cols., 2000). Em resposta a este estresse mecânico, observa-se um pico de apoptose após o primeiro dia de arterialização da veia jugular com uma significante degeneração e morte das SMC na túnica média (Figuras 16, 17A e 18). Foi possível observar também o aumento de quantidade de fibrina e debris celulares no lúmem do segmento arterializado (Figura 12). Estas observações estão de acordo com os diversos modelos de arterialização já descritos em humano, porco, rato e camundongo (Kockx e cols., 1996; Mayr e cols., 2000; Moore e cols., 2001; O’Brien e cols., 1998). (Hoch e cols., 1999; Tomas e cols., 2003). Em resposta a esta perda celular e a necessidade de se adequar à nova condição hemodinâmica, o evento subseqüente observado é o repovoamento da camada média e formação de camada neoíntima (Figura 16). A importância do fator hemodinâmica no remodelamento vascular fica evidente no estudo que mostra a regressão quase que completa da HI, quando o enxerto venoso de 4 semanas em leito arterial, é reimplantado em leito venoso (Sterpetti e cols., 1996; Sterpetti e cols., 1998).

A formação de trombo atraído pelos danos endoteliais é mais um ponto que contribui para o desenvolvimento da neoíntima (Torsney e cols., 2004). Tal exposição das proteínas subendoteliais da matriz ao sangue podem ser um risco para a formação do trombo que ocorre quando as plaquetas aderem ao colágeno exposto após o dano endotelial (Konishi e cols., 2002). Neste processo, as plaquetas dentro do microtrombo podem liberar fatores, tais como o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), que promovem o recrutamento de células de músculo liso, sendo que, a fibrina age como uma matriz para a migração celular, para os miofibroblastos e SMC durante processo de reparação tecidual (Nomura e cols., 1999; Naito e cols, 2000). Assim, a denudação endotelial, seguida pela formação maciça de microtrombos em enxertos venosos pode

explicar porque 10% dos enxertos de veia safena em pacientes com IAM ocluem nas primeiras semanas por trombose (Mehta e cols., 1997; Motwani & Topol, 1998; Sasaki e cols., 2000).

No laboratório foi demonstrado que a IL-1β está aumentada quando a veia safena é cultivada em regime arterial por 1 dia (Figura 3). Interessantemente, análise em enxertos de veia safena obtidos de material de necropsia mostrou aumento da IL-1β nos primeiros dias pós revascularização miocárdica por ponte de safena (Figura 7). Ainda que o aumento não tenha sido significativo neste ensaio semi-quantitativo, este dado é bastante informativo e sugestivo de que há regulação da IL-1β em enxerto de veia safena

in vivo. Deve-se considerar que nestes ensaios com amostras humanas, existem diversos

fatores que podem estar interferindo na análise, tais como: idade, histórico clínico, co- morbidades e uso de diversos agentes terapêuticos, hábitos alimentares, sedentarismo, fumo, entre outros. Pelo pequeno número de amostra, não foi possível nenhum tipo de seleção prévia dos indivíduos para inclusão no estudo.

No modelo de arterialização de veia jugular de rato foi observado, utilizando-se uma técnica sensível e quantitativa, aumento da expressão de IL-1β de 12 vezes quando comparada com a veia jugular normal. Este aumento cai gradativamente ao longo tempo, e mantém-se em níveis pouco mais elevados que a veia jugular normal (Tabela 3). Análise por imunohistoquímica mostrou um padrão de produção da IL-1β bastante interessante. Nota-se que na condição basal a IL-1β encontra-se distribuída em forma de núcleos de produção da proteína em todo o vaso (Figura 21). Quando a veia é arterializada, a produção da IL-1β passa ser localizada em regiões específicas do vaso,

sendo também observado regiões com ausência completa da proteína. Frequentemente a proteína é encontrada em locais de formação da neoíntima e também em camada adventícia do vaso, o que sugere implicações relevantes no processo de arterialização. Na literatura este aumento de produção de IL-1β também tem sido demonstrado, porém não se tem evidências diretas do seu papel funcional no enxerto venoso. Um dado interessante que obtivemos foi a indução da produção de VEGF pela IL-1β em células musculares lisas de veia safena humana (Figura 10). Pode-se sugerir que durante o processo de arterialização, a IL-1β aumentada leva ao aumento da produção de VEGF, e estes dois fatores quimiotáxicos podem estar contribuindo para a formação da neoíntima e repovoamento/espessamento do enxerto.

Sabe-se que no processo de arterialização ocorre um aumento da presença de células musculares lisas tanto na camada média como na neoíntima. Não se pode dizer ao certo se isto se dá por aumento da proliferação das células musculares lisas ou por migração de células indiferenciadas para o local. Trabalhos recentes vêm demonstrando que células indiferenciadas de tecidos adjacentes são importantes fontes de células musculares lisas responsáveis pelo remodelamento do enxerto (Zhang e cols., 1999; Matsumura e cols., 2003; Tomas e cols., 2003; Wu e cols., 2004). Dentro deste contexto, pode-se imaginar que a IL-1β aumentada nos primeiros dias de arterialização pode estar contribuindo para atrair as células mesenquimais residentes de maneira direta ou mesmo através da produção de VEGF. Estes são mecanismos que necessitam ser investigados para que o real papel da IL-1β no processo de arterialização de enxerto venoso possa ser elucidado.

Recentemente, entramos em contato com a industria farmacêutica Amgen que nos forneceu o medicamento Anakira (Kineret®). Trata-se de uma molécula recombinante, não glicosilada, do antagonista de receptor de IL-1β humano (IL-1RA), utilizado no tratamento de artrite reumatóide. Esta droga, por bloquear a ação da IL-1β, é bastante interessante para testarmos o efeito da IL-1β no processo de arterialização. Desta forma, ratos foram tratados com doses diárias de IL1RA 25 mg/Kg (SC) por 15 dias, sendo 1 dia pré-cirurgia e 14 dias pós-arterialização. Como controle foi utilizado ratos tratados com solução placebo. Dados preliminares mostram que os animais tratados com IL-1RA não apresentam diferença de área de íntima e media + adventícia, e nem mesmo de proliferação celular na veia jugular arterializada por 14 dias (Anexo III). A princípio, este seria um indicativo de que a IL-1β, apesar regulada no processo de arterialização, não implicação no processo de remodelamento do enxerto. Porém alguns pontos devem ser considerados neste experimento: 1) o tratamento foi realizado em doses diárias únicas, 2) o tratamento foi sistêmico, e 3) não existe um controle de efetividade do tratamento dos animais. Para abordar estas questões, alternativas de tratamento estão sendo contempladas para a realização de um novo experimento. A primeira delas seria a utilização de uma bomba osmótica de liberação contínua de droga, implantados subcutaneamente, que liberariam o IL-1RA em pequenas doses durante todo o dia. Isto poderia garantir a manutenção da dose desejada durante todo o tempo de tratamento do animal. Para isto, entretanto, a empresa terá que disponibilizar o peptídeo em formulação mais concentrada e não sabemos se será possível. A segunda alternativa

seria a utilização metodologias disponíveis no laboratório que permitem a intervenção desejada localmente no segmento arterializado.

O laboratório dispõe de metodologias de interferências que permitem intervenções gênicas e protéicas em sistemas biológicos. Pode-se citar a utilização de vetores virais para aumentar a expressão de genes de interesse, proteínas de fusão para aumentar o conteúdo protéico, e ainda, a tecnologia de interferência por RNA (RNAi) para diminuir a expressão do gene alvo. Assim, pode-se contemplar a utilização de vetores virais para aumentar a expressão do IL-1RA, ou ainda, a produção de RNAi contra a IL-1β para bloquear o aumento observado inicialmente no enxerto.