Turgut Özal Dönemi

Quando o material biológico ligado à superfície de um bioreceptor é uma enzima, os sensores são denominados biossensores enzimáticos. Basicamente, fazem uso da atividade enzimática como sinal analítico a ser monitorado [78]. Como vantagens podemos destacar a sensibilidade, respostas rápidas e baixo custo, alta especificidade, detecção de baixas concentrações do analito além do alto número de enzimas disponíveis comercialmente [79]. Atualmente, a construção de transdutores eletroquímicos somada aos diversos métodos analíticos descritos na literatura fortaleceu a área de biossensores para serem aplicados na área médica, farmacológica, industrial, entre outras [79]. A imobilização de enzimas é poderosa ferramenta para melhorar quase todas as propriedades enzimáticas, como a alta atividade e seletividade [80].

Para construção dos biossensores enzimáticos, a técnica mais utilizada é a de imobilização das enzimas, sendo classificadas como imobilização por adsorção, encapsulamento, ligação covalente e crosslinking (ou ligação covalente cruzada), como mostra a figura 1.15.

Figura 1.15: Desenho esquemático dos tipos de imobilizações enzimáticas, sendo: a) adsorção, b) encapsulamento, c) ligação covalente e d) ligação covalente cruzada [8]

Na imobilização por adsorção (figura 1.15(a)), dois tipos podem ocorrer, sendo a adsorção física e a adsorção iônica. Na adsorção física, a enzima fica retida na superfície do suporte por interações físicas (Van der Waals, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e interações específicas) entre a enzima e a superfície da matriz [80]. Este é o modo mais simples e rápido de imobilização e possui como vantagem pouca perturbação sobre a estrutura nativa da enzima. No entanto, a dessorção da enzima durante sua utilização é facilitada devido à falta de controle das forças de ligação envolvidas resultantes da variação de temperatura, pH e força iônica [79, 80]. Já a adsorção iônica, a adsorção entre a enzima e a superfície do suporte ocorre devido as atrações eletrostáticas entre as cargas opostas de ambos.

Na imobilização por encapsulamento (figura 1.15(b)), a enzima é confinada na membrana localizada na superfície do eletrodo. A membrana apresenta porosidade controlada, que retém a enzima de forma a permitir a livre difusão do substrato e dos produtos da reação através da mesma. No entanto, não há o controle de transferência de massa do substrato e pode ocorrer crescimento de microorganismos na superfície da membrana [79].

A imobilização por ligação covalente (figura 1.15(c)) retém a enzima na superfície do suporte por ligações covalentes entre os grupos funcionais dos resíduos de aminoácidos das enzimas e os grupos funcionais presentes na superfície do suporte. Por essa ligação ser mais forte, essa técnica tem sido comumente muito utilizada. Como principais vantagens dessa técnica, podemos citar a não dessorção das enzimas, diminuição da velocidade de desativação espontânea e aumento do tempo de vida útil do sensor. No entanto, essa técnica de imobilização também possui desvantagens, como perda de parte da atividade enzimática por conta das

alterações nas conformações dos sítios ativos da enzima (facilidade em alterar a estrutura terciária nativa da enzima) [79, 80].

Por fim, a ligação por crosslinking (figura 1.15(d)) é uma extensão da ligação covalente, e é formada por uma rede rígida, devido ao sistema reticulado das moléculas da enzimas. Com isso, as ligações são mais sólidas, no entanto, podem induzir a formação de barreiras de difusão, tendo como consequência um aumento no tempo de resposta do biossensor [79]. Neste tipo de imobilização os grupos funcionais do suporte são ativados por reagentes específicos, como o glutaraldeído, que introduz um grupo carbonila tornando possível reações com os grupos nucleofílicos da enzima [80]

Portanto, o processo de imobilização pode influenciar ou até modificar as respostas dos biossensores, pois cada metodologia apresenta suas vantagens e suas desvantagens. A técnica que será empregada deve ser cuidadosamente estudada e otimizada para resultar na construção de biossensores com sinal expressivo do processo analítico, reprodutibilidade e repetibilidade adequadas [79].

Uma enzima muito estudada para construção de biossensor é a urease, pois possui como principal vantagem a fácil imobilização. A urease foi a primeira metaloenzima a ser isolada na forma cristalina. Ela atua como um excelente catalisador da hidrólise da ureia, com alta eficiência. Mesmo sendo extraída de diferentes fontes, como leguminosas, fungos ou bactérias, possui uma estrutura comum e ativa que atua sobre o mesmo mecanismo de catálise durante a hidrólise da ureia, com diferenciação somente de uma a três cadeias de peptídeos [9]. As ureases de plantas e de fungos são trímeros ou hexâmeros com subunidade em torno 90 kDa e com cerca de 840 aminoácidos, enquanto que as ureases bacterianas são multímeros de duas ou três subunidades correspondente a fragmentos da cadeia única de ureases vegetais e fúngicas [81].

As ureases apresentam um enovelamento típico das amidohidrolases, com sítio ativo com dois átomos de níquel, seguido por um conjunto de fitas β, ambos formando a subunidade α (ou domínio α, no caso de ureases de plantas e fungos). A subunidade β apresenta predominantemente estruturas em folhas β, enquanto a subunidade γ é formada por estruturas αβ [81]. Os íons de níquel ativo são essenciais para a catálise. A figura 1.16 mostra a molécula de urease.

Figura 1.16: Molécula de urease [9]

A molécula de urease é composta por histidinas e dois átomos de níquel. A especificidade da enzima é relacionada à forma do seu centro ativo, onde na urease contém duas moléculas de água e é coordenada a um grupo OH−. A figura 1.16

mostra que o primero centro metálico de níquel é coordenado por dois átomos de nitrogênio histidínicos e um átomo de oxigênio proveniente do aminoácido lisina. Já o segundo centro metálico de níquel é composto por dois átomos de nitrogênio histidínicos e três átomos de oxigênio provenientes dos aminoácidos lisina e aspartato e da molécula de água. Durante a catálise, a ureia ocupa a posição antes ocupada por uma molécula de água.

A figura 1.17 mostra um dos mecanismos propostos para a catálise da ureia pela urease pela eliminação de duas moléculas de água, seguido da polarização do grupo carbonila da ureia pelo átomo de níquel (Ni1), ativando assim um carbono

para um ataque nucleofílico [9].

O segundo átomo de níquel (Ni2) se liga a um grupo OH− devido ao carbono

parcialmente positivo da carbonila da molécula de ureia. O grupo amina da ureia (NH2) é protonado pela histidina e eliminado formando assim o ácido carbâmico,

formando então amônia (NH3) e gás carbônico (CO2) [9].

Os valores normais de ureia no sangue humano de um adulto ocorrem em torno de 10 a 40 mg/dL, e na urina em torno de 9 a 24 mg/dL. Valores acima significam falha renal, desidratação severa, falha do coração, dieta com altos níveis de proteína, doença de fígado, entre outras [25]. Entre 180 a 400 mg/dL de ureia no sangue o paciente necessita urgente de hemodiálise.

Pensando em rápida detecção, é de grande interesse a construção de biossensores de ureia para uso médico.

Figura 1.17: Mecanismo de catálise da ureia pela enzima urease [9]

A glicose oxidase é uma flavoproteína que catalisa a oxidação da β-D-glicose pelo oxigênio molecular em gluconolactona e peróxido de hidrogênio. Essa enzima apresenta boa estabilidade, alto grau de pureza e preço acessível, além de alta seletividade ao substrato β-D-glicose [1]. Faz parte da classe das oxiredutases, que são enzimas que catalisam reações por troca de cargas ou de oxirredução pela utilização do oxigênio molecular como aceitador de elétrons, gerando assim o peróxido de hidrogênio [8].

Durante o processo de oxidação da glicose, o cofator flavina adenina dinucleotídio (FAD) é reduzido a FADH2, seguida pela oxidação do cofator

enzimático pelo oxigênio molecular formando então o peróxido de hidrogênio (H2O2), como mostra a figura 1.18. Os FADs são cofatores hidrossolúveis que

sofrem oxidações e reduções reversíveis em reações de transferência de elétrons no metabolismo [1].

Essa enzima é uma enzima globular dimérica com forma nativa contendo duas moléculas do cofator FAD que são responsáveis pelas propriedades redox da enzima.

A glicose oxidase além de apresentar muitas vantagens industriais, tem sido amplamente utilizadas para confecção de biossensores devido a sua alta

Figura 1.18: Mecanismo de catálise da glicose pela enzima glicose oxidase.

especificidade e alta estabilidade [8].

Para seres humanos saudáveis os níveis de glicose no sangue devem estar entre 82 a 110 mg/dL, chegando até 140 mg/dL após a refeição [82]. Abaixo de 70 mg/dL é considerado hipoglicemia, quando o sangue está com taxa de açucar abaixo dos valores saudáveis, enquanto que, no indivíduo em jejum, valores acima de 126 mg/dL já são considerados como acima do limite saudável e o indivíduo é considerado como diabético [83]. Existe hoje no mercado biossensores de glicose, no entanto o uso continuado necessário para o diabético acaba por sair por um alto custo, sendo então o desenvolvimento de biossensores de glicose necessário com custos mais acessíveis.

1.3 Objetivos