Kütle spektrometresi (MS), yapı aydınlatılması, organik, biyoorganik ve organometalik bileşiklerin doğrulanması ve çevre, farmasötik, adli tıp, gıda ve diğer bilimlerde miktarsal analiz için sıklıkla kullanılmaktadır. MS dedektörleri bilinmeyen maddelerin yapısal tayini ve doğrulanması için geniş ölçüde kullanılırlar (Chiu ve Muddiman 2008).
MS dedektörleri; elektrik ve/veya manyetik kuvvet alanlarını kullanarak iyonları kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayıran optik cihazlardır. MS mantığını özetlemek istersek; numuneden iyonları oluşturmak, iyonları m/z oranlarına göre ayrıştırmak ve iyonların bolluğunu ölçmektir. Kütle spektrometre dedektörleri nötr moleküllerin kütlesini doğrudan ölçemezler. Molekülü iyonlaştırarak iyonun kütle/yük (m/z) oranını ölçerler.
Kütle spektrometre cihazları üç temel birimden oluşur: numune moleküllerini gaz fazındaki iyonlara dönüştüren bir iyon kaynağı; iyonları elektromanyetik alan uygulayarak kütlelerine göre sıralayan kütle analizörü ve her bir iyonun miktarını hesaplayan bir dedektör. Kütle spektrometre tekniği hem kalitatif hem de kantitatif amaçla kullanılabilir (Yılmaz 2015).
2.11.1. LC-MS/MS (Sıvı Kromatografisi Tandem Kütle Spektrometresi)
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile birleşen LC-MS (tekli kuadrupol) ve özellikle de LC-MS/MS (üçlü kuadrupol) cihaz sistemleri bütün organik bileşikler gibi bitkilerin sekonder metabolitlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde en çok kullanılan tekniklerdendir. LC-MS cihazı ile HPLC kolonunda belli bir ayrımdan geçen analitlerin ana iyon (parent ion) da denilen moleküler iyonlarını belirleyerek bileşenlerin nicel veya nitel analizleri yapılır. Ancak, birçok fitokimyasal aynı molekül ağırlığına sahip olduğundan LC-MS cihazı tarafından belirlenen m/z oranları da aynı çıkmaktadır. Kromatografik olarak da ayrılamayan bazı moleküllerin tam olarak doğrulanması bu yöntemle mümkün olmamaktadır. Tekli kuadrupol LC-MS sistemine göre daha sofistike cihaz tasarımlarından olan LC-MS/MS sistemleri bu sorunu ortadan kadırarak molekül metanol gibi polar organik çözücülerin su ile beraber olduğu mobil fazlar ile
gerçekleştirilir.
HPLC kolonlarında, küçük ve aynı boyutlardaki partiküllere sahip dolgu materyalinin kullanılması sonucu gelen daha iyi seçicilik ve yüksek basınçlı akış, hem daha yüksek ayırma gücü hem de daha hızlı analizlere olanak sağlamıştır. Son zamanlarda UHPLC (ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi) tekniğinin ortaya çıkmasıyla sıvı kromatografisinde büyük gelişmeler olmuştur. Bu teknik sayesinde, 2 µm veya daha küçük boyuttaki parçacık boyutu ve çok yüksek basınçlarda (1300 bara kadar) çalışan pompa sistemleri ile daha kısa analiz süresi, yüksek pik etkinliği ve yüksek ayrım gücüne ulaşılır (Zotou 2012).
2.10.1. HPLC ile Beraber Kullanılan Dedektörler
HPLC cihazına UV dedektör, Diod-array dedektör (DAD), Refraktif indeks dedektörü (RID), Floresan dedektör, Elektirik iletkenlik dedektörü, Elektrokimyasal dedektör, Buharlaştırmalı ışık saçılımlı dedektör (ELSD), ve kütle spektrometre (MS) dedektörü gibi farklı tipte dedektörler bağlanıp kullanılmaktadır (Skoog ve ark. 1996). Bununla birlikte fitokimyasalların kalitatif ve kantitatif analizlerinde UV-visible ve MS dedeksiyon sistemleri günümüzde HPLC ile birlikte en çok kullanılanlardır.
UV-visible temelli dedektörler, kolondan gelen hareketli fazın içerisinden aktığı küçük bir sıvı akış hücresi içerirler. UV ışık hücrenin içinden geçer ve UV foto- dedektöre çarpar. UV absorbans dedektörleri nümuneyi bozmazlar ve sadece ışık kaynağının dalga boyundaki radyasyonu absorbe eden maddelere karşı cevap verebilirler. İki farklı türde dalgaboyu dedektörü vardır: sabit ve çoklu dalgaboyu dedektörleri. İlki ışın dalgaboyunun değiştirilmesine izin vermezken, diğeri analiti belirlemek için kısa bir dalgaboyu aralığını tarayabilir. Çoklu dalgaboyu dedektörlerinin hassasiyeti sabit dalgaboyululara göre daha kötü olmasına karşın esneklik avantajı vardır. Çözelti içerisindeki birçok bileşik elektromanyetik spektrumun UV-visible bölgesindeki ışığı absorplayabilir. Bu yüzden bu dedektörler evrensel dedektörler olarak düşünülebilir. UV-görünür bölge spektroskopisi bize molekül yapısı hakkında bilgi veremez ve belli bir desen olmayınca tam olarak bir aydınlatma sağlayamaz. Ancak bize bileşiklerin bağlı olduğu sınıflar hakkında bigi verir. Zira her molekül sınıfının
karakteristik absorpsiyon bantları vardır. Bu yüzden, kütle spektrometresi gibi tekniklere ihtiyaç vardır.
2.11. LC-MS Teknikleri
Kütle spektrometresi (MS), yapı aydınlatılması, organik, biyoorganik ve organometalik bileşiklerin doğrulanması ve çevre, farmasötik, adli tıp, gıda ve diğer bilimlerde miktarsal analiz için sıklıkla kullanılmaktadır. MS dedektörleri bilinmeyen maddelerin yapısal tayini ve doğrulanması için geniş ölçüde kullanılırlar (Chiu ve Muddiman 2008).
MS dedektörleri; elektrik ve/veya manyetik kuvvet alanlarını kullanarak iyonları kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayıran optik cihazlardır. MS mantığını özetlemek istersek; numuneden iyonları oluşturmak, iyonları m/z oranlarına göre ayrıştırmak ve iyonların bolluğunu ölçmektir. Kütle spektrometre dedektörleri nötr moleküllerin kütlesini doğrudan ölçemezler. Molekülü iyonlaştırarak iyonun kütle/yük (m/z) oranını ölçerler.
Kütle spektrometre cihazları üç temel birimden oluşur: numune moleküllerini gaz fazındaki iyonlara dönüştüren bir iyon kaynağı; iyonları elektromanyetik alan uygulayarak kütlelerine göre sıralayan kütle analizörü ve her bir iyonun miktarını hesaplayan bir dedektör. Kütle spektrometre tekniği hem kalitatif hem de kantitatif amaçla kullanılabilir (Yılmaz 2015).
2.11.1. LC-MS/MS (Sıvı Kromatografisi Tandem Kütle Spektrometresi)
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile birleşen LC-MS (tekli kuadrupol) ve özellikle de LC-MS/MS (üçlü kuadrupol) cihaz sistemleri bütün organik bileşikler gibi bitkilerin sekonder metabolitlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde en çok kullanılan tekniklerdendir. LC-MS cihazı ile HPLC kolonunda belli bir ayrımdan geçen analitlerin ana iyon (parent ion) da denilen moleküler iyonlarını belirleyerek bileşenlerin nicel veya nitel analizleri yapılır. Ancak, birçok fitokimyasal aynı molekül ağırlığına sahip olduğundan LC-MS cihazı tarafından belirlenen m/z oranları da aynı çıkmaktadır. Kromatografik olarak da ayrılamayan bazı moleküllerin tam olarak doğrulanması bu yöntemle mümkün olmamaktadır. Tekli kuadrupol LC-MS sistemine göre daha sofistike cihaz tasarımlarından olan LC-MS/MS sistemleri bu sorunu ortadan kadırarak molekül metanol gibi polar organik çözücülerin su ile beraber olduğu mobil fazlar ile
gerçekleştirilir.
HPLC kolonlarında, küçük ve aynı boyutlardaki partiküllere sahip dolgu materyalinin kullanılması sonucu gelen daha iyi seçicilik ve yüksek basınçlı akış, hem daha yüksek ayırma gücü hem de daha hızlı analizlere olanak sağlamıştır. Son zamanlarda UHPLC (ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi) tekniğinin ortaya çıkmasıyla sıvı kromatografisinde büyük gelişmeler olmuştur. Bu teknik sayesinde, 2 µm veya daha küçük boyuttaki parçacık boyutu ve çok yüksek basınçlarda (1300 bara kadar) çalışan pompa sistemleri ile daha kısa analiz süresi, yüksek pik etkinliği ve yüksek ayrım gücüne ulaşılır (Zotou 2012).
2.10.1. HPLC ile Beraber Kullanılan Dedektörler
HPLC cihazına UV dedektör, Diod-array dedektör (DAD), Refraktif indeks dedektörü (RID), Floresan dedektör, Elektirik iletkenlik dedektörü, Elektrokimyasal dedektör, Buharlaştırmalı ışık saçılımlı dedektör (ELSD), ve kütle spektrometre (MS) dedektörü gibi farklı tipte dedektörler bağlanıp kullanılmaktadır (Skoog ve ark. 1996). Bununla birlikte fitokimyasalların kalitatif ve kantitatif analizlerinde UV-visible ve MS dedeksiyon sistemleri günümüzde HPLC ile birlikte en çok kullanılanlardır.
UV-visible temelli dedektörler, kolondan gelen hareketli fazın içerisinden aktığı küçük bir sıvı akış hücresi içerirler. UV ışık hücrenin içinden geçer ve UV foto- dedektöre çarpar. UV absorbans dedektörleri nümuneyi bozmazlar ve sadece ışık kaynağının dalga boyundaki radyasyonu absorbe eden maddelere karşı cevap verebilirler. İki farklı türde dalgaboyu dedektörü vardır: sabit ve çoklu dalgaboyu dedektörleri. İlki ışın dalgaboyunun değiştirilmesine izin vermezken, diğeri analiti belirlemek için kısa bir dalgaboyu aralığını tarayabilir. Çoklu dalgaboyu dedektörlerinin hassasiyeti sabit dalgaboyululara göre daha kötü olmasına karşın esneklik avantajı vardır. Çözelti içerisindeki birçok bileşik elektromanyetik spektrumun UV-visible bölgesindeki ışığı absorplayabilir. Bu yüzden bu dedektörler evrensel dedektörler olarak düşünülebilir. UV-görünür bölge spektroskopisi bize molekül yapısı hakkında bilgi veremez ve belli bir desen olmayınca tam olarak bir aydınlatma sağlayamaz. Ancak bize bileşiklerin bağlı olduğu sınıflar hakkında bigi verir. Zira her molekül sınıfının