LC-MS/MS Metot Validasyon Çalışmaları

Metodun performans özelliklerinin belirlenmesi için kapsamlı validasyon çalışmaları yapılmıştır (Çizelge 4.11.). Bu amaçla metot validasyonu kapsamında doğrusallık (lineerite), gerçeklik (geri kazanım), kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik), belirleme ve tayin alt sınırı (LOD/LOQ) ile bağıl standart belirsizlik (U= % 95 güven seviyesinde (k=2) parametreleri değerlendirilmiştir. Metodun gerçeklik ve

kesinlik çalışmaları için seçilen bir tür Trabzon ilinden toplanan E. macroclada türü metanol ekstresine aynı günde altı defa ve farklı günler içerisinde (3 farklı günde) altışar defa üç farklı derişimlerde (düşük, orta ve yüksek) her bileşen standartın kalibrasyonuna göre standart ekleme yapılarak gerçekleştirilmiştir. Aynı gün ve farklı günlerde yapılan çalışmalar sonucunda, gerçeklik ve kesinliği belirlemek üzere geri kazanım ve RSD (bağıl standart sapma) değerleri hesaplanmıştır. Standart bileşenlerin belirleme (LOD) ve tayin (LOQ) alt sınırlarının tespit edilmesinde belirlenen bir ekstreden hazırlanan 10 eş örneğe standartın sinyal verdiği en düşük derişimde standart ekleme yapılarak cihaza enjekte edilmiştir. Analitlerin standart bağıl belirsizlikleri (U95_{) EURACHEM Guide’a}

göre gerçeklik (geri kazanım) ve kesinlik çalışmalarıyla belirlenmiştir. Validasyon çalışmalarında kullanılan bazı eşitlikler aşağıdaki verilmiştir. Aşağıda sadece eugenol için validasyon çalışmalarının detayları olarak (gerçeklik, kesinlik ve belirsizlik) verilmiştir (Çizelge 4.13.). Diğer fitokimyasallara ilişkin validasyon çalışmalarına ait Çizelgeler Ek 36- 68.'de verilmiştir.

Şekil 4.5. LC-MS/MS metodundaki eugenol analitinin kalibrasyon grafiği

4.9.6. LC-MS/MS Analizine İlişkin Standart ve Numune Kromatogramları

Çalışılan Euphorbia türlerinin tohum, kök, dal, yaprak, çiçek ve karışık kısımlarının metanol ekstrelerinin LC-MS/MS metodu ile taranmasına ilişkin standart ve örnek kromatogram Şekil 4.6. ve 4.7.’de diğer kısımlara ait kromatogramlar Ek 69-129.’da verilmiştir. Aşağıda sadece örnek olarak kalibrasyon noktası 5 standartı ve E. eriophora karışık kısmının metanol ekstresinin kromatogramları verilmiştir.

Şekil 4.7. E. eriophora karışık kısmının metanol ekstresinin standart kromatogramı

4.9.7. LC-MS/MS Metot Validasyon Çalışmaları

Metodun performans özelliklerinin belirlenmesi için kapsamlı validasyon çalışmaları yapılmıştır (Çizelge 4.11.). Bu amaçla metot validasyonu kapsamında doğrusallık (lineerite), gerçeklik (geri kazanım), kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik), belirleme ve tayin alt sınırı (LOD/LOQ) ile bağıl standart belirsizlik (U= % 95 güven seviyesinde (k=2) parametreleri değerlendirilmiştir. Metodun gerçeklik ve

kesinlik çalışmaları için seçilen bir tür Trabzon ilinden toplanan E. macroclada türü metanol ekstresine aynı günde altı defa ve farklı günler içerisinde (3 farklı günde) altışar defa üç farklı derişimlerde (düşük, orta ve yüksek) her bileşen standartın kalibrasyonuna göre standart ekleme yapılarak gerçekleştirilmiştir. Aynı gün ve farklı günlerde yapılan çalışmalar sonucunda, gerçeklik ve kesinliği belirlemek üzere geri kazanım ve RSD (bağıl standart sapma) değerleri hesaplanmıştır. Standart bileşenlerin belirleme (LOD) ve tayin (LOQ) alt sınırlarının tespit edilmesinde belirlenen bir ekstreden hazırlanan 10 eş örneğe standartın sinyal verdiği en düşük derişimde standart ekleme yapılarak cihaza enjekte edilmiştir. Analitlerin standart bağıl belirsizlikleri (U95_{) EURACHEM Guide’a}

göre gerçeklik (geri kazanım) ve kesinlik çalışmalarıyla belirlenmiştir. Validasyon çalışmalarında kullanılan bazı eşitlikler aşağıdaki verilmiştir. Aşağıda sadece eugenol için validasyon çalışmalarının detayları olarak (gerçeklik, kesinlik ve belirsizlik) verilmiştir (Çizelge 4.13.). Diğer fitokimyasallara ilişkin validasyon çalışmalarına ait Çizelgeler Ek 36- 68.'de verilmiştir.

Şekil 4.5. LC-MS/MS metodundaki eugenol analitinin kalibrasyon grafiği

4.9.6. LC-MS/MS Analizine İlişkin Standart ve Numune Kromatogramları

Çalışılan Euphorbia türlerinin tohum, kök, dal, yaprak, çiçek ve karışık kısımlarının metanol ekstrelerinin LC-MS/MS metodu ile taranmasına ilişkin standart ve örnek kromatogram Şekil 4.6. ve 4.7.’de diğer kısımlara ait kromatogramlar Ek 69-129.’da verilmiştir. Aşağıda sadece örnek olarak kalibrasyon noktası 5 standartı ve E. eriophora karışık kısmının metanol ekstresinin kromatogramları verilmiştir.

Çizelge 4.13. Eugenol için aynı gün ve farklı günlerde yapılan gerçeklik (geri kazanım) ve kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik) çalışmaları

Eugenol Spike _{Yok (25 ppb)} D. spike _Kaz. G. G. Kaz. _{(%) (100 ppb)} O. spike _Kaz. G. G. Kaz. _{(%) (500 ppb)} Y. spike _Kaz. G. G. Kaz. _(%) 4.71 29.56 99.63 1.00 104.67 100.02 1.00 500.78 99.23 0.99 4.58 30.03 101.51 1.02 101.99 97.34 0.97 494.76 98.02 0.98 Aynı Gün 4.56 28.99 97.35 0.97 103.21 98.56 0.99 504.34 99.94 1.00 4.69 29.79 100.55 1.01 105.67 101.02 1.01 500.12 99.09 0.99 4.70 30.67 104.07 1.04 104.56 99.91 1.00 510.45 101.16 1.01 4.68 29.87 100.87 1.01 104.99 100.34 1.00 507.23 100.52 1.01 Ort. 4.65 29.82 100.66 1.01 104.18 99.53 1.00 502.95 99.66 1.00 Std 0.066 0.553 2.210 0.022 1.341 1.341 0.013 5.591 1.118 0.011 RSD 0.014 0.019 0.022 0.022 0.013 0.013 0.013 0.011 0.011 0.011 4.67 29.09 97.68 0.98 101.34 96.67 0.97 499.67 99.00 0.99 4.60 30.31 102.56 1.03 103.67 99.00 0.99 498.98 98.86 0.99 F. Günler (1) 4.68 29.89 100.88 1.01 105.76 101.09 1.01 500.34 99.13 0.99 4.70 29.54 99.48 0.99 106.43 101.76 1.02 512.67 101.60 1.02 4.67 28.98 97.24 0.97 105.78 101.11 1.01 510.54 101.17 1.01 4.65 29.99 101.28 1.01 105.34 100.67 1.01 498.45 98.76 0.99 4.70 30.12 101.80 1.02 101.57 96.90 0.97 498.23 98.71 0.99 4.69 30.09 101.68 1.02 103.56 98.89 0.99 490.45 97.16 0.97 F. Günler (2) 4.66 29.89 100.88 1.01 104.76 100.09 1.00 503.34 99.73 1.00 4.64 29.86 100.76 1.01 103.54 98.87 0.99 505.38 100.14 1.00 4.68 29.99 101.28 1.01 107.21 102.54 1.03 502.65 99.60 1.00 4.66 30.43 103.04 1.03 107.56 102.89 1.03 499.88 99.04 0.99 4.72 29.78 100.44 1.00 105.43 100.76 1.01 490.56 97.18 0.97 F. Günler (3) 4.69 28.99 97.28 0.97 106.54 101.87 1.02 496.89 98.44 0.98 4.66 29.89 100.88 1.01 104.78 100.11 1.00 494.77 98.02 0.98 4.67 30.33 102.64 1.03 106.56 101.89 1.02 496.67 98.40 0.98 4.64 30.23 102.24 1.02 103.45 98.78 0.99 498.78 98.82 0.99 4.69 29.58 99.64 1.00 103.65 98.98 0.99 510.56 101.18 1.01 F.G.Ort. 4.67 29.83 100.65 1.01 104.83 100.16 1.00 500.49 99.16 0.99 F.G.Std 0.028 0.443 1.773 0.018 1.794 1.794 0.018 6.243 1.249 0.012 F.G.RSD 0.006 0.015 0.018 0.018 0.017 0.018 0.018 0.012 0.013 0.013 Gen.Ort 4.67 29.83 100.65 1.0065 104.67 100.00 1.0000 501.10 99.29 0.9929 Gen.Std 0.0395 0.4600 1.8399 0.0184 1.6889 1.6876 0.0169 6.0654 1.2133 0.0121 Gen.RSD 0.0085 0.0154 0.0183 0.0183 0.0161 0.0169 0.0169 0.0121 0.0122 0.0122 RSD (Pool) 0.013384

RSD: bağıl standart sapma, Ort.: ortalama, Std.:standart sapma Ortalama ( )= (x1+ x2... xn)/n Standart Sapma 2 1 1 N _{( )} i i x x N



 



 RSD= Standart sapma/Ortalama

Geri Kazanım=100×Bulunan miktar/ standart ekleme yapılan miktar % Geri Kazanım=Geri kazanım/100

LOD=Ortalama+3×Standart Sapma LOQ= Ortalama+10×Standart Sapma

Çizelge 4.13. Eugenol için aynı gün ve farklı günlerde yapılan gerçeklik (geri kazanım) ve kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik) çalışmaları

Eugenol Spike _{Yok (25 ppb)} D. spike _Kaz. G. G. Kaz. _{(%) (100 ppb)} O. spike _Kaz. G. G. Kaz. _{(%) (500 ppb)} Y. spike _Kaz. G. G. Kaz. _(%) 4.71 29.56 99.63 1.00 104.67 100.02 1.00 500.78 99.23 0.99 4.58 30.03 101.51 1.02 101.99 97.34 0.97 494.76 98.02 0.98 Aynı Gün 4.56 28.99 97.35 0.97 103.21 98.56 0.99 504.34 99.94 1.00 4.69 29.79 100.55 1.01 105.67 101.02 1.01 500.12 99.09 0.99 4.70 30.67 104.07 1.04 104.56 99.91 1.00 510.45 101.16 1.01 4.68 29.87 100.87 1.01 104.99 100.34 1.00 507.23 100.52 1.01 Ort. 4.65 29.82 100.66 1.01 104.18 99.53 1.00 502.95 99.66 1.00 Std 0.066 0.553 2.210 0.022 1.341 1.341 0.013 5.591 1.118 0.011 RSD 0.014 0.019 0.022 0.022 0.013 0.013 0.013 0.011 0.011 0.011 4.67 29.09 97.68 0.98 101.34 96.67 0.97 499.67 99.00 0.99 4.60 30.31 102.56 1.03 103.67 99.00 0.99 498.98 98.86 0.99 F. Günler (1) 4.68 29.89 100.88 1.01 105.76 101.09 1.01 500.34 99.13 0.99 4.70 29.54 99.48 0.99 106.43 101.76 1.02 512.67 101.60 1.02 4.67 28.98 97.24 0.97 105.78 101.11 1.01 510.54 101.17 1.01 4.65 29.99 101.28 1.01 105.34 100.67 1.01 498.45 98.76 0.99 4.70 30.12 101.80 1.02 101.57 96.90 0.97 498.23 98.71 0.99 4.69 30.09 101.68 1.02 103.56 98.89 0.99 490.45 97.16 0.97 F. Günler (2) 4.66 29.89 100.88 1.01 104.76 100.09 1.00 503.34 99.73 1.00 4.64 29.86 100.76 1.01 103.54 98.87 0.99 505.38 100.14 1.00 4.68 29.99 101.28 1.01 107.21 102.54 1.03 502.65 99.60 1.00 4.66 30.43 103.04 1.03 107.56 102.89 1.03 499.88 99.04 0.99 4.72 29.78 100.44 1.00 105.43 100.76 1.01 490.56 97.18 0.97 F. Günler (3) 4.69 28.99 97.28 0.97 106.54 101.87 1.02 496.89 98.44 0.98 4.66 29.89 100.88 1.01 104.78 100.11 1.00 494.77 98.02 0.98 4.67 30.33 102.64 1.03 106.56 101.89 1.02 496.67 98.40 0.98 4.64 30.23 102.24 1.02 103.45 98.78 0.99 498.78 98.82 0.99 4.69 29.58 99.64 1.00 103.65 98.98 0.99 510.56 101.18 1.01 F.G.Ort. 4.67 29.83 100.65 1.01 104.83 100.16 1.00 500.49 99.16 0.99 F.G.Std 0.028 0.443 1.773 0.018 1.794 1.794 0.018 6.243 1.249 0.012 F.G.RSD 0.006 0.015 0.018 0.018 0.017 0.018 0.018 0.012 0.013 0.013 Gen.Ort 4.67 29.83 100.65 1.0065 104.67 100.00 1.0000 501.10 99.29 0.9929 Gen.Std 0.0395 0.4600 1.8399 0.0184 1.6889 1.6876 0.0169 6.0654 1.2133 0.0121 Gen.RSD 0.0085 0.0154 0.0183 0.0183 0.0161 0.0169 0.0169 0.0121 0.0122 0.0122 RSD (Pool) 0.013384

RSD: bağıl standart sapma, Ort.: ortalama, Std.:standart sapma Ortalama ( )= (x1+ x2... xn)/n Standart Sapma 2 1 1 N _{( )} i i x x N



 



 RSD= Standart sapma/Ortalama

Geri Kazanım=100×Bulunan miktar/ standart ekleme yapılan miktar % Geri Kazanım=Geri kazanım/100

LOD=Ortalama+3×Standart Sapma LOQ= Ortalama+10×Standart Sapma

E. denticulata türü incelendiğinde; kinik asit, türün tüm ekstrelerinde, rutin, hesperidin, protokateşik asit, eugenol ve p-kumarik asit EDKL ekstresinde, skopoletin ise EDKR ve EDKB ekstrelerinde daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Çalışılan diğer bileşikler (pisetannol, kavain, krisofanik asit ve resiniferatoksin) yapılan metod çalışmasında belirlenen gözlenebilir sınırının altında kalmıştır (Çizelge 4.16.).

E. aleppica türü incelendiğinde; kinik asitin EADS ve EADL1 ekstrelerinde, eugenol, p-kumarik asitin EADL ekstresinde ve skopoletin ise türün EADB ekstresinde daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Çalışılan diğer bileşikler (protokateşik asit, pisetannol, kavain, rutin, hesperidin, krisofanik asit ve resiniferatoksin) yapılan metod çalışmasında belirlenen gözlenebilir sınırının altında kalmıştır (Çizelge 4.16.).

E. eriophora türüne bakıldığında; kinik asit EEDF ve EEDM ekstrelerinde, eugenol ve p-kumarik asit EEDB ekstresinde fazla olduğu belirlenmiştir. Pisetannol, kavain, rutin, hesperidin, krisofanik asit ve resiniferatoksin fitokimyasalları ise geliştirilen metotta dedeksiyon limitinin altında kalmıştır (Çizelge 4.16.).

E. grisophylla türüne bakıldığında; rutin, eugenol, hesperidin, kinik asit EGVL ekstresinde, p-kumarik asit EGVS ekstresinde ve skopoletin ise EGVR ekstresinde daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Çalışılan diğer fitokimyasal bileşikler dedeksiyon limitinin altında kaldığından miktarsal tayinleri yapılamamıştır (Çizelge 4.16.).

E. seguieriana türü incelendiğinde; kinik asit türün tüm ekstrelerinde, protokateşik ve p-kumarik asit ESDF ekstresinde, rutin ve hesperidin ESDM ekstresinde, eugenol ve kavain ESDR ekstesinde daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Pisetannol, kavain, krisofanik asit ve resiniferatoksin fitokimyasalları ise geliştirilen metotta dedeksiyon limitinin altında kalmıştır (Çizelge 4.16.).

E. fistulosa türü incelendiğinde; kinik asit, skopoletin, eugenol ve protokateşik asit EFDF ekstresinde, rutin ve hesperidin EFDL ekstresinde ve p-kumarik asit ise EFDM ekstresinde daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Pisetannol, kavain, krisofanik asit ve resiniferatoksin fitokimyasalları ise geliştirilen metotta dedeksiyon limitinin altında kalmıştır (Çizelge 4.16.).

Çizelge 4.14. Eugenol için yapılan gerçeklik ve kesinlik çalışmaları

Analit G.K.Çal. _(µg/L) Ortalama % Geri _{Kazanım Son.st.Sapma} Analiz % G. Kazanım St. _Sap. RSD Paralel _Sayısı

25 1.0065 0.4600 0.0184 _0.0154 24 Eugenol 100 1.0000 1.6889 0.0169 _0.0161 24 500 0.9929 6.0654 0.0121 _0.0121 24 Ort 0.9998 0.0158 _0.0146 n=72 karakök n: 8.485281 Standard belirsizlik: 0.001862

Çizelge 4.15. Eugenol için yapılan k=2 ve % 95 güven aralığında yapılan belirsizlik çalışması

Belirsizlik Kaynakları x Değeri Standart Belirsizlik _{u(x) Belirsizlik u(x)/x} Rölatif Standart

Kesinlik 1 0.013384 _(RSDPool) 0.013384 ( c) _(RSDPool/1)

Bias _{Ortalama % G. Kazanım} 0.999800 (a) _{Standart Belirsizlik} 0.001862 (b) 0.001862 (b/a)

Birleştirilmiş rölatif Standart Belirsizlik u(Pop)/Pop 0.013513

(Karekök (c2_+d2₎₎

Genişletilmiş belirsizlik (k=2. % 95 Güven aralığı) 0.027026 _(2xe)

4.10. Metanol Ekstrelerinin LC-MS/MS ile Kantitatif Analizinin

Belgede Bazı Euphorbia türlerinin ağır metal ve türe özgü sekonder metabolit içeriklerinin LC-MS/MS, LC-MS-IT-TOF ve ICP-MS ile metot validasyonu ; antioksidan ve antikanser özelliklerinin belirlenmesi (sayfa 116-120)