LC-MS/MS Metodundaki Analitlerin Kalibrasyon Grafikleri

11 adet fitokimyasal standart maddenin LC-MS/MS metodu ile kalitatif ve kantitatif analizini gerçekleştirmek üzere 6 noktalı kalibrasyon grafikleri çizilmiştir. Örnek olarak eugenol fitokimyasalı için kalibrasyon grafiği ve denklemi Şekil 4.5.’te verilmiştir. Kalibrasyon eğrilerine ait diğer grafikler, denklemler ve belirleme katsayıları (R2_{) Ek 34.'te verilmiştir.}

4.9. LC-MS/MS Metod Validasyon Parametreleri

Metodun performans özellikleri standart çözeltiler, standart ekleme (spike) yapılmış ve yapılmamış numunelere uygulanarak belirlenmiştir. Bu amaçla metot validasyonu kapsamında doğrusallık (lineerite), gerçeklik (geri kazanım), kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik), belirleme ve tayin alt sınırı (LOD/LOQ) ile bağıl standart belirsizlik (U= 95% güven seviyesinde (k=2)) parametreleri değerlendirilmiştir. Validasyon çalışmalarına ilişkin parametreler Çizelge 4.11.'de gösterilmiştir

4.9.1. Doğrusallık (Lineerite)

11 adet fitokimyasal standart maddenin kalitatif ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için gruplandırma yapılarak 6 farklı konsantrasyon aralığında (Çizelge 4.12.) kalibrasyon eğrileri çizilmiştir. LC-MS/MS metodundaki standartların lineer aralığının belirlenmesi için 3 tekrarlı 6 noktalı kalibrasyon eğrileri çizilmiştir.

Kalibrasyon eğrilerine ait denklemler ve belirleme katsayıları (R2_{) Çizelge 4.11.'de}

verilmiştir.

Çizelge 4.12. Standart maddeler için kullanılan kalibrasyon noktalarının konsantrasyonları

Grup Analitler Kalib-1 Kalib-2 Kalib-3 Kalib-4 Kalib-5 Kalib-6

1 Hesperidin, Rutin 250 500 1000 2500 5000 10000

2 Kavain, Resiniferatoksin 5 10 20 50 100 200

3 Kinik asit 500 1000 2000 5000 10000 20000

4 Protokateşik asit 50 100 200 500 1000 200

5 Piseatannol, p-Kumarik asit 100 200 400 1000 2000 4000 6 Eugenol, Skopoletin, Krisofanik asit 25 50 100 250 500 1000

Kalibrasyon noktarının konsantrasyonları (μg/L ) olarak kullanılmıştır

4.9.2. Gerçeklik (Geri Kazanım) ve Kesinlik (Tekrarlanabilirlik)

Metodun gerçeklik ve kesinlik çalışmaları, seçilen bir Euphorbia türü metanol ekstresine aynı günde altı defa ve farklı günler içerisinde (3 farklı günde) altışar defa üç farklı konsantrasyonda (düşük, orta ve yüksek) her standardın kalibrasyonuna göre standart ekleme yapılarak gerçekleştirilmiştir. Aynı gün ve farklı günlerde yapılan çalışmalar sonucunda, gerçeklik ve kesinliği belirlemek üzere geri kazanım ve % RSD

değerleri bulunmuştur (Çizelge 4.11). Ayrıca gerçeklik ve kesinlik çalışmalarına ilişkin veriler Ek 36-68.’de verilmiştir.

4.9.3. Belirleme ve Tayin Alt Sınırları (LOD/LOQ)

LC-MS/MS metodunda kullanılan standartların belirleme (LOD) ve tayin (LOQ) alt sınırlarının tespit edilmesinde analit içermeyen bir ekstreden hazırlanan 10 eş örneğe standardın sinyal verdiği en düşük derişimde standart ekleme yapılarak cihaza enjekte edilmiştir. LOD ve LOQ değerleri aşağıdaki eşitliklere göre hesaplanmıştır (Çizelge 4. 11.).

LOD=Ortalama+3×Standart Sapma LOQ= Ortalama+10×Standart Sapma

Ayrıca LOD ve LOQ çalışmalarına ilişkin veriler Ek 35.’te verilmiştir.

4.9.4. Bağıl Standart Belirsizlik (U95₎

Analitlerin standart bağıl belirsizlikleri EURACHEM Guide’a göre gerçeklik (geri kazanım) ve kesinlik çalışmalarıyla belirlenmiştir (EURACHEM CITAC Guide, 2004). Herbir analit için yapılan belirsizlik çalışmalarının detayları Ek 36-68.’de verilmiştir.

4.9.5. LC-MS/MS Metodundaki Analitlerin Kalibrasyon Grafikleri

11 adet fitokimyasal standart maddenin LC-MS/MS metodu ile kalitatif ve kantitatif analizini gerçekleştirmek üzere 6 noktalı kalibrasyon grafikleri çizilmiştir. Örnek olarak eugenol fitokimyasalı için kalibrasyon grafiği ve denklemi Şekil 4.5.’te verilmiştir. Kalibrasyon eğrilerine ait diğer grafikler, denklemler ve belirleme katsayıları (R2_{) Ek 34.'te verilmiştir.}

4.9. LC-MS/MS Metod Validasyon Parametreleri

Metodun performans özellikleri standart çözeltiler, standart ekleme (spike) yapılmış ve yapılmamış numunelere uygulanarak belirlenmiştir. Bu amaçla metot validasyonu kapsamında doğrusallık (lineerite), gerçeklik (geri kazanım), kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik), belirleme ve tayin alt sınırı (LOD/LOQ) ile bağıl standart belirsizlik (U= 95% güven seviyesinde (k=2)) parametreleri değerlendirilmiştir. Validasyon çalışmalarına ilişkin parametreler Çizelge 4.11.'de gösterilmiştir

4.9.1. Doğrusallık (Lineerite)

11 adet fitokimyasal standart maddenin kalitatif ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için gruplandırma yapılarak 6 farklı konsantrasyon aralığında (Çizelge 4.12.) kalibrasyon eğrileri çizilmiştir. LC-MS/MS metodundaki standartların lineer aralığının belirlenmesi için 3 tekrarlı 6 noktalı kalibrasyon eğrileri çizilmiştir.

Kalibrasyon eğrilerine ait denklemler ve belirleme katsayıları (R2_{) Çizelge 4.11.'de}

verilmiştir.

Çizelge 4.12. Standart maddeler için kullanılan kalibrasyon noktalarının konsantrasyonları

Grup Analitler Kalib-1 Kalib-2 Kalib-3 Kalib-4 Kalib-5 Kalib-6

1 Hesperidin, Rutin 250 500 1000 2500 5000 10000

2 Kavain, Resiniferatoksin 5 10 20 50 100 200

3 Kinik asit 500 1000 2000 5000 10000 20000

4 Protokateşik asit 50 100 200 500 1000 200

5 Piseatannol, p-Kumarik asit 100 200 400 1000 2000 4000 6 Eugenol, Skopoletin, Krisofanik asit 25 50 100 250 500 1000

Kalibrasyon noktarının konsantrasyonları (μg/L ) olarak kullanılmıştır

4.9.2. Gerçeklik (Geri Kazanım) ve Kesinlik (Tekrarlanabilirlik)

Metodun gerçeklik ve kesinlik çalışmaları, seçilen bir Euphorbia türü metanol ekstresine aynı günde altı defa ve farklı günler içerisinde (3 farklı günde) altışar defa üç farklı konsantrasyonda (düşük, orta ve yüksek) her standardın kalibrasyonuna göre standart ekleme yapılarak gerçekleştirilmiştir. Aynı gün ve farklı günlerde yapılan çalışmalar sonucunda, gerçeklik ve kesinliği belirlemek üzere geri kazanım ve % RSD

Şekil 4.7. E. eriophora karışık kısmının metanol ekstresinin standart kromatogramı

4.9.7. LC-MS/MS Metot Validasyon Çalışmaları

Metodun performans özelliklerinin belirlenmesi için kapsamlı validasyon çalışmaları yapılmıştır (Çizelge 4.11.). Bu amaçla metot validasyonu kapsamında doğrusallık (lineerite), gerçeklik (geri kazanım), kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik), belirleme ve tayin alt sınırı (LOD/LOQ) ile bağıl standart belirsizlik (U= % 95 güven seviyesinde (k=2) parametreleri değerlendirilmiştir. Metodun gerçeklik ve

kesinlik çalışmaları için seçilen bir tür Trabzon ilinden toplanan E. macroclada türü metanol ekstresine aynı günde altı defa ve farklı günler içerisinde (3 farklı günde) altışar defa üç farklı derişimlerde (düşük, orta ve yüksek) her bileşen standartın kalibrasyonuna göre standart ekleme yapılarak gerçekleştirilmiştir. Aynı gün ve farklı günlerde yapılan çalışmalar sonucunda, gerçeklik ve kesinliği belirlemek üzere geri kazanım ve RSD (bağıl standart sapma) değerleri hesaplanmıştır. Standart bileşenlerin belirleme (LOD) ve tayin (LOQ) alt sınırlarının tespit edilmesinde belirlenen bir ekstreden hazırlanan 10 eş örneğe standartın sinyal verdiği en düşük derişimde standart ekleme yapılarak cihaza enjekte edilmiştir. Analitlerin standart bağıl belirsizlikleri (U95_{) EURACHEM Guide’a}

göre gerçeklik (geri kazanım) ve kesinlik çalışmalarıyla belirlenmiştir. Validasyon çalışmalarında kullanılan bazı eşitlikler aşağıdaki verilmiştir. Aşağıda sadece eugenol için validasyon çalışmalarının detayları olarak (gerçeklik, kesinlik ve belirsizlik) verilmiştir (Çizelge 4.13.). Diğer fitokimyasallara ilişkin validasyon çalışmalarına ait Çizelgeler Ek 36- 68.'de verilmiştir.

Şekil 4.5. LC-MS/MS metodundaki eugenol analitinin kalibrasyon grafiği