3.2.1. Pesquisa quantitativa de Cryptosporidium spp. e de Giardia spp.
Foi coletado um volume de 2 L de água em galão de plástico que foi previamente sanitizado com solução de hipoclorito de sódio a 12,5%, enxaguado com solução de tiossulfato de sódio a 52% e água destilada esterilizada segundo Ferguson et al. (1996).
Para avaliação da ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. e de cistos de
Giardia spp. em água de irrigação foi empregado o procedimento de filtração em
membrana para análise da presença de protozoários em água, conforme descrito por Franco et al. (2001a).
Inicialmente, o volume coletado foi filtrado em membrana de ésteres de celulose (Millipore®) com porosidade nominal de 1,2 µm , para água de poço, mina e nascente ou de 3,0 µm, para água do córrego ou para água de poço, mina e nascente quando apresentavam alto grau de turbidez, com o auxílio de bomba de vácuo (Millipore®) com ajuste no fluxo para 4 L.min-1. Após a filtração, a membrana foi retirada com auxílio de pinça previamente esterilizada em autoclave a 121 ºC por 15 min e colocada em uma miniplaca descartável de 48 mm de diâmetro. Os (oo)cistos eventualmente presentes nas amostras foram recuperados da membrana mediante extração mecânica por meio de raspagem da superfície da membrana com alças plásticas durante 10 min e lavagem com solução de eluição de Tween 80 a 0,01% por duas vezes consecutivas. Todo o líquido resultante dessa etapa foi recolhido em um tubo de centrífuga, até que o volume de 12 a 15 mL fosse atingido. A centrífugo-concentração foi realizada a 1050 x
g por 15 min. Com o auxílio de pipeta de Pasteur, o sobrenadante foi aspirado
cuidadosamente até a graduação de 900 µL, de modo a manter o sedimento intacto. Esse material foi agitado em vórtex por 3 min e imediatamente transferido para um tubo com tampa apegada (Eppendorf®), onde foram adicionados 100 µL de solução de formalina a 5%, mantendo-se um volume final de 1000 µL. Dessa forma, o material concentrado que foi acondicionado no tubo com tampa apegada foi armazenado a 6 ºC ± 1 ºC, até o momento de enumeração dos (oo)cistos.
Para controle de qualidade dessa análise, alguns cuidados foram tomados. Após a filtração da amostra a ser concentrada, foi adicionado 1 L de solução de eluição ao
membrana separadamente e analisado isoladamente da mesma forma como foi realizado com a amostra de água. O resultado dessa análise deveria ser sempre negativo, caso contrário, poderia ocorrer perda de (oo)cistos por adesão ao recipiente usado para coleta.
3.2.1.1. Visualização e quantificação de (oo)cistos
Para a quatificação dos (oo)cistos em amostras de água foi utilizado o kit diagnóstico Merifluor® (Meridian Bioscience, Inc.) que se baseia na técnica de imunofluorescência direta in vitro para detecção simultânea de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. na amostra, conferindo uma fluorescência típica aos (oo)cistos pesquisados. O reagente de detecção do kit Merifluor® contém uma mistura de anticorpos monoclonais marcada com isotiocianato de fluoresceína direcionados contra os antígenos da parede celular de cistos de Giardia spp. e oocistos de
Cryptosporidium spp., cuja diferenciação se dá por aspectos morfológicos e por
tamanhos: cistos de Giardia spp. apresentam DȝPHRRFLVWRVGHCryptosporidium spp. DȝP$VHQVLELOLGDGHGRkit varia de 97 % a 100 % e a especificidade de 94 % a 100% para Cryptosporidium spp. e para Giardia spp., ambas são de 100% (MeriFluor® Cryptosporidium/Giardia, 2004).
Os procedimentos adotados seguiram as recomendações do fabricante. Para realização da técnica foram utilizadas alíquotas de 10 µL de cada amostra concentrada. As lâminas preparadas foram observadas sob microscopia de epifluorescência (Microscópio Leica DC 300F) sob aumento de 400 x para realização das contagens.
O número de (oo)cistos nas amostras e o volume do sedimento foram utilizados para o cálculo do número de (oo)cistos.L-1, de acordo com a equação (1) a seguir (FARIAS et al., 2002): V P S O B u u (1) Em que: B = nº (oo)cistos.L-1;
S = volume de sedimento, em mL, gerado após centrifugação; P = volume de amostra, em mL, adicionada em cada pocinho; V = volume da amostra em L, usada para retirada de oocistos.
3.2.2. Quantificação de esporos anaeróbios e de Clostridium perfringens
Para a pesquisa de esporos anaeróbios e de Clostridium perfringens foi empregada a técnica de membrana filtrante, segundo Health Protection Agency (2004). Inicialmente, a amostra foi tratada a 60°C por 15 min, em seguida, resfriada em banho de gelo e filtrada em sistema de vácuo, através de membrana de poros de 0,45 µm. Diluições seriadas foram realizadas nas amostras a fim de obter um resultado final de crescimento sempre inferior a 200 UFC por membrana. Após a filtração, a membrana foi disposta em placas com meio Triptose Sulfito Cicloserina, TSC (Himedia®), sendo
essas incubadas em jarra com gerador de anaerobiose (Probac®) a 35 °C por 24 h. Todas as colônias crescidas nas placas eram consideradas esporos anaeróbios.
Foram selecionadas de 5 a 10 colônias típicas para serem transferidas para meio tioglicolato (Himedia®) e, posteriormente, incubadas a 35 °C por 24 h. A seguir, foram realizadas as seguintes provas bioquímicas para a confirmação das colônias típicas de Clostridium perfringens:
(i) Coloração de Gram: A partir de cultura pura em ágar estoque ou dos meios usados paralelamente, foi preparado o esfregaço e corado, para a observação de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos;
(ii) Fermentação tempestuosa: Foi transferido 1 mL da cultura fresca obtida no meio tioglicolato para um tubo contendo meio leite com ferro. Um selo de vaselina esterilizado foi adicionado na superfície do tubo e incubado a 45 °C em banho-maria por 18 h a 24 h. Foi observada a ocorrência de coagulação tempestuosa do leite, com rompimento e deslocamento do coágulo, teste positivo, ou a ocorrência de coagulação normal ou não coagulação do leite, teste negativo;
(iii) Motilidade: Com o auxílio de uma agulha de inoculação, a cultura foi inoculada por picada, no centro do ágar nitrato motilidade previamente desaerado, até uma profundidade distante 1 cm do fundo do tubo. A incubação foi realizada a 35 ºC ± 2ºC por 24 h. A seguir, foi observado se houve migração de células para as regiões fora da linha de inoculação (teste positivo) ou se o crescimento restringiu-se à região
(iv) Redução de nitrato: Após a leitura da motilidade, foi acrescentado ao ágar nitrato motilidade usado no teste anterior, 0,5 a 1,0 mL de solução de alfa-naftol a 0,5% e 0,5 a 1,0 mL de solução de ácido sulfanílico a 0,8%. O desenvolvimento de coloração vermelha indicou a redução de nitrato a nitrito, característica de C. perfringens, teste positivo. Em caso negativo, adicionou-se 0,5 g de sulfato de zinco ao meio, observando se ocorria alteração de cor. Se o meio continuasse com a cor inalterada, não havia nitrato presente, indicando teste positivo. O aparecimento de uma cor rosa foi indicativo da não redução do nitrato;
(v) Fermentação da lactose e hidrólise da gelatina: Com o auxílio de uma agulha de inoculação, a cultura foi inoculada por picada, no meio lactose-gelatina. A incubação foi realizada a 35 °C por 24 ± 48 h. Foi observada a formação de bolhas e viragem ácida do indicador vermelho de fenol, alterando a cor do meio de vermelha para amarela (fermentação positiva de lactose), ou se o meio permanece com a cor inalterada (fermentação negativa de lactose). Os tubos foram mantidos sob refrigeração por duas horas, observando em seguida, se o meio permanecia líquido (hidrólise positiva de gelatina) ou se adquiria consistência firme (hidrólise negativa de gelatina). As estirpes de C. perfringens fermentam a lactose e hidrolisam a gelatina;
(vi) Fermentação de carboidratos: A partir de uma cultura de 24 h em meio tioglicolato, foi inoculado 0,15 mL em tubos contendo meio de fermentação para C.
perfringens. A incubação foi realizada a 35 °C por 24 h. A seguir, foi verificada a
produção de ácido, transferindo-se 1 mL da cultura para um tubo de ensaio e adicionando duas gotas de solução de azul de bromotimol a 0,04%. O desenvolvimento de cor amarela no meio de cultura indicou teste positivo. Em caso negativo, a cultura foi reincubada e a produção de ácido foi verificada novamente com 48 h e 72 h de incubação. Estirpes de C. perfringens fermentam rafinose e não fermentam salicina.
Após a realização das provas bioquímicas, os resultados, expressos em log UFC.g-1, foram calculados em função do número de colônias típicas, diluição inoculada e porcentagem de colônias confirmadas.
3.2.3. Quantificação de esporos aeróbios e de Bacillus spp.
Para a quantificação de esporos aeróbios e de Bacillus spp. foi utilizada a técnica de membrana filtrante, como descrito por Rice et al. (1996). Antes da análise, a
banho de gelo e filtrada em sistema de vácuo com o emprego de membrana com poros de 0,45 µm.
Diluições seriadas foram realizadas nas amostras a fim de obter um resultado final de crescimento sempre inferior a 200 UFC por membrana. Após a filtração, a membrana foi disposta sobre ágar nutriente (Himedia®) com azul de tripan e 0,1% de amido e incubada em câmara úmida a 35 °C por 20 h a 22 h. Após esse período, todas as unidades formadoras de colônias (UFC) contadas foram consideradas colônias originadas de esporos de bactérias aeróbias.
Foram considerados Bacillus spp., as colônias que formaram esporos aeróbios,
Gram-positivos e apresentaram resultados positivos nos testes de catalase e de produção de ácido a partir de glicose.
3.2.4. Quantificação de coliformes a 35 ºC e de Escherichia coli
Foi coletado um volume de 200 mL de água em garrafa de vidro com tampa de plástico, previamente esterilizada em autoclave a 121 ºC por 15 min). A amostra foi conservada a 6 ºC ± 1 ºC para posterior realização das análises de coliformes a 35 ºC e E. coli, Clostridium perfringens e Bacillus spp.
A quantificação de coliformes a 35 ºC e E. coli foi realizada pela técnica do substrato definido, cromogênico-fluorogênico, com meio Colilert® (Quanty-tray®, IdexLaboratories Inc, US), expressa como NMP.100mL-1 (APHA, 2005).
3.2.5. Quantificação de Pseudomonas spp.
A quantificação de Pseudomonas spp. foi realizada pela técnica de membrana filtrante, como descrito por APHA (2005). Diluições seriadas foram realizadas nas amostras a fim de obter um resultado final de crescimento sempre inferior a 200 UFC por membrana. Após a filtração, a membrana foi disposta sobre ágar Cetrimide (Himedia®) e incubada a 28 °C por 24 h.
3.2.6. Determinação da turbidez
As medidas de turbidez das águas foram realizadas em turbidímetro portátil (HACH®, modelo 2100P, EUA), conforme descrito por Standard Methods for Water and
Wasterwater (APHA, 2005).