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Para a avaliação da capacidade de adesão e formação de biofilme em superfície abiótica foi utilizada a metodologia descrita por Melo et al.51 e recentemente reproduzida por Dovigo et al.22. Duas colônias provenientes de cada grupo foram ressuspensas em PBS e a concentração celular das suspensões foi ajustada espectrofotometricamente em 1x107 UFC/mL22,51.

A capacidade de adesão foi avaliada pelos seguintes métodos: quantificação do número de células aderidas por meio da contagem do número de colônias viáveis e análise da atividade celular por meio do ensaio de redução de 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)- 5 [(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide (ensaio de XTT). É importante enfatizar que esses métodos de avaliação foram realizados em três ocasiões distintas, com n=6 para cada ocasião.

Para a avaliação da capacidade de adesão, alíquotas de 100μL da suspensão fúngica padronizada (107 UFC/mL) foram transferidas para os orifícios de uma placa de 96 cavidades, e a placa foi incubada em agitador orbital durante 1 h 30 min, a 37ºC e 75 rpm. Esse período de incubação é adequado para a adesão das células no fundo do orifício51. Após esse período, os orifícios foram lavados cuidadosamente com 150 µL de PBS estéril. Essa lavagem foi feita

duas vezes com o objetivo de remover as células não aderidas, tamponar o meio e remover os metabólitos. Estes procedimentos podem ser visualizados na Figura 25.

Para a quantificação das células, foi esfregado um mini swab estéril em cada orifício por um período de 10 segundos. Este mini-swab foi transferido para o interior de um tubo do tipo eppendorf contendo 900 µL de PBS estéril e, em seguida, o tubo foi agitado em vortex durante 1 minuto para o desprendimento das células. A seguir, foram obtidas diluições seriadas a partir do conteúdo de cada eppendorf (101 a 104) que foram semeadas em meio de cultura SDA (Figura 26). Após incubação a 37 ºC por 48 horas, o número de UFC/mL foi calculado.

Figura 25 – Adesão de biofilme: 100 µL da suspensão fúngica padronizada foi transferido para uma placa de 96 orifícios. Esta placa foi incubada por 1 h e 30 min a 37°C em agitador orbital a 75 rpm. Após este período, a suspensão foi retirada e foram realizadas 2 lavagens com 150 µL de PBS estéril. Araraquara, 2012.

O ensaio de XTT avaliou a presença de micro-organismos por meio da atividade metabólica das células. O teste com XTT baseia-se na habilidade das enzimas desidrogenases mitocondriais de micro-organismos metabolicamente ativos converterem o sal tetrazólio XTT em um produto solúvel em água (formazan), e a coloração resultante da reação é mensurada em espectrofotômetro70. A solução de XTT foi preparada utilizando-se água ultra-pura a uma concentração de 1 mg/mL e mantida a -70°C até o momento dos experimentos. A solução de menadiona foi preparada em acetona a 0,4 mM imediatamente antes de cada experimento. A solução de XTT preparada em todos os experimentos constituiu-se de PBS com 200mM de glicose, solução de XTT previamente preparada e menadiona, na seguinte proporção: 15µL, 40 µL e 2 µL, respectivamente. Para o ensaio, 200 µL da solução de XTT foram adicionados em cada orifício da placa, a qual foi incubada a 37 °C por 3 horas no escuro. Após esse período, 100 µL do produto da degradação do XTT foram transferidos para o orifício de uma placa de leitura (Elisa). O resultado desta reação química foi medido utilizando-se o espectrofotômetro com filtro de 492 nm (Figura 27)22.

Figura 26 – Teste de quantificação por meio da contagem do número de colônias viáveis: um mini-swab foi esfregado por 10 segundos em cada orifício e colocado em um eppendorf contendo 900 µL de PBS. Após agitação do eppendorf por 1 minuto, foi realizada a diluição seriada e plaqueamento em SDA. A contagem do número de colônias viáveis foi feita após 48 h a 37 ºC com o auxílio do contador digital. Araraquara, 2012.

Para a avaliação da capacidade de formação de biofilme, os mesmos passos descritos anteriormente para que houvesse a adesão do biofilme foram realizados. No entanto, após a lavagem dos orifícios, 150 µL do meio de cultura RMPI 1640 foi adicionado nos orifícios e as placas foram mantidas por 48 horas em um agitador orbital (37ºC; 75 rpm) para o desenvolvimento dos biofilmes. Após esse período, os biofilmes maduros foram duplamente lavados com 200 µL de PBS estéril (Figura 28) e submetidos aos testes de quantificação por meio da contagem do número de colônias viáveis e da biomassa total (corante cristal violeta) e análise da atividade celular por meio do ensaio de XTT. Os métodos de avaliação foram realizados em três ocasiões distintas, com n=6 para cada ocasião.

A coloração cristal violeta foi utilizada para determinar a biomassa total de células aderidas e de biofilme formado, de acordo com a metodologia realizada por Dovigo et al.22. Para isso, células e biofilmes previamente lavados foram mantidos sobre a bancada por 45

Figura 28 – Fase de maturação do biofilme: 150 µL de meio RPMI foi adicionado em cada orifício. A placa foi incubada por 48 h a 37 °C em agitador orbital a 75 rpm. Após este período, o meio foi retirado e foram feitas 2 lavagens com 200 µL de PBS estéril. Araraquara, 2012.

Figura 27 – Análise da atividade celular por meio do ensaio de XTT: coleta dos dados no leitor de microplacas com filtro 492 nm (Thermo Plate / TP Reader). Araraquara, 2012.

minutos à temperatura ambiente para secagem. Em seguida, foram adicionados em cada orifício 110 µL de solução de corante cristal violeta 0,4% por 45 minutos. Após este período, cada orifício da placa foi lavado 3 vezes com 200 µL de água destilada estéril e, a seguir, foi adicionado etanol 95% por 45 minutos para diluição do corante fixado ao biofilme. Uma alíquota de 100µL desse produto resultante foi transferida para o orifício de uma placa de leitura (Elisa). O resultado desta reação química foi medido utilizando-se o leitor de microplacas com filtro 595nm (Figura 29).