Seçilen aday bioajan bakteri ve fungal izolatların in vivo koĢullarında

S. Ü. Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü AraĢtırma ve Uygulama açık alanı koĢullarında 2018 yılı Temmuz-Ağustos ayları arasında yapılan saksı denemesinde in vitro Ģartlarda etkili bulunan aday bioajan bakteri ve fungus türlerinin Ġnegöl Alası ayçiçeği çeĢidi kullanılarak S. sclerotiorum izolatlarına karĢı etkinliği test edilmiĢtir. Seçilen biyolojik mücadele ajanı bakteri ve fungusların in vivo testi sonucunda oluĢturdukları lezyon uzunlukları ve ‗‗Tukey Çoklu KarĢılaĢtırma Testi‘‘ sonuçlarına göre gruplandırması Çizelge 4.13 ve 4.14‘de verilmiĢtir.

Saksı denemesinde, öncelikli olarak bakteriyel ve fungal biyoajan süspansiyonları hazırlanmıĢ ve bitki üzerinde açılan yaraya püskürtme Ģeklinde uygulanmıĢtır. Daha sonra S. sclerotiorum bitkiye inokule edilmiĢ ve sonraki 3 gün içinde bitkilerde gövde simptomları gözlenmiĢtir. Pozitif kontrol uygulamasındaki bitkilerin tümünde simptom gözlendikten (inokulasyondan sonraki 7. günde) sonra değerlendirme yapılmĢtır.

Çizelge 4. 13. Seçilen aday bioajan bakteri türlerinin in vivo koĢullarda Sclerotinia sclerotiorum

izolatların enfeksiyonuna karĢı etkinlikleri

Bakteri türleri S. sclerotiorum’un Hırkatol Ġzolatı S. sclerotiorum’un Eskil Ġzolatı Lezyon uzunluğu(cm) % Engelleme Oranı* Lezyon uzunluğu(cm) % Engelleme Oranı* Bacillus cereus 0 a 100 0 a 100 Bacillus simplex 0 a 100 0 a 100 Bacillus toyonensis (B2) 5,83 b 31 5,67 bc 12 Brevibacterium frigoritolerans 6 b 30 3,17 b 51 Bacillus toyonensis (B1) 8,67 c -4 7,17 c -12 Kontrol 8,33 c - 6,4 c -

P≤0.05 (Aynı sütünda aynı harfle ifade edilen ortalamlar arasında istatistiki açıdan fark yoktur) * % Engelleme oranı = (Kontrol-uygulama)/Kontrol x 100

Çizelge 4.13‘de bakıldığında in vivo test sonuçlarına göre, değiĢik bakteri türlerinin S. sclerotiorum‘a karĢı etkinliklerinin farklı düzeylerde çıktığı görülmektedir. ÇalıĢmada kullanılan bakteri türlerinin S. sclerotiorum izolatları üzerinde engelleme etkisi istatistiki olarak önemli bulunmuĢtur. Kullanılan bakteri türlerinden Bacillus

toyonensis (B1) hariç bütün bakteriler kontrole göre lezyon geliĢimini azaltmıĢ veya durdurmuĢtur. Uygulama sonucunda biyolojik mücadele ajanı bakterilerden Bacillus cereus ve Bacillus simplex in vivo koĢullarda S. sclerotiorum‘un her iki izolatının da geliĢmesine tamamen (%100) engel olmuĢtur. Diğer bakteriyel ajanlardan lezyon geliĢimini en fazla azaltan Hırkatol izolatında kontrole (8,33 cm) göre Bacillus toyonensis (B2) 5,83 cm (Engelleme oranı, %31) ve Brevibacterium frigoritolerans 6 cm (%30) olarak belirlenmiĢtir. Eskil izolatında ise kontrole (6,14 cm) göre ilk sırayı Brevibacterium frigoritolerans 3,17 cm (%51), ikinci sırayı Bacillus toyonensis (B2) 5,67 cm (%12) almıĢtır. Ancak Bacillus toyonensis (B1) S. sclerotiorum‘un her iki izolatının geliĢmesine kontrollere göre engel olamamıĢ, aksine sinerjistik etki yapmıĢtır. Bu durumun bakterilerin ortama bıraktıkları metaboliklerin fungusun miselyum geliĢimini stimule etmesinden kaynaklanabileceği düĢünülmektedir (Onaran ve Yanar, 2011) .

Bunun yanında, in vivo koĢullarda kontrol amaçlı ayçiçek bitkisinin gövdesine yara açılarak sadece ümitvar bakteri ajanı sprey edilen konrollerde lezyon geliĢimi gözlenmemiĢtir (ġekil 4.19). Bu da kullanılan bakterilerin ayçiçeği bitkisi üzerinde herhangi bir hastalık oluĢturmadığını ortaya koymaktadır.

ġekil 4. 19. İn vivo koĢullarda kontrol amaçlı sadece bakteri süspansiyonu sprey edilen ayçiçeği bitkileri.

a) Uygulama sonrası (bakteri sprey edilen) sağlıklı bitki ve b) Sadece açılan yara dokusunun görüntüsü

Seçilen aday bakteriyel bioajanların in vivo koĢullarda S. sclerotiorum‘a karĢı etkinlik durumlarının görselleri ġekil 4.20, 4.21, 4.22, 4.23 ve 4.24‘de sunulmuĢtur.

ġekil 4. 20. Bacillus cereus uygulaması yapılan bitkilerden görünüm

ġekil 4. 21. Bacillus simplex uygulaması yapılan bitkilerden görünüm KONTROL KONTROL

ġekil 4. 23. Bacillus toyonensis (B2) uygulaması yapılan bitkilerden görünüm KONTROL

KONTROL

KONTROL

ġekil 4. 22. Brevibacterium frigoritolerans uygulaması yapılan bitkilerden

görünüm

Aday antagonistik bakterilerin in vivo testi sonuçlarına göre Ġnegöl Alası ayçiçeği çeĢidinde S. sclerotiorum‘un her iki izolatının enfeksiyonunu engelleme oranlarının grafiksel gösterimi ġekil 4. 25‘de sunulmuĢtur.

ġekil 4. 25. Ümitvar biyolojik mücadele ajanı antagonistik bakterilerin in vivo testi sonuçlarına göre Sclerotinia sclerotiorum izolatlarını engelleme oranları (%)

ġekil 4.25‘de görüldüğü gibi, S. sclerotiorum‘un neden olduğu enfeksiyonu en yüksek oranda engellemenin Bacillus cereus ve Bacillus simplex bakterilerinden elde edilmiĢ olup, her iki bakteri türünün hastalığı engelleme oranı %100 olarak tespit edilmiĢtir. Etkili olan antagonist bakteriler rizosfer bölgesi, tohum veya bitki üzerindeki yaralarda kolonize oldukları sırada bu maddeleri üretirler ve baskılayıcı etki sağlarlar. Antibiyotik maddelerin etkili olabilmesi için patojene yakın olmaları gerekmektedir (Paulitz ve Belanger, 2001). Bazı antagonistlerin ise birden fazla farklı özellikte antibiyotik salgıladıkları bilinmektedir (Bacon ve ark., 2015; Cawoy ve ark., 2011). Örneğin Bacillus cereus streyn UW85 hem zwittermycin hem de kanasamine adlı antibiyotikleri salgılamaktadır. Birden fazla antibiyotik salgılanması toprak içerisindeki mikroorganizmalar arasındaki rekabette büyük bir avantaj sağlamaktadır. Ayrıca, antibiyotik üretme dıĢında mekanizmaları bulunan antagonistlerin daha geniĢ alanda hastalıkları baskı altına alabildikleri de bilinmektedir (Pal ve Gardener, 2006).

Bunun yanında Bacillus toyonensis (B2) ve Brevibacterium frigoritolerans‘ın fitopatojen fungusun geliĢmesi üzerine en az % engelleme gösteren bakteri türleri olarak bulunmasına rağmen, kontrole göre önemli düzeyde engelleme gösterdikleri tespit edilmiĢtir. Ayrıca in vitro Ģartlarda antagonist etki gösteren bazı Bacillus türlerinin patojen fungusu engellemesi in vivo Ģartlarda mümkün olmamıĢ hatta kontrole göre

lezyon uzunluğunu daha da artırarak sinerjistik etki yapmıĢtır. Bunun antibiyosis mekanizmasının kullanılmasını engelleyen bazı durumlardan kaynaklandığı düĢünülmektedir. Bunların arasında antbiyotiklerin üretilmemesi yada uzun süre kalıcı olmaması ve etki alanlarının dar olması gibi durumların etkili olduğu bilinmektedir. Çünkü biyoaktif sekonder metabolitlerin üretilmesi, mikroorganizmaların türlerine veya suĢlarına ve kültürel koĢullarına bağlı olarak değiĢmektedir (Jose ve ark., 2011; Wang ve ark., 2011). PH ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin de çeĢitli bakteri türlerinde büyüme ve antibiyotik üretimi üzerinde olumlu etkiye sahip olduğu kabul edilmektedir (Vijayakumari ve ark., 2013). Bacillus türlerinin antibiyotik üretimi için 6.5-7.5 pH'ın ve optimum 25-30°C sıcaklığın uygun olduğu bildirilmiĢtir (Guimaraes ve ark., 2004).

Trichoderma‘ların in vitro testler yoluyla mümkün olan antagonistik etkilerinin ardından saksı ve tarla denemelerinin biyolojik kontrol potansiyellerini belirlemek için gerekli olduğu bilinmektedir. Bunun için çalıĢmamızda ümitvar biyolojik mücadele ajanı mikoparazitik fungusların in vivo testi sonuçlarına göre Ġnegöl Alası ayçiçeği çeĢidi üzerinde S. sclerotiorum‘un enfeksiyonuna karĢı etkinlilik durumları Çizelge 4.14‘de verilmiĢtir.

Çizelge 4. 14. Seçilen aday bioajan fungusların in vivo koĢullarda Sclerotinia sclerotiorum izolatların

enfeksiyonuna karĢı etkinlikleri

Fungus türleri Hırkatol izolatı Eskil izolatı

Lezyon uzunluğu (cm) % Engelleme Oranı* Lezyon uzunluğu (cm) % Engelleme Oranı* T.brevicompactum (T1) 5,5 b 50,76 4,5 b 34,11 T.brevicompactum (T2) 0,75 a 93,28 0,17 a 97,51 Kontrol 11,17 c - 6,83 b -

P≤0.05 (Aynı sütünda aynı harfle ifade edilen ortalamlar arasında istatistiki açıdan fark yoktur) * % Engelleme oranı = (Kontrol-uygulama)/Kontrol x 100

Uygulama sonucunda Çizelge 4.14‘de görüldüğü gibi pozitif kontrole göre belirlenen engelleme %‘sinde T. brevicompactum (T2) izolatının en etkili biyolojik mücadele ajanı fungus olduğu ve S. sclerotiorum‘un her iki izolatının geliĢimini %93,28-97,51 oranında azalttığı saptanmıĢtır. İn vivo Ģartlarda fungal izolatlardan T.brevicompactum (T1) ise S.sclerotiorum‘un oluĢturduğu lezyonları kontrole göre azaltmıĢ ve patojenin her iki izolatı üzerinde %34,11-50,76 oranında engelleme göstermiĢtir. Ġstatistikî olarak da incelendiğinde T.brevicompactum (T2) izolatının

pozitif kontrolden farklı bir grupta yer alarak S. sclerotiorum‘un enfeksiyonunu azaltmada etkili bir uygulama olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 4.26).

ġekil 4. 26. Trichoderma brevicompactum T1 ve T2 izolatlarının in vivo koĢullarda Sclerotinia sclerotiorum‘un Hırkatol ve Eskil izolatlarının enfeksiyonu engelleme oranları (%) izolatlarını engelleme oranları (%)

Trichoderma brevicompactum T1 ve T2 izolatlarının Sclerotinia sclerotiorum‘un enfeksiyonuna karĢı göstermiĢ oldukları etkinliklerinin görsel görünümü ġekil 4.27 ve 4.28‘de sunulmuĢtur.

KONTROL

ġekil 4. 27. Trichoderma brevicompactum (T2) ) uygulaması yapılan bitkilerden

Bunun yanında sadece T.brevicompactum biyolojik mücadele ajanı süspanse edilmiĢ ayçiçeği bitkilerinde hiçbir hastalık simptomu oluĢmamıĢ ve ġekil 4.29‘de gösterilmiĢtir.

ġekil 4. 29. İn vivo koĢullarda kontrol amaçlı sadece Trichoderma brevicompactum süspansiyonu sprey

edilen ayçiçeği bitkileri. a) Uygulama sonrası sağlıklı bitki ve b) Sadece açılan yara dokusunun görüntüsü

Ayrıca, in vitro ve in vivo test sonuçları birlikte değerlendirildiğinde, performans açısından aynı türe ait izolatlar arasında da belirgin farklar gözlenmistir. Trichoderma türlerinin in vitro test sonuçları nispeten birbirini desteklemesine karĢın in vivo Ģartlarda iki tür aynı performansı gösterememiĢtir (Çizelge 4.14).

KONTROL

a b

ġekil 4. 28. Trichoderma brevicompactum (T1) uygulaması yapılan bitkilerden

ġöyleki, laboratuvar koĢullarında Trichoderma izolatı mikoparasitzm, antibiyotik ve enzim üretimi sonucu patojenin güçlü bir Ģekilde etkilenmesini sağlayabilir fakat bu doğa koĢullarında baĢarılı olmayabilir. Trichoderma türlerinin biokontrol aktiviteleri (antibiyotik ve enzim üretimi) üzerinde sıcaklığın çok büyük etkisi vardır. Ayrıca toprak florasında diğer mikroorganizmaların varlığı yine biokontrol ajanının geliĢimini, etkinliliğini engelleyebilir veya antibiyotik ve enzimlerini metabolize edebilir. Bu durumlar Trichoderma türlerinin biokontrol aktivitesini tamamen olumsuz etkilemeyebilir ancak etkinliğinin sürmesi için, izole edildiği koĢullara yakın sıcaklık, nem ve besin değerine sahip ortamlarda uygulanması gerekmektedir (Aydın, 2019).

Dünyada 100'den fazla Trichoderma türü kaydedilmiĢtir (Pandya ve ark., 2011) ve bunların çoğunun toprak patojenlerinin potansiyel biyolojik ajanı olarak ticari formülasyonun mevcut olduğu bilinmektedir (Benitez ve ark., 2004; Johnson ve Atallah, 2006; Kumar ve ark., 2017).

Yapılan pek çok çalıĢmada S. sclerotiorum’a karĢı daha çok Trichoderma harzianum (Zeilinger ve ark., 1999; Elad, 2000b; Agrios, 2001; Tozlu, 2003; Abdulla ve ark., 2008; Zhang ve ark., 2016; Sharma ve ark., 2017)‘un kullanımı ile ilgili raporlarla karĢılaĢılmıĢtır. Mathews ve ark., (2019), Trichoderma harzianum‘un T77 (Eco-77®) ticari suĢunu sera koĢullarında ayçiçeğinde Sclerotinia sclerotiorum kontrolü için değerlendirmiĢler ve sklerotia oluĢumunu önemli ölçüde azalttığını fakat hastalığın ilerlemesinde çok etkili olmadığını bildirmiĢlerdir. Trichoderma türleri ile yapılan çalıĢmalar gözden geçirildiğinde patojenin sklerotia üretimini azaltmada ki yeteneği biyolojik kontrol için seçiminde önemli bir parametre olarak gösterilmektedir (Bianchini ve ark., 2005; Benitez ve ark., 2004; Pandya ve ark., 2011). Bu bağlamda çalıĢmamızdan elde ettiğimiz sonuçlar, ayçiçeğinde S. sclerotiorum‘u engelleme ve sklerot oluĢumunu durdurma potansiyeli ile T. brevicompactum‘un daha farklı yönleriyle araĢtırılıp, etki mekanizmalarının daha net olarak ortaya konması gerekemektedir.

Benzer Ģekilde farklı araĢtırmacılar tarafından yapılan daha önceki çalıĢmalarda S. sclerotiorum‘a karĢı biyolojik mücadele ajanı olarak Trichoderma viride (Tuncer ve Damdere, 1997; Clarkson ve ark., 2004; Kumar ve ark., 2018; Shaik, 2011), Trichoderma virens ( Huang ve ark.,2000; Mukherjee ve ark., 2007;Wang ve ark., 2003), T. atroviride ve T. longibrachiatum (Keszler ve ark., 2000; Marra ve ark., 2006; Reithner ve ark., 2007; Harighi ve ark., 2007; Druzhinina ve ark., 2008; Matroudi ve

ark., 2009; McLean ve ark., 2012; da Silva ve ark., 2019), Trichoderma asperellum (Samuels ve ark., 2010; Castillo ve ark., 2011; Upadhyay ve ark., 2019) ve Trichoderma hamatum (Dubey ve Suresh, 2006; Thornton, 2008; Ryder ve ark., 2012; Studholme ve ark., 2013; Shaw ve ark., 2016; Karaoğlu ve ark., 2018)‘un etkili olduğu bildirilmiĢ fakat T. brevicompactum‘un kullanımı ile ilgili bulgu sadece Marques ve ark., (2016) tarafından yapılan çalıĢmada rapor edilmiĢtir. Böylece S. sclerotiorum‘a karĢı T. brevicompactum etkinliği ülkemizde ilk kez bu çalıĢma ile ortaya konmuĢtur.

T. brevicompactum‘un antagonistik etkisi farklı fitopatojenlere karĢı da denenmiĢtir. Nitekim Ommati ve Zaker (2012), T. brevicompactum'un üç izolatını saksı kültüründe Fusarium solani'ye karĢı denemiĢler ve hastalığı %62,5-12,5 arasında değiĢen oranlarda engelleyerek biyo-kontrol etkisini tesbit etmiĢlerdir. Ayrıca T. brevicompactum ile inokule edilen bitkilerin diğerlerinden daha iyi büyüme ve canlılık gösterdiğini bildirmiĢlerdir. Yapılan bu çalıĢmalar T. brevicompactum biyoajan olabileceğini göstermekte ve bizim elde ettiğimiz sonuçları desteklemektedir.

Trichodermalar çevreye kolay adapte olduklarından dolayı güçlü bir biyolojik kontrol potansiyeline sahiptirler fakat yeni bir ekolojik çevre ile karĢılaĢtıklarında iklimsel adaptasyon ve kolonizasyon sorunları yaĢayabilirler (Behzad ve ark., 2008). Ayrıca dünyanın farklı bölgelerinde değiĢken olduğu, bir bölgedeki belirli bir patojene karĢı oldukça etkili olan bir türün baĢka bir bölgedeki aynı patojene karĢı zayıf bir Ģekilde etki edebileceği görülmektedir. Bunlar çeĢitli tarımsal koĢullardaki farklılıklardan kaynaklanabilmekte bunun için farklı ekosistemlerdeki etkin türlerin belirlenmesi ve tanılanmasının önemi oldukça faydalı görünmektedir. Bu nedenle T. brevicompactum, nispeten farklı iklim koĢullarına uyum sağlayabilen kozmopolit, çok yönlü bir tür gibi görünmektedir (Kubicek ve ark., 2001) .

Rhizosferde rekabet etme yeteneği, Trichoderma‘lar açısından biyolojik mücadelede önemlidir. Çünkü bir biokontrol ajanın rhizosferde yaĢayabilmesi için yer ve besin açısından baĢka mikroorganizmalarla rekabet etme gücünün olması gerekmektedir (Harman ve ark., 2004; Vinale ve ark., 2008).

Trichoderma‘ların geliĢimi için optimum sıcaklıklar türler arasında farklılık göstersede genel kural olarak 20 o_{C‘nin üzerindeki sıcaklıkların kolonizasyonu için} uygun olduğudur. Trichoderma türlerinin kolonizasyonu bitkinin savunma kuvvetinin artmasına neden olurken bitkiyi geniĢ spektrumlu bitki patojenlerine karĢı dirençli hale getirmektedir (Bailey ve ark., 2006; Alfano ve ark., 2007; Morán-Diez ve ark., 2012; Malmierca ve ark., 2014). Birçok Trichoderma türü orta sıcaklıkta (20-25oC) daha iyi

geliĢtiğinden dolayı (Mezophilic), soğuk sonbahar ve ilkbahar koĢullarında bitkiyi soğuğa dayanıklı patojen ırklarına ve toprak kökenli hastalıklara karĢı koruyamayabilmektedir (Kredics ve ark., 2003; Martínez-Medina ve ark., 2010; Salas- Marina ve ark., 2011; Mathys ve ark., 2012). Yapılan araĢtırmalar T. brevicompactum'un fizyolojik özelliklerini optimum 30-32°C de gösterdiğini bildirmiĢtir ve bu da özellikle toprak yüzeyindeki veya buna yakın bitki patojenleri ile daha iyi rekabet etme kabiliyetini ortaya koymaktadır. Bunun yanında çoğu karbonhidratı (mono-, oligo- ve polisakarit) ve karbonhidratla iliĢkili bileĢikleri (poliolleri) diğer Trichoderma türlerine göre daha yüksek oranda, amino asitleri ve organik asitleri çok daha verimli kullandıkları bildirilmiĢtir (Kubicek ve ark. 2001).

Ayrıca in vivo çalıĢmalardan sonra, uygulamaların yapıldığı ayçiçeği bitkisinin hastalıklı dokularından alınmıĢ ve PDA ortamı üzerine ekilmiĢtir. Özellikle S.sclerotiorum‘u izole etmek amacıyla yapılan bu test de, patojenin üzerinde etkili olan biyoajanların bir kısmınında yeniden izole edildiği görülmüĢtür (ġekil 4.30). Bu, antagonistlerin dokuya yerleĢtiğini ve aktivitelerinin devam ettiğini göstermektedir. Bitkilerin çeĢitli organlarına (yumru kökleri ve kökler) yerleĢen endofitik türlerin üretim sezonu boyunca faaliyetlerini sürdürdüğü ve kolonileĢtikleri bildirilmiĢtir (Harman, 2000; Howell, 2003; Aydın ve Turhan, 2013).

ġekil 4. 30. İn vivo çalıĢmalardan sonra, uygulamaların yapıldığı ayçiçeği bitkisinin dokularından

alınarak biyoajanların Sclerotinia sclerotiorum‘un üzerinde etkili olan biyoajanların bir kısmının yeniden izole edilmesi. a) Bitkinin tepe kısmından alınan örnek ve b) Bitkinin gövde kısmından alınan örnek

Bu araĢtırmalardan in vitro, in vivo saksı ve tarla denemelerinin biyolojik kontrol potansiyeline sahip fungal ve bakteriyel izolatları bulmak için gerekli olduğu açıkça anlaĢılmalıdır. ÇalıĢmamızda kullandığımız baĢarılı izolatların patojeni baskı altına

almada kullandığı mekanizmaların belirlenmesi için daha detaylı araĢtırmalar gerekmektedir.

Biyoajanların hakkında ayrıntılı bilgi, bunların biyo kontrolünde özel olarak uygulanmasına izin verecek ve farmasötik olarak biyoteknolojik açıdan etken maddelerden yeterli miktarda üreten suĢların üretilmesine yol açacaktır.

Yakın zamanda, farklı taksonomik gruplardan bakteri ve fungal antimikrobiyal özelliğe sahip çeĢitli biyoaktif bileĢikler yeni kaynak olarak ortaya çıkmaktadır ve bu alanda çok sayıda baĢarılı çalıĢmaların olduğu görülmüĢtür ve yaptığımız çalıĢmada bu alanda önemli sonuçları göstermektedir. Fakat pratiğe aktarılması için üzerinde durulması gereken pek çok noktanın olduğu unutulmamalıdır.