Biyolojik mücadele ajanlarının tespiti

3.2.7.1. Fungal biyoajanların izolasyonu ve tanılanması

Fungal biyolojik ajanların tespiti için; hastalıklı tarlalardan alınan patojene ait doku parçalarının veya sklerotiumların PDA‘ya yerleĢtirilmesi ile funguslar izole edilerek saf kültürleri elde edilmiĢtir (ġekil 3.6). In vitro antagonistik etkileri belirlendikten sonra 16S rRNA gen dizilimine göre tanılanmıĢtır.

ġekil 3. 6. Trichoderma spp.‘nin izolasyonunda kullanılan materyal a) Sklerotlar, b) Bitki kökleri ve

c) mikroskobik görüntüsü

3.2.8.2. Bakteriyel biyoajanların izolasyonu, aday izolatların seçimi ve tanılanması

Biyoajan bakterilerin izolasyonu için Küsek (2007) tarafından belirtilen yöntemlerden yararlanılmıĢtır. Ġzolasyon amacıyla Konya, Aksaray ve Karaman

illerindeki ayçiçeği alanlarını temsil edececek Ģekilde hastalıksız ayçiçeği tarlalarından diğerlerine göre daha iyi geliĢmiĢ sağlıklı ayçiçeği kök bölgesinden ve patojenin mevcut olduğu tarlalarda bulunan enfeksiyon görülmeyen ayçiçeği bitkilerinin rizosferinden kılcal kökler de dâhil olmak üzere toprak örnekleri alınmıĢtır. Topraktan bakteri izolasyonu için örnekler nem bakımından orta derecede nemli olan ekim alanlarından alınmıĢtır. Toplanan örnekler önce kese kağıdına ve sonra plastik torbalara konulmuĢ buzluk içerisinde laboratuara getirilerek buzdolabında +4°C saklanmıĢtır.

Alınan toprak örnekleri izolasyondan bir gece önce oda sıcaklığına serilerek kuruması için bekletilmiĢtir. Kuruyan topraklar 1 mm çaplı eleklerden elendikten sonra 10 g toprak tartılmıĢ ve 250 ml‘lik steril erlenlere konulmuĢtur. Bunun üzerine 90 ml steril su eklenmiĢ ve 30 dk çalkalanmıĢtır. Erlendeki süspansiyondan mikro pipetle 1 ml alınarak içerisinde 9 ml steril su bulunan tüpe konulmuĢ ve tüp karıĢtırıcıda iyice karıĢtırıldıktan sonra içinden 1 ml alınarak tekrar içinde 9 ml steril su bulunan tüpe ilave edilmiĢtir. Bu seyreltme iĢlemi 6 kez tekrarlanarak sulandırma serileri hazırlanmıĢtır. Seriler halinde hazırlanan süspansiyonlardan beĢinci ve altıncı sulandırma serilerinden 100 µl alınarak steril cam bagetle NA ve King B besi yerine ekim yapılmıĢ ve 25±1°C‘de 24 saat bakteriyel koloniler geliĢene kadar inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyondan sonra besi yerinde geliĢen koloniler incelenmiĢ ve farklı morfolojik geliĢim gösteren koloniler seçilerek saf kültür elde edinceye kadar NA ve KB besi yerine ekim yapılmıĢtır.

SaflaĢtırılan 16 izolat önce MALDI-TOF biyotipleme yoluyla karakterize edilmiĢtir. Elde edilen aday bakteri izolatları arasında seçim ise in vitro testlerde S. sclerotiorum‘a karĢı gösterdikleri etki sonuçlarına göre yapılmıĢtır. Seçilen bu bakteri izolatlarından en geniĢ zon çapı oluĢturan toplam 5 izolat tekrar 16S rRNA‘ya göre moleküler olarak tanılanmıĢ ve saksı denemelerinde kullanılmıĢtır. Ayrıca bakteri izolatlarının karakterizasyonu için gram reaksiyonu ve oksidaz testi yapılmıĢtır.

3.2.8.3. Bioajan fungus ve bakteri izolatlarının in vitro testlerde antagonistik etkilerinin belirlenmesi

Muhtemel bioajanların fitopatojen fungusu antibiyosis veya hiperparazitizm etkileĢim ile kontrol edip etmediği belirlenmiĢtir (Rodriquez ve ark., 2011). Tüm bakteriyel izolatların in vitro antifungal aktvitesi ikili (dual) kültür tekniğine göre değerlenmiĢtir (Xiaoning ve ark., 2014). Ġzole edilen antagonist bakterilerin S.

sclerotiorum’a karĢı etkinliği PDA besi yeri kullanılarak test edilmiĢtir. Bunun için S. sclerotiorum'un geliĢmekte olan 4-5 günlük kültüründen 5 mm çapında alınan iki disk, PDA içeren 9 cm‘lik petrilerin kenara yakın kısımlarına karĢılıklı olarak yerleĢtirildikden sonra, aynı petrinin orta kısmına NA besiyerinde geliĢtirilen bakterilerin 24 saatlik kültüründen öze ile çizgi ekim yapılmıĢtır. Çizimler yapıldıktan sonra petriler 27ºC‘ de 7 gün inkübe edilmiĢtir. ġekil 3.7‘de görüldüğü gibi bakteri ile fungus arasında meydana gelen bariyer iki mikroorganizma arasında bir interaksiyon olduğunu göstermiĢ ve inhibasyon bölgesinin geniĢliği her iki koloni arasındaki en kısa mesafeden ölçülerek inhibisyon zonu (Engelleme zonu, Z1) olarak değerelendirilmiĢtir.

ġekil 3. 7. Bakteri ile patojen arasında meydana gelen inhibisyon zonu görünümü. a) Petrinin üst

yüzeyi ve b) Petrinin alt yüzeyini

Antibiyosis etkileĢimde biyoajanların fitopatojen fungus hifinin geliĢimini engellendiği bölgenin (inhibisyon zonu) çapı mm olarak ölçülerek, elde edilen değer aday biyoajanın antibiyosis etkinliğini belirlemede kullanılmıĢtır (Xiaoning ve ark., 2014).

Hiperparazitizm iliĢkide ise biyoajan kolonilerinin petrideki fitopatojen fungusun üzerini kapatma süresine bakılmıĢtır (Aydın ve Turhan, 2009).

Ayrıca, aday biyolojik mücadele elemanlarının S. sclerotiorum’u engelleme yüzdesi aĢağıdaki verilen Ghildiyal ve Pandey (2008)‘in belirttiği radyal geliĢmenin formülünden faydalanarak hesaplanmıĢtır:

Engelleme % = (r1 - r2/r1) × 100

Buna göre r1, antagonist organizma olmadan patojenin radyal büyümesini temsil ederken, r2 antagonist organizma ile patojenin radyal büyümesini temsil etmektedir (ġekil 3.8).

ġekil 3. 8. Aday biyolojik mücadele elemanı ve fitopatojen fungusun petri kabında karĢılaĢtırma

diyagramı. Engelleme zonu (Z1), patojenin radyal geliĢimi (r1) ve Patojen ile biyolojik ajanın radyal geliĢimi (r2) (Tozlu, 2003; Ghildiyal ve Pandey, 2008).

Ġzole edilen ümitvar fungusların fitopatojen fungus üzerine antifungal etkisini belirlemede yine ikili (dual) kültür tekniği kullanılmıĢ ve bunların 4 mm çapındaki misel diskleri PDA içeren petrilerde fitopatojen fungusla aralarında 5 cm uzaklık olacak Ģekilde karĢılıklı olarak yerleĢtirilerek inkubasyona bırakılmıĢtır.

Her bir muhtemel bioajan için 3'er petri kullanılmıĢ ve çalıĢma 2 tekerrürlü olarak yapılmıĢtır. Kontrol olarak sadece S. sclerotiorum izolatları antibiyotik içermeyen PDA besiyerlerine 2‘Ģer petriye olacak Ģekilde ekilmiĢtir.

Ayrıca ümitvar bioajan bakterilerin ve fungusların sklerotların canlılık oranları ve miselyum geliĢimine olan etkileri de belirlenmiĢtir. Uygulamada S. sclerotiorum‘un dinlenme yapısı olan sklerotlar kullanılmıĢtır. Bioajan bakteri izolatlarının uygulanmasında, bakteriler Nutrient agar (NA) besiyerine çizgi ekim yapılmıĢ, 27°C'de 48 saat inkubasyona bırakılmıĢtır. Fungal biyoajanlar ise PDA besi yerine ekim yapılmıĢ ve 25°C‘de bir hafta inkübe edilmiĢtir. Daha sonra petrilerde geliĢen bakteriyel kolonilerin ve fungal izolatların üzerine bir miktar steril su dökülerek cam bagetle yıkanmıĢtır. Elde edilen bakteriyel süspansiyon 108

hücre/ml (OD: 0,15, 660 nm) ve fungal süspansiyon (5x105

konidi/ml) sklerotlara inokulasyon için sprey edilmiĢtir (Tozlu, 2003). Sklerotlara inokule edilen biyoajan bakteri ve fungusların geliĢimi için, bir hafta süre ile 25°C'de karanlıkta inkübasyona bırakılmıĢtır. Daha sonra sklerotların PDA ortamına ekimi yapılmıĢ ve miselyum geliĢimi gözlenen sklerotlar kumpasla

ölçülmüĢtür (Onaran, 2009). Tüm in vitro denemeleri tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmuĢ olup, deneme 2 farklı zamanda tekrar edilmiĢtir.

8.2.8.4. Tütünde aĢırı duyarlılık (Hypersensitive Reaction-HR) testi

Biyoajan bakteri izolatlarının bitki patojeni olup olmadığının belirlenmesi amacı ile saflaĢtırılan izolatlarla tütünde aĢırı duyarlılık testi (Hypersensitive Reaction, HR) yapılmıĢtır. HR testinde 2 günlük bakteri kültürlerinin 108

hücre/ml (OD: 0,15, 660 nm)

yoğunluktaki süspansiyonu bir enjektör yardımı ile tütün yapraklarına infiltre edilmiĢtir. Negatif kontrol olarak yapraklara steril saf su inokule edilmiĢ, pozitif kontrol olarak ise fitopatojen bir bakteri kültürü kullanılmıĢtır. Ġnokulasyondan 2 gün sonra inokulasyon noktasında doku çökmelerine neden olan izolatlar HR (+) olarak kabul edilmiĢtir (Klement ve Goodman, 1967).

8.2.8.5. Bioajan fungus ve bakteri izolatlarının in vivo da etkinliklerinin belirlenmesi

Fungus ve bakterilerin in vitro Ģartlarda en etkili olan izolatlarının S. sclerotiorum’un iki izolatına karĢı etkinliği, Ġnegöl Alası ayçiceği çeĢidi kullanılarak test edilmiĢtir. Bu amaçla, S.Ü. Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü AraĢtırma ve Uygulama açık alanında saksı denemesi kurulmuĢtur. İn vitro Ģartları takiben etkili bulunan 5 bakteri ve 2 fungus izolatının S. sclerotiorum‘un iki izolatı üzerinde test edilmesi amacıyla tesadüf parselleri deneme desenine göre 4 tekerrürlü deneme kurulmuĢtur.

Seçilen biyolojik mücadele elemanı funguslar PDA‘da 250_{C‘de bir hafta} geliĢtirilmiĢ ve spor oluĢturmaları sağlanmıĢ, fungusun geliĢtiği PDA içeren petrilere steril su dökülerek cam pipetle fungus sporları toplanmıĢtır. OluĢan süspansiyon behere alınmıĢ sonra mikropipetle homojen olarak karıĢtırılmıĢ ve hemositometre (Thoma lamı) 5x105

ml spor konsatrasyonu olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. Fungal süspansiyonu uygularken sporların bitkiye yapıĢmasını sağlamak için süspansiyona Tween 20 ilave edilmiĢtir.

Nutrient agar besiyerine çizgi ekim yapılan biyoajan bakteriler ise 28˚C‘de 48 saat inkubasyona bırakılmıĢtır. GeliĢen bakteri kolonileri üzerine bir miktar steril su dökülmüĢ ve cam bagetle karıĢtırılmıĢtır. Elde edilen bakteriyel süspansiyonun

konsantrasyonu 108 hücre/ml‘ye ayarlanmıĢtır. Spektrofotometrik olarak süspansiyonun absorbansı 600 nm‘de 0.1 değerine ayarlanarak kullanılmıĢtır (ġekil 3.9).

ġekil 3. 9. Bakteri ve fungal süspansiyonun hazırlanması. a) Fungal solüsyon ve b) Bakteri solüsyonu

Bitkiler çiçeklenmenin baĢlangıcı R2 safhasına geldiği zaman (Nelson ve ark., 1988) uygulamaya baĢlanmıĢtır. Ġlk önce bitkinin toprak sathından 4 cm yukarıdaki gövdesine steril bistürü ile 5 mm çapında yara açılmıĢtır. Yaralı kısma 0,5x108 hücre/ml yoğunluğunda bakteri süpansiyonu veya 5x105

konidi/ml‘lik fungus süpansiyonu püskürtülmüĢtür (ġekil 3.10).

ġekil 3. 10. Bacillus ve Trichoderma süspansiyonlarının bitki üzerine inokule edilmesi. a) Bitki

gövdesine yara açılması ve b) Bakteri ve fungal süspansiyonun açılan yaraya sprey edilmesi

Uygulama sonrasında S. sclerotiorum‘un 4 mm çapındaki misel diski açılan yaraya yerleĢtirilmiĢ ve üzerine nemli pamuk konularak inokulasyon noktası parafilm ile sarılmıĢtır (ġekil 3.11). Kontrol bitkilerindeki uygulamada ise, gövdeye açılan

a b

yaraya su spreyle verilmiĢ ve sadece S. sclerotiorum 4 mm çapındaki misel diskleri yerleĢtirilmiĢtir (Tozlu, 2003).

ġekil 3. 11. Sclerotinia sclerotiorum‘un bitkiye inokule edilmesi a) PDA‘da geliĢtirilen S. sclerotiorum

misellerinden kesit alınması b) Biyoajan süspansiyonu sprey edilmiĢ bitkilere misellerin inokule edilmesi ve c) Bakteri ve fungal süspansiyonu ve miselyumla inokule edilen bitki gövdesinin parafilm ile sarılması

Ayrıca çalıĢmada test edilen her bir biyolojik mücadele elemanın bitki üzerinde herhangi bir olumsuz etki gösterip göstermediğini belirlemek amacıyla, inokulasyon öncesi bitki gövdesine yara açılmıĢ ve her bir biyojan süspansiyonu 2‘Ģer bitkiye sprey edilerek uygulanmıĢtır (ġekil 3.12).

ġekil 3. 12. Biyoajanların tek baĢına bitkiye püskürtülmesi

Saksılar bir hafta süresince açık alanda 20–25 ºC sıcaklık ve %70 nispi nem olacak Ģekilde destile su ile sulanmıĢtır. Gövde üzerinde oluĢan lezyonların boyu inokulasyondan 1 hafta sonra kumpasla ölçülmüĢtür.